鄧興梅，曹樹珠，郭 嘉，朱德馨，趙天藝，柴迎錦，張 偉，史 超，賈思鋒，張 輝，2，3

(1.石河子大學(xué)動物科技學(xué)院，石河子832000；2.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團動物疾病防控重點實驗室，石河子832000；3.石河子大學(xué) 動物健康養(yǎng)殖國際聯(lián)合研究中心，石河子832000；4.齊魯動物保健品有限公司，石河子832000)

布魯氏菌是一種兼性胞內(nèi)菌，進入吞噬與非吞噬細胞中可利用多種策略逃避宿主免疫系統(tǒng)持續(xù)性識別[1]，但宿主免疫系統(tǒng)依然可通過模式識別受體(PRRs)識別該病原并誘發(fā)先天性免疫應(yīng)答[2]。布魯氏菌感染可通過Toll樣受體識別激活NOD樣受體蛋白3(NLRP3)或細菌DNA激活黑色素瘤缺乏因子2(AIM2)炎癥小體[3]，炎癥小體受宿主免疫應(yīng)答信號通路的激活[4]，而激活的炎癥小體進一步激活細胞中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspases)，促進白細胞介素-1β(IL-1β)和IL-18產(chǎn)生并介導(dǎo)細胞焦亡發(fā)生，誘導(dǎo)和促進炎癥反應(yīng)的發(fā)生[5]。作為宿主先天性免疫機制之一，細胞焦亡(pyroptosis)是一種促炎形式的調(diào)節(jié)細胞程序性死亡(RCD)的方式，其特點是依賴Caspases蛋白酶，并伴有大量的促炎細胞因子IL-1β和IL-18的釋放。根據(jù)依賴半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶不同，細胞焦亡分為經(jīng)典細胞焦亡(Caspases-1)和非經(jīng)典細胞焦亡(人類Caspases-4/5，小鼠Caspases-11)[6]。Caspases在天冬氨酸(Asp)位點切割焦亡執(zhí)行蛋白(GSDMD)，使其暴露具有活性的GSDMD-N結(jié)構(gòu)域，GSDMD的N-端插入質(zhì)膜并形成大孔，破壞電化學(xué)梯度、細胞滲透壓，導(dǎo)致細胞腫脹、裂解，并釋放大量炎性因子[7]，細胞焦亡對于宿主防御和清除細菌感染至關(guān)重要[8]。

長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類長度超過200 nt的RNA分子，廣泛存在于哺乳動物細胞內(nèi),參與生理和病理過程，參與調(diào)控宿主先天性免疫反應(yīng)[9]。研究表明，lncRNA在表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控細胞焦亡相關(guān)基因的表達，參與細胞焦亡的調(diào)控[10]。目前l(fā)ncRNA調(diào)控細胞焦亡常見于人類疾病模型研究，如lncRNA Kcnq1ot1上調(diào)心肌細胞焦亡[11]、lncRNA GAS5抑制急性腎損傷中的細胞焦亡[12]。很多病原菌感染后可引起不同程度的細胞焦亡現(xiàn)象[13-14]；布魯氏菌感染可引發(fā)Caspase-1和Caspase-11依賴的細胞焦亡，lncRNA廣泛調(diào)控宿主先天性免疫反應(yīng)[15]。研究lncRNA是否參與調(diào)控布魯氏菌引起的細胞焦亡，有助于進一步闡明布魯氏菌感染宿主細胞抗菌機制?；谌双F共患病實驗室前期布魯氏菌侵染小鼠巨噬細胞RAW264.7篩選出差異表達的lncRNA Gm35082-202(未發(fā)表)，但Gm35082-202調(diào)控功能尚未見報道，本試驗首先在Ensemble數(shù)據(jù)庫中查找Gm35082-202在染色體上的位置及序列中外顯子等信息，預(yù)測并分析Gm35082-202亞細胞定位，通過實時熒光定量PCR檢測布魯氏菌侵染RAW264.7細胞不同時間點Gm35082-202表達趨勢，利用siRNA干擾方法檢測Gm35082-202對布魯氏菌引起的細胞焦亡的影響，以期為進一步探究布魯氏菌侵染時Gm35082-202參與調(diào)控宿主細胞焦亡的分子機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞、菌株 小鼠巨噬細胞RAW264.7、牛種布魯氏菌(S2308)均由新疆石河子大學(xué)動物疾病防控兵團重點實驗室保存。

1.1.2 主要試劑及儀器 大豆胰酶肉湯TSA或大豆胰酶肉湯瓊脂TSB培養(yǎng)基均購自O(shè)XOID公司；DMEM細胞培養(yǎng)液、胎牛血清均購自Gibco公司；Advanced系列轉(zhuǎn)染試劑購自Zeta Life公司；RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時熒光定量PCR染料均購自北京康為世紀生物科技有限公司；蛋白裂解液RIPA購自北京索萊寶科技有限公司；IL-1β、IL-18 ELISA檢測試劑盒均購自MolBio公司；一抗NLRP3(ab263899)、Caspase-1(ab179515)、Caspase-11(ab246496)均購自Abcam公司；二抗Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)購自Earthox公司；ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。

1.2 Gm35082-202基因結(jié)構(gòu)及生物信息學(xué)分析

在Ensemble數(shù)據(jù)庫(http:∥www.ensembl.org)中查找鼠源Gm35082-202，查看Gm35082-202在染色體位置、序列中外顯子等信息，下載Gm35082-202 cDNA序列；在RNAfold在線軟件(http:∥rna.tbi.nuivie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuit/RNAfold.cgi)中輸入Gm35082-202 cDNA序列，預(yù)測Gm35082-202二級結(jié)構(gòu)；基于Gm35082-202序列位置信息，找出lncRNA中點位置100 kb范圍內(nèi)最近的轉(zhuǎn)錄本對應(yīng)的基因作為靶標基因，對靶基因進行KEGG和GO富集分析。

1.3 siRNA與引物的設(shè)計及合成

根據(jù)Gm35082-202 cDNA序列(登錄號:ENSMUST00000208164.2)，由蘇州吉瑪基因有限公司設(shè)計并合成干擾片段，3條siRNAs序列見表1。根據(jù)GenBank中NLRP3、Caspase-1、Caspase-11、IL-1β、IL-18基因CDS區(qū)序列以及Gm35082-202 cDNA序列，用Primer 3 Plus在線軟件設(shè)計實時熒光定量PCR引物，引物信息見表2。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 Gm35082-202干擾片段序列

表2 引物信息

1.4 布魯氏菌侵染RAW264.7細胞對Gm35082-202表達量的影響

1.4.1 布魯氏菌侵染RAW264.7細胞 取出牛種布魯氏菌平板劃線接種于TSA固體培養(yǎng)基，4 d后挑單克隆接種至20 mL TSB培養(yǎng)液，37 ℃搖床180 r/min搖菌培養(yǎng)，當D600 nm值為0.8時，用50 mL無菌離心管收集菌體，5 000 r/min離心5 min，棄上清后，加入20 mL PBS渦旋洗滌菌體，重復(fù)3次，棄上清，加入5 mL PBS，渦旋混勻后用比濁儀測定細菌濃度。以2×105/孔將RAW264.7細胞接種于6孔板中，每孔加入含10% FBS的無抗性DMEM培養(yǎng)液，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。待細胞匯合度為80%時，隨機挑選3孔細胞，用紅細胞計數(shù)板計數(shù)，3孔細胞平均數(shù)作為侵染時每孔細胞數(shù)量；以感染復(fù)數(shù)(MOI)為0.01侵染RAW264.7細胞[16]，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育60 min，棄培養(yǎng)基，用PBS漂洗3次，每孔加入2 mL含50 IU慶大霉素的培養(yǎng)液繼續(xù)孵育45 min以殺死胞外菌，PBS漂洗3次，每孔加入2 mL完全培養(yǎng)液，此時為侵染計時起點(0 h)，分別在0、4、8、12、24、36、48 h收集細胞，每個時間點設(shè)置3孔重復(fù)。

1.4.2 實時熒光定量PCR檢測Gm35082-202表達量 以布魯氏菌侵染0 h組為對照組，實時熒光定量PCR方法檢測Gm35082-202表達量。Trizol法提取各時間點細胞總RNA并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以GAPDH為內(nèi)參基因進行實時熒光定量PCR。PCR反應(yīng)體系10 μL：cDNA 1 μL，2×SYBR Green Mix 5 μL，上、下游引物各0.2 μL，ddH2O補至10 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環(huán)。用2-△△Ct法計算各基因相對表達量。

1.5 Gm35082-202核質(zhì)分布檢測

1.5.1 Gm35082-202亞細胞定位 利用LncLocator網(wǎng)站(http:∥www.csbio.sjtu.edu.cn/ bioinf/lncLocator)預(yù)測Gm35082-202的亞細胞定位。

1.5.2 Gm35082-202的核質(zhì)分布 按照1.4.1方法進行布魯氏菌侵染RAW264.7細胞，在侵染的0、4、24、36和48 h收集細胞至1.5 mL離心管，1 000 r/min離心5 min。棄上清，加入0.8 mL DEPC-PBS重懸沉淀，1 000 r/min離心5 min，重復(fù)離心洗滌2次。加入0.5 mL 0.3% NP-40(DEPC配制)，重懸細胞沉淀后反復(fù)吹打，置冰上裂解20 min，1 000 r/min離心5 min，收集上清至另一個無RNA酶離心管，即為細胞質(zhì)RNA提取樣本。0.8 mL 0.1% NP-40重懸沉淀，緩慢吹打洗滌，1 000 r/min離心5 min，重復(fù)離心洗滌2次，棄上清，沉淀即為細胞核RNA提取樣本。按照1.4.2方法提取細胞質(zhì)及細胞核RNA并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以actin為細胞質(zhì)內(nèi)參基因，以U1為細胞核內(nèi)參基因[17]進行實時熒光定量PCR檢測Gm35082-202在核質(zhì)中的表達量。

1.6 干擾Gm35082-202對布魯氏菌引起的細胞焦亡的影響

1.6.1 Gm35082-202-siRNAs轉(zhuǎn)染RAW264.7細胞 按照Gm35082-202-siRNAs說明書轉(zhuǎn)染RAW264.7細胞，轉(zhuǎn)染后置37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。按照1.4.1方法用布魯氏菌侵染轉(zhuǎn)染Gm35082-202-siRNAs的RAW264.7細胞，侵染24 h后收集僅布魯氏菌侵染組(S2308)、布魯氏菌侵染后Gm35082-202-siRNAs干擾組細胞。按照1.4.2實時熒光定量PCR法檢測各組細胞中Gm35082-202表達量，篩選干擾效率最高的siRNA。

1.6.2 Gm35082-202對細胞焦亡相關(guān)基因表達的影響 Gm35082-202-siRNA、Gm35082-202-siRNA-NC轉(zhuǎn)染RAW264.7細胞24 h后，再用布魯氏菌侵染RAW264.7細胞，以PBS為空白對照組(PBS)，未干擾只用布魯氏菌侵染為侵染對照組(Bru)。侵染24 h后收集PBS組、Bru組、Gm35082-202-siRNA組(Bru-siRNA)、Gm35082-202-siRNA-NC組(Bru-NC)細胞，按照1.4.2實時熒光定量PCR法檢測各組細胞中NLRP3、Caspase-1、Caspase-11、IL-1β和IL-18基因的相對表達量。

1.6.3 Western blotting檢測NLRP3、Caspase-1及Caspase-11蛋白的表達量 收集1.6.2中各組細胞，每管加入200 μL蛋白裂解液并置于冰上裂解30 min，13 000 r/min離心10 min，留上清，BCA法測蛋白濃度并調(diào)至相同濃度，100 ℃煮樣10 min備用。制備12% SDS-PAGE膠，每孔上樣量50 μg,轉(zhuǎn)膜后用5%脫脂奶粉常溫封閉2 h，用一抗NLRP3 (1∶1 000)、Caspase-1 (1∶1 000)、Caspase-11 (1∶1 000)、β-actin(1∶1 000)室溫孵育1 h，二抗Goat Anti-Rabbit IgG(1∶10 000)室溫孵育1 h。ECL顯色并拍照。

1.6.4 ELISA檢測細胞因子IL-1β、IL-18分泌水平 收集1.6.2中各組細胞上清，按照ELISA試劑盒說明書檢測細胞因子IL-1β、IL-18分泌水平。

1.6.5 布魯氏菌胞內(nèi)生存能力檢測 按照1.6.2方法，在布魯氏菌侵染巨噬細胞24 h后，用0.2% Triton X-100裂解各組細胞釋放出胞內(nèi)菌，將裂解液10倍梯度稀釋后涂布布魯氏菌固體培養(yǎng)基，通過菌落計數(shù)，比較各組布魯氏菌胞內(nèi)的生存能力。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析

用Microsoft Excel對原始數(shù)據(jù)進行初步處理，用GraphPad Prism 5.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析(One-Way ANOVA)，組間差異采用t檢驗進行比較。結(jié)果用平均值±標準差表示。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 Gm35082-202基因結(jié)構(gòu)及生物信息學(xué)分析

2.1.1 Gm35082-202基因結(jié)構(gòu)及二級結(jié)構(gòu) lncRNA Gm35082-202位于小鼠7號染色體(Chr7:100 324 295～100 326 967)，大小為525 nt(Trianscript ID:ENSMUST00000208164.2)，包括2個外顯子(圖1A)。RNAfold在線軟件預(yù)測結(jié)果表明，Gm35082-202的二級結(jié)構(gòu)含有多個莖環(huán)及多分枝內(nèi)部環(huán)結(jié)構(gòu)(圖1B)。

A，lncRNA Gm35082-202基因結(jié)構(gòu)；B，lncRNA Gm35082-202二級結(jié)構(gòu)

2.1.2 Gm35082-202功能預(yù)測結(jié)果 KEGG信號通路富集分析表明，Gm35082-202主要參與NOD樣、鈣調(diào)節(jié)以及細胞因子信號通路的調(diào)控(表3)；GO功能富集分析結(jié)果顯示，Gm35082-202功能主要涉及DNA轉(zhuǎn)錄、線粒體組分以及金屬離子結(jié)合(表4)。

表3 Gm35082-202 KEGG信號通路富集分析結(jié)果

表4 Gm35082-202 GO功能富集分析結(jié)果

2.2 布魯氏菌侵染對Gm35082-202表達量的影響

由圖2可知，與布魯氏菌侵染0 h相比，布魯氏菌侵染4和8 h時Gm35082-202表達量顯著增加(P<0.05)，布魯氏菌侵染12、24、36和48 h時Gm35082-202表達量均極顯著增加(P<0.01)。

與0 h相比，*，差異顯著(P<0.05)；**，差異極顯著(P<0.01)；無*，差異不顯著(P>0.05)

2.3 Gm35082-202核質(zhì)分布檢測

Gm35082-202亞細胞定位預(yù)測結(jié)果表明，Gm35082-202主要分布于細胞核(58.3%)，其次是細胞質(zhì)(35.1%)(表5)。由圖3可知，布魯氏菌侵染0 h時Gm35082-202在細胞核中分布為63.4%；在侵染4、24和36 h時Gm35082-202在細胞核中的分布分別為24.5%、29.6%和30.4%。

表5 Gm35082-202亞細胞定位預(yù)測

圖3 Gm35082-202核質(zhì)分布結(jié)果

2.4 Gm35082-202干擾對布魯氏菌引起的細胞焦亡的影響

2.4.1 Gm35082-202干擾效率 由圖4可知，Gm35082-202-siRNA1、Gm35082-202-siRNA3均極顯著降低Gm35082-202的表達量(P<0.01)，Gm35082-202-siRNA1干擾效率最高。因此，后續(xù)驗證Gm35082-202調(diào)控宿主細胞焦亡功能用轉(zhuǎn)染Gm35082-202-siRNA1進行干擾。

肩標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；肩標不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)；肩標相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。下同

2.4.2 Gm35082-202對細胞焦亡相關(guān)基因表達的影響 由圖5可知，與Bru組相比，Bru-siRNA組NLRP3、Caspase-1和Caspase-11基因表達量均極顯著降低(P<0.01)。

圖5 不同處理組NLRP3、Caspase-1和Caspase-11基因的相對表達量

2.4.3 Gm35082-202對細胞焦亡相關(guān)蛋白表達的影響 由圖6可知，與Bru組相比，Bru-siRNA組中NLRP3、Caspase-11蛋白表達量顯著降低(P<0.05)，Caspase-1蛋白表達量極顯著降低(P<0.01)。

A，NLRP3、Caspase-1和Caspase-11蛋白Western blotting條帶；B～D，NLRP3、Caspase-1和Caspase-11蛋白灰度值

2.4.4 Gm35082-202對細胞炎性因子IL-1β和IL-18的表達量及分泌的影響 由圖7可知，與Bru組相比，Bru-siRNA組細胞中IL-1β和IL-18相對表達量極顯著低于布魯氏菌侵染組(P<0.01)；細胞上清中IL-1β、IL-18分泌水平均極顯著降低(P<0.01)。

A，實時熒光定量PCR檢測各組細胞中IL-1β和IL-18的相對表達量；B、C，ELISA檢測各組細胞上清中IL-1β和IL-18分泌水平

2.4.5 Gm35082-202對布魯氏菌胞內(nèi)生存能力的影響 由圖8可知，與Bru組相比，Bru-siRNA組胞內(nèi)布魯氏菌數(shù)顯著升高(P<0.05)。

圖8 布魯氏菌侵染巨噬細胞菌落計數(shù)結(jié)果

3 討 論

越來越多的研究表明，lncRNA在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用[9]，而lncRNA的亞細胞定位是其發(fā)揮生物學(xué)功能的基礎(chǔ)。lncRNA Neat1主要分布在細胞核，是細胞核旁斑主要組成部分，張鵬飛等[17]用脂多糖(LPS)或尼日利亞菌素刺激巨噬細胞時，發(fā)現(xiàn)lncRNA Neat1從核旁斑釋放至細胞質(zhì)內(nèi)，與Caspases-1蛋白P20結(jié)構(gòu)域互作，穩(wěn)定Caspases-1四聚體結(jié)構(gòu)，促進NLRP3、NOD樣受體蛋白4(NLRC4)和AIM2炎癥小體激活，增加炎癥體小體的組裝，促進Caspases-1依賴的細胞焦亡。本試驗結(jié)果表明，布魯氏菌感染0 h時，Gm35082-202主要分布于細胞核中，僅36.6%分布在細胞質(zhì)中，隨著布魯氏菌感染時間的延長，Gm35082-202在細胞中的分布由細胞核向細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移，Gm35082-202在細胞質(zhì)中的分布增加達到70%以上，這種核質(zhì)轉(zhuǎn)移現(xiàn)象說明布魯氏菌感染宿主時Gm35082-202可能在細胞質(zhì)中發(fā)揮重要的生物學(xué)調(diào)控功能。

細胞焦亡普遍存在于脊椎動物先天性免疫激活的過程，多發(fā)生于巨噬細胞、樹突狀細胞等先天性免疫細胞在病原感染所引起的炎癥反應(yīng)中[18-19]，可通過破壞病原微生物胞內(nèi)增殖的微環(huán)境或誘導(dǎo)細胞膜成孔來殺死、清除病原微生物[20]，而病原微生物亦通過調(diào)控宿主lncRNA的表達，影響宿主細胞先天性免疫應(yīng)答以及對病原微生物的殺傷和清除能力[21]。IFNG-AS1是免疫細胞上發(fā)現(xiàn)的早期lncRNA之一，在CD4+T細胞上通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子4(STAT4)和T-box轉(zhuǎn)錄因子21(TBX21)2個因子協(xié)同作用，在干擾素-γ(IFN-γ)的啟動子和內(nèi)含子區(qū)域誘導(dǎo)H3K4三甲基化促進IFN-γ轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)細胞分泌高濃度IFN-γ，提高宿主對沙門氏菌殺滅清除能力[22]。石河子大學(xué)動物科技學(xué)院人獸共患病實驗室前期通過對布魯氏菌感染不同時間段的巨噬細胞進行測序，經(jīng)過篩選證實lncRNA Gm28309可海綿吸附miR-3068-5p，促進p65抑制劑κB-Ras2降解，進而激活NF-κB信號通路，促進NLRP3炎癥小體的激活[23]。本試驗結(jié)果表明，布魯氏菌感染巨噬細胞，上調(diào)Gm35082-202表達，引起宿主細胞焦亡，當敲低Gm35082-202表達時，布魯氏菌侵染宿主細胞中NLRP3、Caspase-1和Caspase-11基因的表達量均下降，細胞上清中IL-1β和IL-18分泌水平降低，布魯氏菌胞內(nèi)復(fù)制能力增強，該結(jié)果提示Gm35082-202表達量下降時，布魯氏菌引起的細胞焦亡水平降低，布魯氏菌胞內(nèi)復(fù)制能力增強。本試驗證實Gm35082-202能夠促進布魯氏菌引起的宿主細胞焦亡，發(fā)揮抗菌抗感染功能。

目前已報道的lncRNA調(diào)控機制主要包括：作為誘餌分子，捕獲轉(zhuǎn)錄因子、RNA聚合酶Ⅱ；作為競爭內(nèi)源性RNA(ceRNA)結(jié)合微小RNA(miRNA)，與miRNA競爭靶基因結(jié)合位點；染色質(zhì)重塑，調(diào)控基因表達；招募蛋白質(zhì)，影響可變剪接、mRNA的穩(wěn)定性、翻譯過程；編碼功能性小肽[24]。通過miRBase和miRDB數(shù)據(jù)庫分析，并未發(fā)現(xiàn)與Gm35082-202結(jié)合的miRNA，因此排除Gm35082-202作為ceRNA調(diào)控巨噬細胞焦亡可能性，因而Gm35082-202調(diào)控細胞焦亡分子機制將是后續(xù)研究的重點方向。

4 結(jié) 論

布魯氏菌侵染巨噬細胞上調(diào)Gm35082-202表達量；干擾Gm35082-202表達后，細胞焦亡標志分子NLRP3、Caspase-1、Caspase-11表達量及細胞炎性因子IL-1β和IL-18分泌水平均下降，表明Gm35082-202表達量升高可促進布魯氏菌引起的細胞焦亡。布魯氏菌侵染后，Gm35082-202出現(xiàn)由細胞核向細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移現(xiàn)象。