曾越琰，李超越，任玉鵬，張煥容

(西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610041)

豬繁殖與呼吸障礙綜合征(PRRS)給全球養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，其中，高致病性豬繁殖與呼吸綜合征(Highly pathogenic PRRS，HP-PRRS)至今仍持續(xù)危害我國養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展.HP-PRRSV為引起HPPRRS的病原，HP-PRRSV基因組在非結(jié)構(gòu)蛋白2(Nsp2)的編碼區(qū)域存在1＋29個(gè)不連續(xù)的30個(gè)氨基酸缺失[1-2].PRRSV基因組的變異，導(dǎo)致出現(xiàn)新毒株，這種變異給建立特異的檢測方法帶來了挑戰(zhàn).

國內(nèi)很多學(xué)者建立了檢測HP-PRRSV的PCR或熒光PCR方法，如根據(jù)PRRSVNsp2基因建立了可區(qū)分普通PRRSV和HP-PRRSV的一步RT-PCR方法[3]，區(qū)分不同毒株的套式PCR方法[4]，可對HPPRRSV進(jìn)行高通量檢測的熒光定量RT-PCR[5]，區(qū)分HP-PRRSV JXA1-R、HP-PRRSV和C-PRRSV的多重PCR方法[6]，根據(jù)三種不同PRRSV株的Nsp2基因序列設(shè)計(jì)引物和TaqMan探針，建立同時(shí)檢測PRRSV、HP-PRRSV、NADC30的熒光定量PCR方法[6]等.這些方法各有優(yōu)點(diǎn)，但無法滿足臨床現(xiàn)場快速檢測.

即時(shí)檢測(Point of care testing，POCT)技術(shù)是近年來興起的一類新型快速檢測技術(shù)，特點(diǎn)在于不依賴實(shí)驗(yàn)室條件，操作簡單，設(shè)備便攜，特別適宜于病原的現(xiàn)場快速檢測.重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)(Recombinaseploymerase amplification，RPA)是即時(shí)檢測的代表之一，該技術(shù)以T4噬菌體DNA復(fù)制機(jī)制為基礎(chǔ)，檢測體系需要一種常溫下能工作的DNA聚合酶、一個(gè)噬菌體uvsX重組酶、一個(gè)單鏈DNA結(jié)合蛋白(gp32)，以及另外一個(gè)輔助uvsX重組酶的uvsY蛋白[7-8]，不依賴類似于PCR儀熱敏元件所提供的控溫系統(tǒng)，在常溫下10～20 min即可完成DNA的快速擴(kuò)增.該技術(shù)結(jié)合側(cè)流層析技術(shù)(Lateral Flow Immunoassay for Rapid Detection，Lateral Flow Dipstick，LFD)形成的RPA-LFD方法，將擴(kuò)增產(chǎn)物與緩沖液混合，插入LFD試紙條，5 min左右即可肉眼觀察到實(shí)驗(yàn)結(jié)果，無需凝膠電泳，就可直觀判定結(jié)果，且操作非常簡便，適用于現(xiàn)場快速檢測.

本研究以HP-PRRSVNsp2基因特有的序列為靶標(biāo)，設(shè)計(jì)出特異性引物與探針，建立一種現(xiàn)場快速檢測HP-PRRSV的RPA-LFD檢測技術(shù)，并對其特異性、靈敏性和穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)價(jià)，并與檢測HP-PRRSV的商品試劑盒進(jìn)行比較，從而為HP-PRRSV現(xiàn)場快速檢測提供一種可靠的方法.

1 材料與方法

1.1 材料

HP-PRRSV、PRRSV VR2332、PRRSV NADC30-like和豬瘟(Classic Swine Fever Virus，CSFV)的陽性核酸由四川省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心提供.豬流行性腹瀉(PEDV)DY株細(xì)胞毒、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、豬圓環(huán)2型病毒(PCV-2)、豬偽狂犬病毒(PRV)、豬鏈球菌SWUN112株(S.suis)、豬源大腸桿菌SWUN145株(E.coli)陽性核酸由西南民族大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存.

TwistAmp nfo、TwistAmp Basic試劑盒購自Twist DX公司；Milenia Genline HybriDetect(側(cè)流層析試紙條)購自德國Milenia Biotec公司；高致病性豬藍(lán)耳病病毒熒光PCR檢測試劑盒(PRRSV-M)購自上海恒雅生物科技有限公司；Gel Extraction kit(100)D2500-01膠回收試劑盒，Plasmid Mini kit I(100)質(zhì)粒提取試劑盒購自O(shè)MEGA公司；TRIzolTM試劑購自美國Thermo Fisher Scientific公司；克隆載體pMD19-T、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Takara公司；DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司.

從四川綿陽、西昌、廣元等地規(guī)?；B(yǎng)殖場疑似PRRSV感染的母豬無菌采集50份豬血清，置-80℃凍存?zhèn)溆?

1.2 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建與鑒定

以HP-PRRSV核酸為模板，擴(kuò)增其Nsp2基因的保守序列，引物序列為F:5′-TCCCGTGACTCAAGAGCCT-3′，R:5′-CCGACAGTTTCTTCCGAACC-3′.反應(yīng)條件94℃，5 min；94℃，30 s；56℃，30 s；72℃，45 s，35個(gè)循環(huán)；72℃，10 min，擴(kuò)增目的片段為504 bp.擴(kuò)增產(chǎn)物膠回收連接pMD19-T載體，克隆轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，提取質(zhì)粒，并將其命名為pMD19-TNsp2.經(jīng)PCR鑒定及重組質(zhì)粒測序鑒定正確后，利用核酸蛋白儀測定質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品濃度，根據(jù)公式計(jì)算拷貝數(shù):拷貝數(shù)(copies/μL)＝6.02×1023×質(zhì)粒濃度(ng/μL)×10-9/(質(zhì)粒堿基數(shù)×660).

1.3 RPA-LFD引物與探針的設(shè)計(jì)和篩選

根據(jù)NCBI登錄的PRRSV VR2332、HP-PRRSV和NADC30-Like多個(gè)毒株Nsp2基因序列(登錄號(hào)分別為，HP-PRRSV:EF112445.1、EF635006.1、KX9803 92.1、MN046234.1、MN642105.1、MN642103.1；NADC 30-likePRRSV:JN654459.1、KT945017.1、KT945018、KR706343.1、MG687491.1、MH651744.1；PRRSV VR2332:AY150564)，利用MegAlign軟件比對分析，根據(jù)Nsp2基因的缺失情況，按照RPA引物探針設(shè)計(jì)原則，使用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)4對引物和1條探針(表1)，下游引物需要在5′端添加生物素(Biotin)，探針的5′端添加FAM熒光標(biāo)記，探針的3′端添加C3-spacer，在距離探針5′端至少30 bp，距離3′端至少15bp處用[THF]取代其中一個(gè)堿基，引物和探針均由上海生工生物股份有限公司提供.

表1 RPA引物及探針Table 1 Primers and probe for RPA

采用TwistAmp Basic RPA試劑盒，按如下反應(yīng)體系:上下游引物各2.4 μL(0.42 pmol/μL)，Rehydration Buffer 29.5 μL，ddH20 12.2 μL，模板1 μL，MgOAc 2.5μL，在37℃條件下，反應(yīng)20 min，同時(shí)將表1設(shè)計(jì)的引物以HP-PRRSV cDNA為模板進(jìn)行RPA擴(kuò)增，擴(kuò)增完成后加入等體積的酚-氯仿進(jìn)行純化，瓊脂糖凝膠電泳觀察特異性目的片段擴(kuò)增情況，篩選出最佳引物，用于后續(xù)試驗(yàn).

1.4 RPA反應(yīng)條件的優(yōu)化

根據(jù)TwistAmp Basic RPA試劑盒說明書，按照50 μL反應(yīng)體系，將以下各組分加入試劑盒特定反應(yīng)管中.各組分具體為:上、下游引物各2.1 μL，探針0.6 μL，Rehydration buffer 29.5 μL，cDNA模板1 μL，ddH2O 12.2 μL，共47.5 μL，渦旋混勻后離心；再向特定反應(yīng)管中加入2.5 μL MgOAc溶液渦旋離心，立即放入恒溫水浴鍋(30℃、35℃、37℃、40℃、42℃)中反應(yīng)一定時(shí)間(10 min、15 min、20 min、25 min、30 min)，反應(yīng)結(jié)束立即置冰盒上終止反應(yīng).取5 μL反應(yīng)液混入70 μL running緩沖液中，渦旋混勻，將Milenia GenlineHybridetect試紙條插入液體中反應(yīng)5 min，觀察試紙條上是否出現(xiàn)相應(yīng)的條帶.

根據(jù)最佳反應(yīng)條件，進(jìn)一步對引物濃度(0.042、0.21、0.42、1.05、2.1 pmol/μL)和探針濃度(0.012、0.06、0.12、0.3、0.6 pmol/μL)進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化的標(biāo)準(zhǔn)為出現(xiàn)明顯的特異性條帶的最低引物濃度和探針濃度.

1.5 特異性試驗(yàn)

以HP-PRRSV、PRRSV VR2332、NADC30-like、PEDV、TGEV、PRV、PCV-2、CSFV、S.suis、E.coli的cDNA或DNA為模板，以最佳的反應(yīng)條件進(jìn)行RPA反應(yīng).同時(shí)，以ddH2O取代模板作陰性對照.取5 μL反應(yīng)液混入70 μL running緩沖液中，渦旋混勻，將Milenia Genline Hybridetect LFD試紙條插入液體中反應(yīng)5 min，觀察試紙條上是否出現(xiàn)條帶.

1.6 敏感性試驗(yàn)

質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍系列稀釋后(106拷貝/μL～100拷貝/μL)作為模板，以最佳的反應(yīng)條件進(jìn)行RPA反應(yīng)，確定RPA-LFD對質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的最小檢出量.同時(shí)利用商品化HP-PRRSV熒光PCR檢測試劑盒檢測，對比分析兩種方法的檢測結(jié)果.商品化檢測試劑盒判斷標(biāo)準(zhǔn)為:陽性:檢測通道Ct值≤35，曲線具有明顯的指數(shù)增長曲線；可疑:檢測通道35＜Ct值≤38，建議重復(fù)檢測，如果檢測通道仍為35＜Ct值≤38，且曲線有明顯的增長曲線，判定為陽性，否則為陰性；陰性:樣本檢測結(jié)果Ct值＞38或無Ct值.

1.7 重復(fù)性試驗(yàn)

以106拷貝/μL、103拷貝/μL、101拷貝/μL 3個(gè)濃度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板，每個(gè)濃度重復(fù)3次檢測，分別進(jìn)行批間與批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)，以確定此方法的重復(fù)性.

1.8 臨床樣品檢測

無菌采集50份臨床疑似PRRSV感染豬的前腔靜脈血，裝入EP管，室溫靜置1～2 h，2 000 r/min離心10 min，取上清.利用建立的RPA-LFD方法對50份豬血清樣品cDNA進(jìn)行檢測，分析該方法在臨床上應(yīng)用的可行性.此外，使用商品化HP-PRRSV熒光PCR檢測試劑盒對相同樣品進(jìn)行檢測，對兩種方法的檢測結(jié)果進(jìn)行比較分析.

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建與鑒定

HP-PRRSVNsp2基因擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示，在約500 bp處出現(xiàn)特異性條帶，擴(kuò)增條帶與預(yù)期的目的片段大小一致，陰性對照無擴(kuò)增(圖1).重組質(zhì)粒pMD-19T-Nsp2質(zhì)粒濃度為141.9 ng/μL，質(zhì)粒堿基數(shù)3 196 bp，計(jì)算拷貝數(shù)為4.05×1010拷貝/μL，該濃度質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品可用于所建立方法的敏感性檢測.

圖1 PRRSV Nsp2基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果M:DL 2000分子量標(biāo)準(zhǔn)；1:HP-PRRSV Nsp2擴(kuò)增產(chǎn)物；2:陰性對照Fig.1 Electrophoresis result of PRRSV Nsp2 geneM:DL 2000 Marker；1:HP-PRRSV Nsp2 gene；2:Negative control

2.2 引物篩選結(jié)果

經(jīng)初步RPA反應(yīng)，電泳結(jié)果如圖2所示，引物1F1R擴(kuò)增的條帶與目的片段大小一致，條帶亮度強(qiáng)，引物2F2R未擴(kuò)增出目的條帶，引物3F3R擴(kuò)增條帶與目的條帶基本一致，但條帶亮度相對較弱，引物4F4R未擴(kuò)增出目的條帶，所以最終確定1F1R為最佳引物，篩選出的HP-PRRSV RPA-LFD引物序列為F:5′-TTCATCACCGTGAGAGGTTAAATTCCGTAC-3′，R:5′-Biotion-TGTCCACCGCGGGTAGCTTTTGACCCAA GC-3′，探 針 序 列 為:5′-FAM-TGTCCACTGGACTTGGCCCGCGACCCGTGCT[THF]CCGAGCGGGCTCGACGC3spacer-3′.

圖2 PRRSV RPA引物篩選M:DL 2000分子量標(biāo)準(zhǔn)；1:1F1R引物對擴(kuò)增產(chǎn)物；2:2F2R引物對擴(kuò)增產(chǎn)物；3:3F3R引物對擴(kuò)增產(chǎn)物；4:4F4R引物對擴(kuò)增產(chǎn)物；5:陰性對照Fig.2 PRRSV RPA primer screeningM:DL 2000 Marker；1:1F1R；2:2F2R；3F3R；4:4F4R，5:Negative

2.3 反應(yīng)條件的優(yōu)化結(jié)果

反應(yīng)時(shí)間優(yōu)化結(jié)果表明，反應(yīng)10 min的產(chǎn)物，LFD檢測即出現(xiàn)條帶，隨著反應(yīng)時(shí)間延長，LFD上條帶顏色逐漸加深.反應(yīng)時(shí)間在20 min，LFD條帶顏色深淺與25 min和30 min一致，表明其最佳反應(yīng)時(shí)間為20 min.反應(yīng)溫度為37℃時(shí)，檢測線和控制線條帶均最明顯，最佳反應(yīng)溫度為37℃；引物及探針的濃度分別為0.42 pmol/μL(2.1 μL)、0.3 pmol/μL(0.6 μL)時(shí)，LFD試紙條上的特異性擴(kuò)增條帶最清晰，如圖3所示.綜上，該RPA-LFD的最佳反應(yīng)時(shí)間為20 min，最佳反應(yīng)溫度為37℃，最佳引物和探針濃度分別為0.42、0.3 pmol/μL.

圖3 RPA-LFD反應(yīng)條件優(yōu)化結(jié)果Fig.3 Optimization results of RPA-LFD reaction conditions

2.4 特異性

用本試驗(yàn)建立的HP-PRRSV RPA-LFD方法對包括HP-PRRSV、PRRSV VR2332和NADC30-like毒株在內(nèi)的10種病原進(jìn)行檢測，結(jié)果只有HP-PRRSV的試紙條上同時(shí)出現(xiàn)檢測線和質(zhì)控線，PRRSV VR2332、NADC30-like、PEDV、TGEV、PRV、PCV-2、CSFV、S.suis、E.coil及陰性對照只出現(xiàn)質(zhì)控線(圖4).表明本試驗(yàn)建立的HP-PRRSV RPA-LFD方法特異性好.

圖4 HP-PRRSV RPA-LFD特異性試驗(yàn)結(jié)果Fig.4 Specificity of the RPA-LFD for HP-PRRSV

2.5 敏感性

以4.05×106拷貝/μL～4.05×100拷貝/μL的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板進(jìn)行RPA-LFD和試劑盒的敏感性檢測，結(jié)果顯示RPA-LFD和試劑盒的最低檢測限均為4.05×101拷貝/μL(圖5和表2).表明該方法靈敏性高.

表2 RPA-LFD方法和商試劑盒敏感性檢測結(jié)果Table 2 RPA-LFD method and commercial kit sensitivity test results

圖5 RPA-LFD敏感性試驗(yàn)結(jié)果Fig.5 Sensitivity results of RPA-LFD

2.6 重復(fù)性

批間重復(fù)試驗(yàn)和批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好(圖6和圖7).

圖6 RPA-LFD批間重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果Fig.6 RPA-LFD inter-batch repeat test results

圖7 RPA-LFD批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果Fig.7 RPA-LFD intra-batch repeat test results

2.7 臨床樣品檢測結(jié)果

50份血清進(jìn)行RPA-LFD和商品試劑盒檢測，結(jié)果表明兩種方法均檢出對應(yīng)的22份陽性樣品，28份陰性樣品，所建立的RPA-LFD方法與商品試劑盒陰陽性符合率均為100%(表3).表明該方法可以用于現(xiàn)場檢測.

表3 RPA-LFD與商品試劑盒臨床樣品檢測Table 3 RPA-LFD and commercial kit clinical sample testing

3 討論

為現(xiàn)場快速診斷HP-PRRS，本研究以HPPRRSVNsp2基因特有序列為靶標(biāo)設(shè)計(jì)的特異性引物及探針，靶向HP-PRRSV，建立了一種即時(shí)快速檢測的HP-PRRSV RPA-LFD方法.該方法對包括PRRSV VR2332和NADC-30like毒株在內(nèi)的9種常見感染豬的病原均不檢出，表明本研究建立的HP-PRRSV RPA-LFD方法具有良好的特異性.該方法在37℃條件下反應(yīng)20 min的產(chǎn)物取5 μL與專屬緩沖液混勻后插入LFD試紙條，經(jīng)5 min即可肉眼觀察到結(jié)果，與馬國和，彭遙等研究報(bào)道的反應(yīng)條件基本一致[9-10]，表明該方法易標(biāo)準(zhǔn)化.

目前RPA在細(xì)菌，病毒，支原體和寄生蟲等領(lǐng)域均有應(yīng)用.Li等建立了一種快速檢測食品中沙門菌的RPA-LFD方法，在37℃下反應(yīng)10 min即可檢測，且最低檢測限度為1.29×101CFU/mL[11].Wang等建立的犬瘟熱病毒RT-RPA方法，在40℃條件下，反應(yīng)3～12 min即可獲得結(jié)果，最低檢測限可至31.8拷貝[12].王建昌建立了非洲豬瘟的basic-RPA檢測方法，在38℃水浴鍋中恒溫反應(yīng)30 min，即可實(shí)現(xiàn)對目的片段的有效擴(kuò)增，該方法的檢測限達(dá)到102拷貝，同世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)推薦的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測限一致，但比OIE推薦方法的檢測限高10倍[13].綜上，應(yīng)用RPA建立的即時(shí)檢測方法在保證準(zhǔn)確性的同時(shí)，兼?zhèn)淞己玫撵`敏性，具有很大的應(yīng)用價(jià)值.本研究建立的檢測方法在此基礎(chǔ)上還保證了良好的特異性，為HP-PRRS的診斷提供了快速、敏感、特異且能滿足臨床現(xiàn)場檢測需求的新方法.

基于RPA原理常見的檢測方法主要有basic-RPA，熒光定量RPA和RPA-LFD，3種RPA都具有靈敏度高，反應(yīng)迅速，特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn).basic-RPA檢測速度比普通PCR快3～5倍，且靈敏度比普通PCR高10～100倍.但basic-RPA反應(yīng)產(chǎn)物需純化后用瓊脂糖凝膠電泳檢測[14].實(shí)時(shí)熒光定量RPA相比于basic-RPA，其反應(yīng)體系中增加了核酸外切酶III(endonuclease III，即exo)和帶有exo酶的探針，檢測成本高于basic-RPA，且需要昂貴的熒光定量PCR儀，對操作人員的要求也較高.RPA-LFD是在basic-RPA基礎(chǔ)反應(yīng)體系中增加核酸外切酶Ⅳ(endonucleaseⅣ，即nfo)和帶有nfo酶的探針，且在下游引物的5′端標(biāo)記生物素，通過LFD試紙條上抗生物素抗體捕獲擴(kuò)增產(chǎn)物的方式實(shí)現(xiàn)可視化即時(shí)檢測，不依賴于專業(yè)實(shí)驗(yàn)室和專用設(shè)備，但需購買商品化的LFD試紙條，增加了檢測成本.

目前仍沒有專門設(shè)計(jì)RPA引物和探針的軟件，且其引物和探針更長，其設(shè)計(jì)的難度比實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物和探針設(shè)計(jì)大.RPA是近年新出現(xiàn)的即時(shí)檢測技術(shù)，雖在病毒、細(xì)菌、寄生蟲等病原的檢測中均有應(yīng)用，但不如PCR等常規(guī)技術(shù)應(yīng)用廣泛，且成本較高.為降低檢測成本，于博[15]等在建立布魯氏菌RPA-LFD檢測方法時(shí)，將試劑盒推薦的50 μL反應(yīng)體系減半至25 μL，其研究結(jié)果表明體系減半不影響試驗(yàn)結(jié)果，反而有效降低了方法的成本.本研究也嘗試將體系減半，檢測結(jié)果與試劑盒推薦的50 μL反應(yīng)檢測結(jié)果一致.未來，亟需降低RPA成本及開發(fā)RPA引物設(shè)計(jì)軟件，滿足生產(chǎn)應(yīng)用上便捷、經(jīng)濟(jì)的需求，使其能普及和服務(wù)于生產(chǎn).