王斌華，吳新貴，劉學(xué)謙，潘 劍

（廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧 530021）

急性腦梗死（acute cerebral infarction，ACI）是我國(guó)最常見(jiàn)的一種腦血管疾病，且其發(fā)病率、致殘率、致死率較高，據(jù)中國(guó)國(guó)家腦卒中篩查數(shù)據(jù)顯示，我國(guó)40～74 歲人群首次急性腦梗死標(biāo)化發(fā)病率由2002年的189/10萬(wàn)上升到2013年的379/10萬(wàn)，平均年增長(zhǎng)8.3%[1]，嚴(yán)重危害人們的勞動(dòng)能力和生活質(zhì)量[2]。腦梗死可歸納于中醫(yī)“卒中”或“中風(fēng)”范疇。中國(guó)很早就有使用針灸療法來(lái)治療卒中的記載，最早可見(jiàn)于《黃帝內(nèi)經(jīng)》，如《靈樞·熱病》：“偏枯，身偏不用而痛……巨針取之，益其不足，損其有余，乃可復(fù)也”。其后的《針灸甲乙經(jīng)》及《針灸大成》也有針灸治療卒中的描述，《針灸甲乙經(jīng)》：“偏枯，四肢不用，善驚，大巨主之”；《針灸大成卷五·八脈圖》：“中風(fēng)偏枯，疼痛無(wú)時(shí)：絕骨、太淵、曲池、肩髃、三里、昆侖”等。電針療法是現(xiàn)代技術(shù)與傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)相結(jié)合的產(chǎn)物，操作時(shí)將針刺入穴位獲得針感后，在毫針針柄上接通電針儀上的電線(xiàn)，利用針刺和脈沖電刺激相結(jié)合以防治疾病的方法。此療法的優(yōu)點(diǎn)就是能代替人工操作，節(jié)省人力，又能控制刺激量。接通電流后逐漸調(diào)整電流大小，調(diào)節(jié)到患者能耐受的程度。電針有止痛、鎮(zhèn)靜、促進(jìn)氣血循環(huán)、調(diào)整肌張力等作用，電針療法已被廣泛的應(yīng)用于臨床中。大量的臨床研究和基礎(chǔ)研究[3-4]都證實(shí)電針療法是針對(duì)腦梗死安全、有效、可行的治療方法。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)[5-6]，電針能夠改善腦梗死大鼠肢體運(yùn)動(dòng)功能、促進(jìn)腦梗死大鼠腦梗死區(qū)及梗死對(duì)側(cè)大腦生長(zhǎng)相關(guān)蛋白GAP-43（growth associated protein-43）的表達(dá)，減輕腦梗死雙側(cè)神經(jīng)細(xì)胞的損傷。

尼氏小體是僅存在于神經(jīng)元細(xì)胞胞體中及樹(shù)突內(nèi)的一種顆粒，它的數(shù)量及形態(tài)與神經(jīng)元受損傷程度成正比，因此常被用來(lái)作為評(píng)價(jià)神經(jīng)元功能正常與否的指標(biāo)。課題組前期研究還發(fā)現(xiàn)，電針可以促進(jìn)局灶性腦梗死大鼠梗死對(duì)側(cè)的尼氏小體增加，進(jìn)而使局灶性腦梗死大鼠運(yùn)動(dòng)功能得到恢復(fù)[7]。大腦中動(dòng)脈梗塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）大鼠梗死側(cè)大腦皮層的梗死體積及尼氏小體數(shù)量的增減變化與腦梗死后運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)有何聯(lián)系，以及電針干預(yù)對(duì)這種聯(lián)系的影響如何，未見(jiàn)相關(guān)研究。本實(shí)驗(yàn)選取“內(nèi)關(guān)”、“足三里”兩穴進(jìn)行電針干預(yù)，觀(guān)察MCAO大鼠梗死側(cè)大腦皮層的神經(jīng)細(xì)胞尼氏小體的增減變化、腦梗死體積及其與腦梗死后運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)之間的關(guān)系，為臨床運(yùn)用電針治療腦梗死提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

使用健康的成年雄性SPF級(jí)SD（Sprague-Dawley，SD）大鼠54只，體重240～300 g，大鼠年齡在7～8周之間（合格證號(hào)：SCXK桂2020-0003），由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。每籠飼養(yǎng)6 只大鼠，飼養(yǎng)1周，期間自由進(jìn)食飲水，采用顆粒型普通大鼠飼料喂養(yǎng)，術(shù)前禁食不禁水12 h。將54 只SD 大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（n=18）和手術(shù)組（n=36），手術(shù)組制備MCAO 模型，模型制備成功后，將符合標(biāo)準(zhǔn)的大鼠隨機(jī)分為模型組和電針組，每組18只。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

2%TTC 染色液（中國(guó)武漢賽維爾科技有限公司）；醫(yī)用華佗牌毫針0.3 mm×13 mm、電子針灸治療儀（中國(guó)江蘇蘇州醫(yī)療用品廠(chǎng)有限公司）；尼氏染色液（中國(guó)武漢賽維爾科技有限公司）；4%多聚甲醛緩沖液（中國(guó)廣西北一生物科技有限公司）；手術(shù)器械（中國(guó)上海醫(yī)療器械有限公司）；線(xiàn)栓（中國(guó)廣州佳靈生物技術(shù)有限公司）；3.0縫合線(xiàn)及縫合針（中國(guó)廣西北一生物科技有限公司）。

1.3 MCAO模型造模方法

采用Zea 等[8]改良線(xiàn)栓法制備大鼠右側(cè)MCAO模型。術(shù)前12 h 禁食不禁水，以10%水合氯醛（0.35 mL/100 g）對(duì)大鼠進(jìn)行腹腔麻醉，待大鼠完全麻醉后，仰臥固定，行頸外側(cè)切口，鈍性分離肌肉及筋膜，暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈（CCA）、右側(cè)頸外動(dòng)脈（ECA）和右側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈（ICA），用3.0的縫合線(xiàn)扎緊CCA 和ECA，在ICA 近CCA 的分叉處備線(xiàn)，在距CCA 分叉3～5 mm 處用眼科剪剪一小口，然后將線(xiàn)栓緩緩經(jīng)CCA 插入ICA，當(dāng)線(xiàn)端插入ICA 約1.7～2.1 cm（線(xiàn)栓上有一黑點(diǎn)，黑點(diǎn)到分叉即可）時(shí)，收緊備線(xiàn)，剪去線(xiàn)栓多余末端，常規(guī)用碘伏消毒，縫合頸部皮膚，待大鼠完全清醒后放回籠中，自由進(jìn)食飲水。MCAO大鼠模型制備成功與否的判定參考Bederson 等[9]4分5級(jí)法，即待大鼠麻醉清醒后，在24 h 內(nèi)有：（1）大鼠左側(cè)的上下肢肢體受痛刺激后，肢體不能正常收縮；（2）大鼠不能走直線(xiàn)，并且身體向左傾倒或者向左側(cè)轉(zhuǎn)圓圈；（3）提住大鼠尾巴末端時(shí)，左上肢屈曲，不能向前伸直；普遍認(rèn)為只要大鼠具備以上兩條癥狀表現(xiàn)時(shí)，則表明成功制備了MCAO大鼠模型。

1.4 電針治療方法

造模成功24 h后開(kāi)始對(duì)大鼠進(jìn)行電針治療，取穴：參照華興邦等[10]編制的《大鼠穴位圖譜的研制》定位“內(nèi)關(guān)”、“足三里”兩穴位，具體為取俯臥位固定大鼠，定位大鼠雙側(cè)上肢的“內(nèi)關(guān)”穴（前肢內(nèi)側(cè)，離腕關(guān)節(jié)約3 mm 左右的尺橈骨縫間），雙側(cè)下肢“足三里”穴（膝關(guān)節(jié)后外側(cè)，在腓骨小頭下約5 mm處）。以28 號(hào)0.5 寸無(wú)菌針灸針（13 mm×25 mm）快速直刺入穴位皮膚表層后放手，“內(nèi)關(guān)”穴約刺入3 mm，而“足三里”穴刺入深度約為5 mm。腦梗死電針治療組雙側(cè)“內(nèi)關(guān)”穴及“足三里”穴分別接入電子針灸治療儀（蘇州醫(yī)療用品有限公司），波形采用疏密波，電流1 mA，刺激頻率為2/15 Hz，以大鼠肌肉輕微抖動(dòng)，不嘶叫為度。療程：每日治療1 次，每次留針20 min，分別治療3 d、7 d、14 d后取材。假手術(shù)組與模型組不給予任何干預(yù)措施。

1.5 觀(guān)察指標(biāo)

1.5.1 大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分 由同一名熟練掌握改良版大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分的技術(shù)員分別對(duì)造模成功3 d、7 d、14 d 的大鼠進(jìn)行評(píng)分，主要評(píng)分包括提尾實(shí)驗(yàn)（0～3 分），感覺(jué)實(shí)驗(yàn)（0～2 分）、行走實(shí)驗(yàn)（0～3分）、平衡木實(shí)驗(yàn)（0～6分）及反射和異常活動(dòng)實(shí)驗(yàn)（0～4分），共18分，正常SD大鼠為0分，神經(jīng)功能缺損評(píng)分在1～6 分為輕度損傷，7～12 分為中度損傷，13～18 分為重度損傷，評(píng)分越低，代表神經(jīng)功能缺損程度越輕[11]。

1.5.2 TTC 染色技術(shù)檢測(cè)腦梗死體積 TTC 染色能夠既直觀(guān)又客觀(guān)的顯示大鼠腦梗死后腦組織的梗死體積，是用來(lái)評(píng)價(jià)腦缺血損傷程度的常用指標(biāo)。正常腦組織會(huì)被染成鮮紅色，而梗死灶區(qū)域腦組織被染成蒼白色。各組在腦梗手術(shù)后3 d、7 d、14 d分別隨機(jī)抽取大鼠3只，以10%水合氯醛（0.35 mL/100 g）腹腔注射完全麻醉大鼠后迅速開(kāi)顱取腦，取出的大腦在-4 ℃的冰箱凍存20 min后，放置在冰面上用刀片垂直切除小腦、嗅球，然后從額極始沿冠狀面垂直將大腦分別切成約2 mm 厚的腦片，切完共6片，以備TTC染色。

1.5.3 尼氏染色觀(guān)察腦組織形態(tài) 尼氏小體是僅存在于神經(jīng)元胞體內(nèi)的嗜堿性顆粒群，它和神經(jīng)元的功能極為密切，當(dāng)各種誘發(fā)因素導(dǎo)致神經(jīng)元受損害變性時(shí)，尼氏小體顆粒可出現(xiàn)數(shù)量及位置的變化，呈明顯的溶解或消失。損害消失時(shí)，尼氏小體可恢復(fù)正常，這說(shuō)明尼氏小體與神經(jīng)損害密切相關(guān)，因此尼氏小體結(jié)構(gòu)的變化可作為神經(jīng)元受損的標(biāo)志。各組在術(shù)后3 d、7 d、14 d時(shí)分別隨機(jī)抽取大鼠3 只，以10%水合氯醛（0.35 mL/100 g）腹腔注射完全麻醉大鼠后，將針從心尖插入至升主動(dòng)脈，灌注約100 mL 生理鹽水，使大鼠全身血液排盡，改用冷的4%多聚甲醛約100 mL灌注固定腦組織?？焖贁囝^取腦，將取出的腦組織置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h后，進(jìn)行脫水、透明、浸蠟、包埋，冠狀連續(xù)切片，隨后行尼氏染色，最后在光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察梗死側(cè)大腦皮層運(yùn)動(dòng)區(qū)的病理形態(tài)變化。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 26.0 版軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）描述，當(dāng)滿(mǎn)足正態(tài)分布和方差齊性時(shí)，兩組比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組比較用單因素方差分析；若資料不符合正態(tài)分布且方差不齊時(shí)，則采用非參數(shù)檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料采用百分比或率來(lái)描述，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分

術(shù)后3 d，電針組、模型組的神經(jīng)缺損評(píng)分最高，在7 d、14 d 時(shí)，模型組和電針組的神經(jīng)功能缺損評(píng)分均呈下降的趨勢(shì)。與假手術(shù)組比較，模型組和電針組在不同時(shí)間點(diǎn)的神經(jīng)功能缺損評(píng)分均有顯著的提高（均P＜0.05）；與模型組相比，電針組3 d，7 d神經(jīng)功能缺損評(píng)分無(wú)明顯差異（P＞0.05），電針組14 d 的神經(jīng)功能缺損評(píng)分則有明顯的降低（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分比較

表1 不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分比較

與假手術(shù)組同一時(shí)間點(diǎn)比較，*P＜0.05；與模型組同一時(shí)間點(diǎn)相比，△P＜0.05。

2.2 大鼠腦梗死體積

電針組大鼠腦組織經(jīng)TTC染色后，大腦皮層非梗死區(qū)域腦組織染色呈鮮紅色，梗死區(qū)域腦組織染色呈蒼白色，且梗死灶多分布于皮層感覺(jué)運(yùn)動(dòng)區(qū)；在3 d 時(shí)，電針組與模型組腦梗死體積變化差異不顯著（P＞0.05），而電針組7 d 和14 d 的腦梗死體積相較于模型組則有明顯的減小（P＜0.05），見(jiàn)圖1、圖2。

圖1 TTC染色大鼠電針不同時(shí)間點(diǎn)腦梗死體積

圖2 不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠腦梗體積百分比

2.3 大鼠腦組織形態(tài)學(xué)改變

模型組、電針組不同時(shí)間點(diǎn)大鼠大腦皮層腦組織經(jīng)尼氏染色后，模型組與電針組的神經(jīng)細(xì)胞在術(shù)后3 d均嚴(yán)重腫脹變形，核周的尼氏小體數(shù)量減少，大量神經(jīng)元細(xì)胞破碎，胞核分離，模型組與電針組腦組織形態(tài)學(xué)改變相似；術(shù)后7 d，模型組和電針組的神經(jīng)細(xì)胞仍有破碎，細(xì)胞腫脹變形，但兩組均出現(xiàn)少量尼氏小體，且電針組尼氏小體數(shù)量較模型組多。術(shù)后14 d，模型組與電針組尼氏小體數(shù)量增多，神經(jīng)元細(xì)胞輕度腫脹，胞核完整，且與模型組相比，電針組神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)較完整，尼氏小體細(xì)胞排列較密集，呈片狀分布，見(jiàn)圖3。

圖3 不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠梗死側(cè)腦組織尼氏染色（×400）

3 討論

缺血性腦卒中系由各種原因所致的局部腦組織區(qū)域血液供應(yīng)障礙，導(dǎo)致腦組織缺血缺氧性病變壞死，進(jìn)而產(chǎn)生臨床上對(duì)應(yīng)的神經(jīng)功能缺失表現(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)采取線(xiàn)栓法制備MCAO模型大鼠，最終使線(xiàn)栓阻斷大腦中動(dòng)脈的起始端，進(jìn)而阻斷大腦中動(dòng)脈的血流供應(yīng)，造成局灶性腦缺血模型，模擬人體大腦中動(dòng)脈阻塞型腦缺血過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn)，大腦缺血缺氧之后會(huì)激活缺氧誘導(dǎo)因子（hypoxia inducible factor，HIF）和蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）表達(dá)，兩種蛋白被激活后可分別誘導(dǎo)下游的蛋白反應(yīng)，最終激活細(xì)胞的自噬功能，從而清除受損的細(xì)胞來(lái)維持正常細(xì)胞的功能，自噬和凋亡同時(shí)發(fā)生，加速細(xì)胞死亡，減小缺血半暗帶的面積，進(jìn)而使腦缺血后大腦皮層的梗死體積增大[12]。

本研究中，電針組7 d、14 d 的腦梗體積與模型組相比有明顯的減少，且電針組在7 d、14 d 時(shí)尼氏小體數(shù)量較模型組有明顯增加，損傷程度較模型組輕，尼氏小體形態(tài)也較為完整，排列較模型組密集。同時(shí)電針組神經(jīng)缺損評(píng)分在7 d、14 d與模型組相比，下降幅度較大。此時(shí)在微觀(guān)層面中，電針組尼氏小體增加數(shù)量也是多于模型組，形態(tài)較完整，排列較緊密，提示電針可以增加腦梗死缺血側(cè)大腦皮層的尼氏小體數(shù)量，保持其細(xì)胞形態(tài)的完整，進(jìn)而對(duì)腦梗后大鼠運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)有促進(jìn)作用。內(nèi)關(guān)為心包經(jīng)絡(luò)穴，心主神明，心包為心的護(hù)衛(wèi)，代君行令，取內(nèi)關(guān)穴可通竅醒神；心主血脈，取內(nèi)關(guān)穴可通血脈行氣血。足三里為陽(yáng)明經(jīng)穴、胃的下合穴，陽(yáng)明經(jīng)為多氣多血之經(jīng)，陽(yáng)明經(jīng)氣血通暢，正氣得以扶助，才能使機(jī)體功能逐漸恢復(fù)[13]。兩穴相配，可起到活血化瘀，舒腦通絡(luò)的作用，減輕腦梗死帶來(lái)的損害，促進(jìn)腦梗死后肢體功能恢復(fù)。

本次實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，電針“內(nèi)關(guān)”、“足三里”可以減小MCAO大鼠梗死側(cè)大腦皮層的梗死體積，縮短尼氏小體恢復(fù)時(shí)間，促進(jìn)梗死側(cè)大腦皮層尼氏小體數(shù)量的增加，初步證實(shí)隨著梗死側(cè)大腦皮層尼氏小體的增加，MCAO 大鼠的運(yùn)動(dòng)功能會(huì)逐步恢復(fù)。然而，由于本課題研究方法和指標(biāo)局限，樣本量不足，干預(yù)周期短，且急性腦梗死機(jī)制復(fù)雜，影響神經(jīng)可塑性的因素較繁雜，不能全面的闡述電針治療急性腦梗死的發(fā)生機(jī)制與作用。將來(lái)在人員、時(shí)間、資金較為充足的條件下，可進(jìn)一步探討如：設(shè)計(jì)樣本量更大，不同電針刺激頻率、不同穴位組合的比較；不同的檢測(cè)指標(biāo)之間的相互關(guān)系如何；觀(guān)測(cè)的時(shí)間位點(diǎn)延長(zhǎng)，比如延長(zhǎng)至4 周甚或1 個(gè)月或更長(zhǎng)等等，都可以進(jìn)行深入研究探討，以期為臨床電針治療腦梗死提供更加合理的方案和理論支持。