李子杰，曹受金，周 圍

（中南林業(yè)科技大學(xué) 林學(xué)院，湖南 長沙 410004）

藍(lán)莓Vaccinium spp.是杜鵑花科Ericaceae 越橘屬Vaccinium的多年生落葉灌木[1]。藍(lán)莓果實中含有花青素、黃酮等物質(zhì)，具有抗?jié)?、增?qiáng)心臟功能及抗衰老等多種生理功能，同時是一種經(jīng)濟(jì)價值非常高的新興水果，國際糧農(nóng)組織將其列為人類五大健康食品之一[2]。藍(lán)莓春季觀花、夏季觀果，還可制作果樹盆景[3]。藍(lán)莓‘燦爛’屬兔眼藍(lán)莓品種，果實品質(zhì)佳，口感好，耐儲藏，深受人們青睞，該品種適合我國南方地區(qū)種植，特別適合鮮果銷售或觀光采摘[4]。

組織培養(yǎng)是藍(lán)莓?dāng)U大繁殖系數(shù)的重要方法，目前有關(guān)兔眼藍(lán)莓組織培養(yǎng)研究較多，如很多學(xué)者總結(jié)了外植體褐化[5-6]、誘導(dǎo)增殖[7]、試管苗生根[8]及移栽馴化等[9]。不同消毒方式對藍(lán)莓外植體污染及褐化影響較大。以兔眼藍(lán)莓的莖段為外植體，先用1.5%抗壞血酸浸泡外植體30 min，再用70%～75%酒精消毒15～30 s 及0.1%氯化汞消毒8～10 min，外植體污染率及褐化率低，成活率高[10]。在培養(yǎng)基中添加抗氧化劑及增加瓊脂質(zhì)量濃度（10～15 g·L-1），或加入200 mg·L-1Vc液且活性炭含量為200～500 mg·L-1時，能有效防止愈傷組織褐化發(fā)生[11]。不同的生長調(diào)節(jié)劑對兔眼藍(lán)莓腋芽誘導(dǎo)效果影響較大，使用ZT 的效果要好于2iP 或6-BA 等[12]，但ZT 使用質(zhì)量濃度過高會導(dǎo)致叢芽節(jié)間短、長勢弱且部分玻璃化[13]。因此，如何提高兔眼藍(lán)莓的誘導(dǎo)率，同時又能保持較好的生長勢一直是亟待解決的關(guān)鍵問題之一。兔眼藍(lán)莓組培苗生根相對困難，王大平[14]報道兔眼藍(lán)莓‘園藍(lán)’采用1/2 WPS 基本培養(yǎng)基添加0.5 mg·L-1IBA 和0.3%活性炭，瓶內(nèi)生根率達(dá)78.7%，而兔眼藍(lán)莓‘粉藍(lán)’瓶內(nèi)生根率僅為63.3%[11]，兔眼藍(lán)莓品種較多，不同基因型瓶內(nèi)生根對培養(yǎng)基和生長調(diào)節(jié)劑的種類及質(zhì)量濃度要求均不同[15]。生根組培苗在不同基質(zhì)中移栽成活率不一樣[16]，因此，兔眼藍(lán)莓能否誘導(dǎo)出數(shù)量眾多、根系健壯的生根苗是工廠化組培快繁技術(shù)研究的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本研究以‘燦爛’藍(lán)莓為研究對象，研究外植體的滅菌方法，篩選出適合的誘導(dǎo)、增殖及生根培養(yǎng)基，為生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)種苗提供理論指導(dǎo)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗材料為兔眼藍(lán)莓‘燦爛’，來自長沙智博生物科技有限公司種植園。外植體選取生長健壯、無病害的當(dāng)年生半木質(zhì)化枝條，將其組織培養(yǎng)后獲得的藍(lán)莓試管苗作為試驗材料。

1.2 試驗設(shè)計

1.2.1 外植體消毒處理

將兔眼藍(lán)莓‘燦爛’帶芽莖段剪成長2.0～3.0 cm 的小段，在洗衣粉溶液中浸泡1 h，流水沖洗干凈，剪去葉片后，先后采用75%乙醇、0.1% HgCl2和2%次氯酸鈉處理莖段，設(shè)置6 組實驗方法進(jìn)行滅菌（表1）。將滅菌后的帶芽莖段用無菌水沖洗3 次，接種至改良WPM 培養(yǎng)基（以水合硝酸鈣684.00 mg·L-1、硝酸鉀190.00 mg·L-1和鹽酸硫胺素0.10 mg·L-1代替原WPM 培養(yǎng)基中的硫酸鉀、氯化鈣和硫酸亞鐵）上。每組接種30 個莖段，3 次重復(fù)，2 周后觀察外植體存活以及感染情況。

表1 藍(lán)莓帶芽莖段的滅菌處理Table 1 Sterilization of Vaccinium ashei stem segments with buds

1.2.2 初代培養(yǎng)的篩選

將1.0～1.5 cm 的帶芽莖段接種于添加玉米素ZT（0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 mg·L-1) 的 改 良WPM 培養(yǎng)基上，設(shè)置5 組，每組接種30 個莖段，3 次重復(fù)，接種后20 d 觀測記錄芽苗誘導(dǎo)情況。

1.2.3 繼代培養(yǎng)基的篩選

將組培苗切去下端愈傷組織和上端嫩芽部分，再切成1.0～1.5 cm 的單芽莖段，轉(zhuǎn)接于不同激素質(zhì)量濃度的WPM（改良）培養(yǎng)基（表2）上進(jìn)行增殖培養(yǎng)，每瓶接種6 株，每個處理接種30 株，3 次重復(fù)。培養(yǎng) 40 d 后觀察芽的生長狀況。

表2 誘導(dǎo)藍(lán)莓不定芽的激素質(zhì)量濃度Table 2 Hormone mass concentration of inducing Vaccinium ashei adventitious buds

1.2.4 生根培養(yǎng)基的篩選

剪取2.0 cm 左右的兔眼藍(lán)莓試管苗，轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基上。以1/2 WPM（改良）培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加活性炭（200 mg·L-1）+IBA（0.5、0.8、1.0、1.2 mg·L-1）。設(shè)置4 個組，每組接種30 個單芽莖段，3 次重復(fù)，60 d 后調(diào)查生根情況。

1.3 培養(yǎng)條件

本試驗在長沙智博生物科技有限公司組培實驗室中進(jìn)行，培養(yǎng)溫度 25±2 ℃，光強(qiáng)2 000～2 500 Lx，光照時間12 h·d-1?；九囵B(yǎng)基為：WPM培養(yǎng)基，10.5 g·L-1卡拉膠，20 g·L-1蔗糖，pH 值為5.5～6.5。

1.4 數(shù)據(jù)分析

培養(yǎng)30～60 d 后統(tǒng)計外植體污染率、存活率、腋芽誘導(dǎo)率、生長狀況、增殖系數(shù)、生根率、誘導(dǎo)的根長度、根條數(shù)和根重等。使用SPSS22.0 和EXCEL2010 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 兔眼藍(lán)莓外植體表面的消毒方法

不同滅菌劑和處理時間不同，外植體的污染率和存活率也不同。由方差分析結(jié)果表明（表3），不同處理方式對兔眼藍(lán)莓莖段污染率的影響有顯著差異，第3 組污染率最低為5.66%；第2 組次之為12.22%，但其試管苗愈傷組織良好，腋芽生長旺盛，為最適宜的消毒方法。實驗第1 組、第4 組、第5 組滅菌不充分，污染率高達(dá)60%以上，其中第4 組外植體全部污染；第3 組實驗組滅菌時間過長，影響腋芽生長，長勢緩慢且細(xì)弱。綜上所述，第2 組，即先用75%乙醇浸泡20 s、再用0.1%HgCl2浸泡10 min，再用無菌水沖洗3 次為最適宜的消毒方法。圖1為外植體消毒后的生長狀況。

表3 不同滅菌劑和方法對外植體生長的影響?Table 3 The effect of different sterilizing agents and methods on explant browning

圖1 外植體消毒后的生長狀況Fig.1 The growth condition of the ex-plant after disinfection

2.2 不同ZT 質(zhì)量濃度對初代培養(yǎng)的影響

在初代培養(yǎng)中不同ZT 質(zhì)量濃度對兔眼藍(lán)莓初代培養(yǎng)的影響見圖2。由表4可以看出，ZT（1.0 mg·L-1）的激素質(zhì)量濃度能有效促進(jìn)藍(lán)莓腋芽的誘導(dǎo)分化，腋芽分化快且粗壯，生長旺盛，葉片濃綠有活力，誘導(dǎo)率達(dá)64.66%。方差分析結(jié)果表明：1.0 mg·L-1的ZT 質(zhì)量濃度與其他實驗組相比有顯著的差異，因此，改良WPM+ZT（1.0 mg·L-1）培養(yǎng)基為最適宜的初代誘導(dǎo)配方。其他高質(zhì)量濃度或低質(zhì)量濃度的激素配方，都會導(dǎo)致試管苗的生長緩慢或植株細(xì)弱，不適宜做培養(yǎng)基配方。

圖2 不同ZT 質(zhì)量濃度對兔眼藍(lán)莓芽誘導(dǎo)情況Fig.2 Induction of blueberry buds by different ZT mass concentrations

表4 不同激素質(zhì)量濃度對兔眼藍(lán)莓芽誘導(dǎo)的影響Table 4 Effects of different mass concentration on bud induction of Vaccinium ashei

2.3 植物激素及配比對繼代增殖培養(yǎng)的影響

以WPM（改良）培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加兩種植物生長調(diào)節(jié)劑進(jìn)行繼代增殖培養(yǎng)，對7 種培養(yǎng)基的增殖系數(shù)進(jìn)行方差分析（表5），試驗結(jié)果表明 ZT（0.5 mg·L-1）對試管苗的影響差異顯著，增殖系數(shù)較高，為3.57，此時愈傷組織較多，芽分化較快且粗壯，生長旺盛；1.0 mg·L-1的ZT 濃度時也可以達(dá)到同樣的效果，但此時試管苗不健康，容易褐化或玻璃化；ZT 質(zhì)量濃度為1.5 mg·L-1時，增殖系數(shù)最高為4.43，此時試管苗的增殖達(dá)到最大，分化的不定芽最多，但枝條細(xì)弱，葉片稀疏，易發(fā)生褐化，不適合做繼代培養(yǎng)。低質(zhì)量濃度的6-BA，增殖效果不明顯，未產(chǎn)生愈傷組織及芽的分化，1.5 mg·L-1時，植株少量分化，但枝條細(xì)弱。綜上所述，0.5 mg·L-1的ZT 質(zhì)量濃度，為最適宜的繼代培養(yǎng)配方。圖3為ZT 和3-BA 對兔眼藍(lán)莓愈傷組織誘導(dǎo)情況。

表5 不同激素種類對兔眼藍(lán)莓芽和愈傷組織誘導(dǎo)的影響Table 5 Effects of different hommones on bud and callus induction of Vaccinium ashei

圖3 ZT 和6-BA 對兔眼藍(lán)莓愈傷組織誘導(dǎo)情況Fig.3 Induction of ZT and 6-BA on callus of blueberry

2.4 IBA 不同濃度對組培苗生根的影響

以1/2 WPM（改良）培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加不同質(zhì)量濃度的IBA進(jìn)行生根培苗，研究表明，由表6可以看出，兔眼藍(lán)莓‘燦爛’在1/2 WPM（改良）培養(yǎng)基外加激素IBA（1.0 mg·L-1）中生根較為理想，根系豐富有活力，根系從莖基部或皮部長出，長度粗細(xì)均勻。在IBA 質(zhì)量濃度為1.2 mg·L-1時，平均根長最高，但根系較細(xì)弱（圖4）。

圖4 IBA 不同質(zhì)量濃度對組培生根的影響情況Fig.4 Effects of IBA mass concentration on rooting in tissue culture

表6 IBA 不同質(zhì)量濃度對組培生根的影響Table 6 Effects of IBA mass concentration on rooting in tissue culture

3 討 論

3.1 外植體表面消毒方法對藍(lán)莓莖段的影響

本實驗中最佳外植體處理方法為，將藍(lán)莓莖段在洗衣粉溶液中浸泡1 h，流水沖洗3～5 次，剪去葉片后，再用75%乙醇浸泡20 s、0.1%HgCl2浸泡10 min，由于滲透性較強(qiáng)，必須反復(fù)用無菌水沖洗，防止升汞殘留，接種時還需剪去外植體兩端，更有利于吸收和防止褐化。本次實驗于冬季采集枝條，冬季溫度低，病菌較少，因此枝條采集季節(jié)也是影響污染率的一個重要因素。

3.2 玉米素ZT 對藍(lán)莓初代組織培養(yǎng)的影響

在初代誘導(dǎo)階段，加入玉米素ZT（1.0 mg·L-1）的改良WPM 培養(yǎng)基的效果最好，與孫淼淼[17]探究藍(lán)莓‘盛世’的外植體誘導(dǎo)結(jié)果一致。玉米素ZT 是植物體內(nèi)天然存在的一種細(xì)胞分裂素，它是從甜玉米灌漿期的籽粒中提取并結(jié)晶出的第1 個天然細(xì)胞分裂素，植物自身產(chǎn)生微量的植物激素并直接或間接作用于靶器官或靶組織，影響植物根系的分裂、生長和分化[18]。植物激素被吸收后可促進(jìn)植物體內(nèi)的各類活性酶類物質(zhì)的聯(lián)動作用，從而影響植物的理化進(jìn)程[19]。實驗表明藍(lán)莓莖段對玉米素ZT 的敏感度較高，各組合間分化率顯著，因此實驗中仍需不斷微調(diào)以確定更適宜的質(zhì)量濃度范圍。

3.3 不同激素種類和質(zhì)量濃度對藍(lán)莓繼代培養(yǎng)的影響

藍(lán)莓繼代培養(yǎng)中，加入玉米素ZT（0.5 mg·L-1）的培養(yǎng)基，增殖系數(shù)較高為3.57，此時植株生長健壯，葉片濃綠有活力，ZT 質(zhì)量濃度為1.5 mg·L-1時，增殖系數(shù)達(dá)到最高為4.43，但此時增殖芽苗莖稈細(xì)弱，葉片稀疏短小，側(cè)枝過多，褐化玻璃化嚴(yán)重，可能是玉米素濃度過高導(dǎo)致，也可能因為多次的繼代培養(yǎng)所引起的退化，這與宋斯妤[20]研究的華中櫻多次繼代引起植株矮小瘦弱的現(xiàn)象相似。另外，組培苗的褐化、玻璃化現(xiàn)象，除了培養(yǎng)基的配方原因外，人工接種的不當(dāng)操作也可能導(dǎo)致褐化，剪去莖段時截面粗糙不平整或者剪刀劃破葉片都可能導(dǎo)致褐化、玻璃化的現(xiàn)象，因此規(guī)范操作是組培人員的基礎(chǔ)素質(zhì)和技能。

在試管苗的繼代培養(yǎng)中，莖段下切口產(chǎn)生愈傷組織，引起組織的脫分化和再分化，另外還觀察到植株的葉柄處以及接觸培養(yǎng)基表面的葉片，也會產(chǎn)生愈傷組織，增殖出芽，這與陳冰心等[21]研究的‘奧尼爾’藍(lán)莓葉片組培快繁的結(jié)果一致。葉柄處存在芽原基，生命活動旺盛，通過表皮細(xì)胞吸收到玉米素時易發(fā)生脫分化產(chǎn)生愈傷組織，而葉片可能通過氣孔和表皮細(xì)胞吸收到激素而增殖分化。

3.4 吲哚丁酸IBA 質(zhì)量濃度對藍(lán)莓生根培養(yǎng)的影響

生根培養(yǎng)是藍(lán)莓組培中較難的階段，王升等[22]研究藍(lán)莓的組培中，直接用繼代培養(yǎng)的藍(lán)莓植株，剪除愈傷組織再短截2～3 cm 后扦插于水苔中。本次試驗中，以1/2 WPM（改良）培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加活性炭（200 mg·L-1）、IBA（1.0 mg·L-1）的培養(yǎng)基效果最佳，生根率可達(dá)84%，但時間跨度較長，需要2 個月才能夠煉苗移栽，改良激素配方可能會達(dá)到更好的效果。

但本研究只局限于在瓶內(nèi)生根研究，沒有進(jìn)行馴化煉苗方面的研究，瓶內(nèi)生根苗如何適應(yīng)大田環(huán)境，如何在大田存活下來是下一步研究方向。

4 結(jié) 論

通過一系列的試驗，該研究最終確立了‘燦爛’藍(lán)莓莖段的最適消毒方法是：75%乙醇浸泡20 s，0.1%升汞浸泡12 min。最適誘導(dǎo)培養(yǎng)基為WPM（改良）+ZT 1.0 mg·L-1。最適增殖培養(yǎng)基為WPM（改良）+ZT 0.5 mg·L-1，增殖系數(shù)為3.57，叢生苗生長迅速且健壯。最適生根培養(yǎng)基為1/2 WPM+IBA 1.0 mg·L-1。通過該技術(shù)體系進(jìn)行大規(guī)模的組培快繁，不僅在很大程度上縮短了組培生產(chǎn)周期，更重要的是，繁殖系數(shù)高，得到的組培苗后代品質(zhì)較高，并為其他物種利用器官組織直接誘導(dǎo)不定芽進(jìn)行大規(guī)模擴(kuò)繁提供了一定的研究基礎(chǔ)和技術(shù)參考。