梁坤 戴儒奇 黎芬 蒙銳 陳春如

(海南省人民醫(yī)院 海南醫(yī)學(xué)院附屬海南醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，海南 ?？?570311)

卵巢癌是常見婦科惡性腫瘤之一，主要治療方式為手術(shù)切除結(jié)合放化療，但術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率高，且癌細胞對化療藥物易產(chǎn)生耐藥性，難以治愈，嚴(yán)重威脅婦女健康〔1〕。隨著分子生物學(xué)、遺傳學(xué)及臨床醫(yī)學(xué)的發(fā)展，分子靶向治療為卵巢癌治療提供了新方向〔2〕。研究卵巢癌的發(fā)生發(fā)展機制可為分子靶向治療提高一定基礎(chǔ)和依據(jù)。研究發(fā)現(xiàn)lncRNA可參與腫瘤細胞的增殖、轉(zhuǎn)移、細胞周期進程、生長和凋亡過程，在卵巢癌中也發(fā)揮重要作用〔3〕。長基因間非編碼RNA(LINC00261)是一種lncRNA，LINC00261在非小細胞肺癌組織中下調(diào)，與淋巴轉(zhuǎn)移、腫瘤大小、腫瘤分期及患者生存時間有關(guān)；敲低LINC00261在體外抑制了腫瘤的生長和侵襲能力〔4〕。LINC00261通過減少靶向FOXO1的miRNA抑制子宮內(nèi)膜癌細胞的增殖、遷移和侵襲〔5〕。研究表明miRNA也參與卵巢癌的發(fā)生發(fā)展〔6〕。研究發(fā)現(xiàn)circRNA Cdr1as通過調(diào)節(jié)miR-1270/癌細胞侵襲抑制因子(SCAI)信號通路使卵巢癌對順鉑敏感〔7〕。骨肉瘤細胞系和原位人類腫瘤中miR-1270均異常上調(diào)表達，與骨肉瘤患者臨床療效差和總生存期短有關(guān)，下調(diào)miR-1270抑制了癌癥的體外增殖和遷移及體內(nèi)腫瘤發(fā)生〔8〕。hsa-miR-1270在膀胱癌患者血清中上調(diào)表達，可作為膀胱癌的新的預(yù)后生物標(biāo)志物〔9〕。然而LINC00261和miR-1270對卵巢癌細胞增殖、侵襲和遷移的影響尚不清楚，本實驗旨在研究LINC00261對卵巢癌細胞增殖、侵襲和遷移的影響及其是否通過miR-1270調(diào)控。

1 材料與方法

1.1一般資料 2010～2019年海南省人民醫(yī)院海南醫(yī)學(xué)院附屬海南醫(yī)院收治的卵巢癌術(shù)后患者52例，其中術(shù)后正常17例，術(shù)后腫瘤轉(zhuǎn)移35例，年齡60～75歲。細胞與試劑：正常卵巢上皮細胞HOSE和卵巢癌SKOV3、ES-2、A2780細胞購自上海生命科學(xué)研究院細胞資源中心。胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)基均購自美國Gibco公司；Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒購自美國Progema公司；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司；四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT)試劑盒、蛋白提取試劑盒、二辛可寧酸(BCA)試劑盒、RIPA蛋白裂解液、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所；抗體購自上海斯信生物科技有限公司；細胞周期檢測試劑、Transwell小室、Matrigel購于美國BD公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自北京Solarbio公司。Thermo FC酶標(biāo)儀購自美國Thermo公司；FACSCanto Ⅱ流式細胞儀購自美國 Bio-Rad公司。熒光顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.2正電子發(fā)射計算機斷層顯像/電子計算機斷層(PET/CT)影像檢查 Biograph TruePoint 64 PET/CT掃描儀購自德國西門子公司；靜脈注射藥物18F-FDG購自上海源自科業(yè)有限公司，放射化學(xué)純度≥95%，注射劑量按患者體脂量2.96～3.70 MBq/kg注射?；颊邫z查前禁食6 h以上，血糖在正常范圍內(nèi)，靜脈注射18F-FDG后，患者飲水800～1 000 ml，避光條件下平臥休息60 min，進行全身PET/CT顯像。掃描時患者仰臥，CT掃描條件：球管電壓140 kV，電流100 mA，層厚2～5 mm，矩陣512×512；PET掃描條件：矩陣128×128，采集時間1 min/床位。利用CT掃描對PET圖像進行衰減校正，采用TrueX法重建圖像，獲得橫斷面、矢狀面及冠狀面的PET圖像、CT圖像及PET/CT融合圖像。由2位以上有經(jīng)驗的影響科醫(yī)生和核醫(yī)學(xué)科醫(yī)生進行閱片，利用CT圖像選取病灶放射性濃聚最高的層面勾畫感興趣區(qū)(ROI)，系統(tǒng)自動測量病灶的最大標(biāo)注吸收值(SUVmax)；同時局部CT表現(xiàn)符合腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移特征的作為判斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.3實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測患者血清中LINC00261和miR-1270表達 采集患者空腹靜脈血，室溫靜置30 min，3000 r/min離心10 min，分離血清，用Bioteke法提取血清總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，LINC00261和miR-1270分別以GAPDH和U6為內(nèi)參，進行PCR，反應(yīng)條件為95℃ 30 s，95℃ 10 s，60℃ 30 s；72℃ 30 s，共40個循環(huán)；60℃延長5 min。相對表達量用2-△△Ct法計算。LINC00261上游引物：5′-ACATTTGGTAGCCCGTGGAG-3′，下游：5′-TCTTCCCCGGAGAACTAGCA-3′；GAPDH上游引物：5′-TGTTGCCATCAATCACCCCTT-3′，下游：5′-CTCCACGACGTACTCAGCG-3′；miR-1270上游引物：5′-CTGGAGATATGGAAGAGCTGTGT-3′，下游：5′-TGCAAAGAGCCACATAGAAGAT-3′；U6上游引物：5′-CGCTTCGGCAGCACATATACTA-3′，下游：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCA-3′；引物由上海生工生物工程公司合成。

1.4細胞培養(yǎng) 正常卵巢上皮細胞HOSE和卵巢癌SKOV3、ES-2、A2780細胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，2 d換液一次，待細胞融合至90%左右時，進行消化傳代，取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

1.5細胞轉(zhuǎn)染與分組 取對數(shù)生長期細胞ES-2，將pcDNA、pcDNA-LINC00261、si-con、si-LINC00261、anti-miR-con、anti-miR-1270轉(zhuǎn)染至ES-2細胞中，分別記為pcDNA組、pcDNA-LINC00261組、si-con組、si-LINC00261組、anti-miR-con組、anti-miR-1270組；正常培養(yǎng)的細胞作為對照組；將pcDNA-LINC00261與miR-con、miR-1270分別共轉(zhuǎn)染至ES-2細胞中，記為pcDNA-LINC00261+miR-con組、pcDNA-LINC00261+miR-1270組。

1.6RT-qPCR檢測正常卵巢上皮細胞HOSE和卵巢癌SKOV3、ES-2、A2780細胞中LINC00261和miR-1270的表達 提取細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后進行熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，具體步驟按1.3進行。

1.7Western印跡法檢測細胞增殖核抗原(Ki-67)、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2蛋白表達 各組細胞培養(yǎng)48 h后提取總蛋白，BCA試劑盒測定蛋白濃度。將蛋白樣品進行PAGE后轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，再分別加入一抗(1∶1 000)，4℃孵育過夜，TBST洗膜；加入二抗(1∶2 000)室溫孵育90 min，TBST洗滌，用電化學(xué)發(fā)光法(ECL)發(fā)光液顯影，用ChemiDoc XRS+系統(tǒng)成像，用Quantity One凝膠分析軟件測定各組蛋白條帶的灰度值，蛋白相對表達水平=目的條帶灰度值/β-actin條帶灰度值。每個蛋白樣品設(shè)3個重復(fù)。

1.8MTT檢測細胞活性 各組細胞培養(yǎng)48 h，每孔分別加入5 mg/ml的MTT溶液20 μl，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h后棄去上清液，每孔加入二甲基亞砜(DMSO)150 μl，振蕩反應(yīng)10 min使沉淀溶解，用酶標(biāo)儀于波長490 nm處檢測吸光度(OD)值。細胞活性(%)=實驗組OD值/空白對照組OD值×100%。實驗重復(fù)3次。

1.9流式細胞儀檢測細胞周期 各組細胞培養(yǎng)48 h后收集細胞，并制備單細胞懸液，加入3 ml預(yù)冷的70%乙醇固定，用P緩沖液洗滌后加入核糖核酸酶(RNase)A于37℃水浴30 min，加入碘化丙啶(PI)，避光30 min，上機檢測，重復(fù)3次。用流式細胞儀和DNA細胞周期分析軟件檢測細胞周期。

1.10Transwell檢測細胞遷移和侵襲 收集各組細胞，無血清培養(yǎng)后，取200 μl接種于Transwell小室上層，培養(yǎng)24 h后，吸去培養(yǎng)液后用棉簽輕輕擦去上層細胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，4%多聚甲醛固定30 min，再用0.1%結(jié)晶紫染色10 min，顯微鏡下拍照并計數(shù)發(fā)生遷移的細胞數(shù)量。細胞侵襲實驗在Transwell小室上層加入50 μl基質(zhì)膠，凝固后接種細胞，之后同細胞遷移操作。倒置顯微鏡下每孔隨機選取5個視野進行拍照和計數(shù)，每組重復(fù)3次。

1.11細胞劃痕實驗檢測細胞劃痕愈合率 各組細胞消化后在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，在盤底用記號筆劃線做標(biāo)記，過夜細胞鋪滿后用槍頭垂直橫線劃痕，用PBS沖洗劃下的細胞，換液后繼續(xù)培養(yǎng)，在培養(yǎng)0 h和48 h后拍照觀察，用Image-Pro Plus6.0軟件計算劃痕面積和劃痕愈合率，每組設(shè)3個重復(fù)，實驗重復(fù)3次。

1.12熒光素酶報告實驗檢測LINC00261對miR-1270的靶向調(diào)控 Starbase數(shù)據(jù)庫顯示LINC00261與miR-1270存在結(jié)合位點。構(gòu)建野生型和突變型基因靶點LINC00261的熒光素酶表達載體WT-LINC00261和MUT-LINC00261，用LipofectamineTM2000將WT-LINC00261和MUT-LINC00261分別與miR-con和miR-1270共轉(zhuǎn)染至細胞ES-2中。按照說明書檢測熒光素酶活性，實驗重復(fù)3次。

1.13統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS20.0軟件行t檢驗、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1LINC00261和miR-1270在術(shù)后腫瘤轉(zhuǎn)移患者血清中的表達 與術(shù)后正?；颊?1.25±0.47、0.93±0.36)相比，術(shù)后腫瘤轉(zhuǎn)移患者血清中LINC00261表達(0.41±0.16)顯著降低，miR-1270表達(3.87±1.23)顯著升高(t=9.573、9.613，均P=0.000)。

2.2LINC00261和miR-1270在卵巢癌細胞中的表達 與正常卵巢上皮細胞HOSE相比，卵巢癌SKOV3、ES-2、A2780中LINC00261表達水平顯著降低，miR-1270表達水平顯著升高(P<0.05)。見表1。

表1 卵巢癌細胞和正常卵巢上皮細胞中LINC00261和miR-1270的表達

2.3過表達LINC00261抑制卵巢癌細胞存活率和引起細胞周期阻滯 與pcDNA組相比，pcDNA-LINC00261組卵巢癌細胞ES-2中LINC00261表達水平顯著升高，Ki-67表達水平顯著降低，細胞活性顯著降低，G0/G1期和G2/M期細胞比例顯著降低，S期細胞比例顯著升高(P<0.05)，見圖1，表2。

圖1 Western印跡檢測卵巢癌細胞中Ki-67蛋白表達

表2 過表達LINC00261對卵巢癌細胞存活率和周期阻滯的影響

2.4過表達LINC00261抑制卵巢癌細胞遷移和侵襲的影響 與pcDNA組相比，pcDNA-LINC00261組卵巢癌細胞ES-2中MMP-2表達水平顯著降低，細胞遷移和侵襲數(shù)顯著降低，細胞劃痕愈合率顯著降低(P<0.05)，見圖2、圖3、表3、圖4。

圖2 Transwell檢測卵巢癌細胞遷移和侵襲(結(jié)晶紫染色，×200)

圖3 細胞劃痕實驗檢測卵巢癌細胞遷移(結(jié)晶紫染色，×100)

表3 過表達LINC00261對卵巢癌細胞遷移和侵襲的影響

圖4 Western印跡檢測卵巢癌細胞MMP-2蛋白表達

2.5LINC00261靶向miR-1270調(diào)控其表達 Starbase數(shù)據(jù)庫預(yù)測顯示LINC00261與miR-1270存在結(jié)合位點(圖5)。熒光素酶報告實驗顯示，與miR-con組(0.96±0.13、1.25±0.12)相比，miR-1270組中轉(zhuǎn)染野生型表達載體WT-LINC00261的細胞熒光素酶活性(0.45±0.07)顯著降低(t=10.362,P=0.000)；而轉(zhuǎn)染突變型表達載體MUT-LINC00261的細胞熒光素酶活性(1.21±0.10)無顯著差異(t=0.768，P=0.454)。與si-con組(0.94±0.10)相比，si-LINC00261組miR-1270表達水平(3.65±0.59)顯著升高(P<0.05)，與pcDNA組(0.91±0.09)相比，pcDNA-LINC00261組miR-1270表達水平(0.43±0.06)顯著降低(P<0.05)。

2.6干擾miR-1270抑制卵巢癌細胞存活率、細胞周期和轉(zhuǎn)移 與anti-miR-con組相比，anti-miR-1270組卵巢癌細胞中miR-1270、Ki-67、MMP-2表達水平顯著降低，細胞遷移和侵襲數(shù)顯著降低，細胞劃痕愈合率顯著降低，細胞活性顯著降低，G0/G1期和G2/M期細胞比例顯著降低，S期細胞比例顯著升高(P<0.05)，見圖6、表4、圖7、圖8。

圖5 LINC00261與 miR-1270靶向結(jié)合位點

圖6 Transwell檢測卵巢癌細胞遷移和侵襲(結(jié)晶紫染色，×200)

表4 干擾miR-1270表達對卵巢癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響

圖7 細胞劃痕實驗檢測卵巢癌細胞遷移(結(jié)晶紫染色，×100)

圖8 Western印跡檢測卵巢癌細胞Ki-67和MMP-2蛋白表達

2.7轉(zhuǎn)染miR-1270部分逆轉(zhuǎn)LINC00261卵巢癌細胞存活率和轉(zhuǎn)移的抑制作用 與pcDNA-LINC00261+miR-con組相比，pcDNA-LINC00261+miR-1270組卵巢癌細胞中miR-1270、Ki-67、MMP-2表達水平顯著升高，細胞遷移和侵襲數(shù)顯著升高，細胞劃痕愈合率顯著升高，細胞活性顯著升高，G0/G1期和G2/M期細胞比例顯著升高，S期細胞比例顯著降低(P<0.05)。見圖9、圖10、表5、圖11。

圖9 Transwell檢測卵巢癌細胞遷移和侵襲(結(jié)晶紫染色，×200)

圖10 細胞劃痕實驗檢測卵巢癌細胞遷移(結(jié)晶紫染色，×100)

表5 轉(zhuǎn)染miR-1270部分逆轉(zhuǎn)LINC00261對卵巢癌細胞增殖和轉(zhuǎn)移的抑制作用

圖11 Western印跡檢測卵巢癌細胞Ki-67和MMP-2蛋白表達

3 討 論

卵巢癌基本治療是在手術(shù)基礎(chǔ)上輔以化療，其初期緩解率較高，但仍有多數(shù)患者仍有近期或遠期的復(fù)發(fā)〔10〕。腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是影響預(yù)后的主要問題，若能及時發(fā)現(xiàn)、早期治療，可以明顯改善預(yù)后。PTE/CT在卵巢惡性腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移診斷中對各項指標(biāo)數(shù)據(jù)有較高敏感性，能夠有效預(yù)測淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移位置與情況，具有較高的臨床應(yīng)用價值〔11〕。本研究通過PET/CT診斷術(shù)后卵巢癌患者轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)情況，術(shù)后部分患者卵巢正常未見腫瘤性病變的盆腔，說明沒有復(fù)發(fā)；而部分患者腹膜局灶性代謝增高或盆腔內(nèi)有巨大實囊性腫塊，腫塊實性部分代謝增高，囊性部分放射性缺損，或肝包膜下局灶性代謝增高，說明其可能發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)LINC00261表達水平在術(shù)后腫瘤轉(zhuǎn)移患者中顯著降低。研究報道LINC00261在胃癌組織中低表達，與腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期及5年存活率顯著相關(guān)〔12〕。LINC00261過表達可抑制肝細胞癌細胞增殖、侵襲〔13〕。過表達LINC00261抑制結(jié)腸癌細胞增殖、遷移、侵襲能力，抑制癌細胞集落形成并增強細胞凋亡〔14〕。LINC00261在子宮內(nèi)膜異位癥組織中顯著下調(diào)，過表達LINC00261通過直接結(jié)合miR-132-3p來調(diào)節(jié)BCL2樣蛋白(BCL2L)11表達可抑制子宮內(nèi)膜異位癥細胞的增殖和侵襲〔15〕。本實驗結(jié)果說明過表達LINC00261可抑制卵巢癌細胞增殖、遷移和侵襲，并將細胞阻滯于S期。

研究表明部分miRNA在卵巢癌中異常表達，可能參與卵巢癌的發(fā)生發(fā)展過程，在卵巢癌的診斷及治療中也起重要作用〔16〕。研究報道circRNA Cdr1as通過miR-1270抑制上調(diào)凋亡蛋白酶激活因子(APAF)1表達，增強了膀胱癌細胞的順鉑化學(xué)敏感性〔17〕。circRNA Cdr1as過表達通過使miR-1270海綿化促進了肝癌細胞的增殖和遷移〔18〕。miR-1270下調(diào)通過調(diào)節(jié)SCAI抑制了甲狀腺乳頭狀癌細胞的增殖、遷移和體內(nèi)移植〔19〕。本實驗結(jié)果還說明抑制miR-1270表達可抑制卵巢癌細胞增殖、遷移和侵襲，并將細胞阻滯于S期。且本實驗還提示，LINC00261可能通過調(diào)控miR-1270影響卵巢癌細胞增殖、遷移和侵襲。

綜上，過表達LINC00261可抑制卵巢癌細胞增殖、遷移和侵襲，并阻滯細胞于S期，其機制可能與miR-1270有關(guān)。