鄧錦滿 胡潤凱 韓偉超 何淑芬 謝保城 丁少波

(南方醫(yī)科大學(xué)附屬東莞市人民醫(yī)院藥學(xué)部，廣東 東莞 523059)

近幾十年來，隨著人們的生活水平變化，我國的糖尿病(DM)患者越來越多，其發(fā)病率僅次于腫瘤及心血管疾病，在慢性疾病中排名第三位〔1〕。DM是由先天性或后天因素引起的胰島功能障礙或胰島素抵抗引起的一種常見的代謝性疾病，以機(jī)體高血糖、高脂血癥、胰島素缺乏或胰島素抵抗為特征〔2〕。黃芪甲苷是中藥黃芪的有效成分，研究表明其具有豐富的藥理活性，如抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗糖尿病、腎臟保護(hù)及抗氧化應(yīng)激等〔3〕，常用于治療DM引起的并發(fā)癥，如腎臟損傷，其機(jī)制可能與轉(zhuǎn)化生長因子-β1/白細(xì)胞抑制因子(TGF-β1/Smad)通路密切相關(guān)〔4,5〕。目前，西格列汀在臨床上廣泛用于治療2型糖尿病(T2DM)，它是一種二肽基肽酶(DPP)-4抑制劑，通過減少胰高血糖素樣肽(GLP)-1失活，刺激胰島素分泌發(fā)揮降血糖作用〔6〕。研究發(fā)現(xiàn)，西格列汀除降血糖作用外，還可能通過磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)通路改善胰島素抵抗、腎臟受損等〔7〕，而胰島素主要通過PI3K/Akt信號通路發(fā)揮調(diào)節(jié)血糖的作用，該信號通路異常是與T2DM發(fā)生發(fā)展息息相關(guān)〔8〕。隨著我國傳統(tǒng)中醫(yī)藥的發(fā)展，中西藥結(jié)合治療DM在臨床上應(yīng)用越來越廣泛，其臨床效果也受到越來越多的肯定〔9,10〕，然而其中的具體藥理作用及理論機(jī)制尚不明確，本實驗研究中藥單體黃芪甲苷聯(lián)合西格列汀治療T2DM模型大鼠，并基于TGF-β1/PI3K/Akt信號通路探究其中的作用機(jī)制治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料 SPF級雄性健康SD大鼠共55只，體質(zhì)量為(190±20)g，購于南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心；動物許可證號：SCXK(粵)2016-0041。磷酸西格列汀片，規(guī)格：100 mg×14片，批號：S025217，澳大利亞默沙東制藥公司生產(chǎn)。黃芪甲苷粉末，批號：170768，純度≥98%，成都瑞芬思生物科技有限公司生產(chǎn)。鏈脲佐菌素(STZ),Sigma公司；總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)及低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)購自深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司；丙二醛(MDA)；超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)試劑盒(Omega公司)；蛋白提取試劑盒(南京凱基生物科技公司)，兔抗大鼠β-actin 單抗(英國 Abcam 公司)；山羊抗兔二抗(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)，兔抗大鼠磷酸化(p)-PI3K,p-Akt多抗(英國 Abcam 公司) 。羅氏卓越精采型血糖儀(德國羅氏診斷有限公司)、卓越310型全自動生化分析儀(武漢精誠偉業(yè)醫(yī)療設(shè)備有限公司)、電泳儀(天能 VE-180)、synergy2多功能酶標(biāo)儀(美國Bio Tek儀器有限公司)、實時熒光定量PCR儀(美國Thermo)、MIKRO220型超速低溫離心機(jī)(德國 Hettich 公司)、FA1004 型電子天平(上海天平儀器廠)、Tanon 5200 Multi成像系統(tǒng)(上海天能)。

1.2動物造模、分組及給藥 大鼠進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)1 w后，采用數(shù)字隨機(jī)法分為5組，每組11只。正常組繼續(xù)采用標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)，造模組給予高糖高脂飼料喂養(yǎng)6 w后，采取腹腔注射STZ(60 mg/kg)，復(fù)制T2DM模型，注射72 h后，尾靜脈采血，血糖儀測血糖，隨機(jī)血糖>16.7 mmol/L為造模成功標(biāo)準(zhǔn)〔5〕。剔除血糖未達(dá)標(biāo)的5只大鼠，將造模成功后的39只大鼠隨機(jī)分為黃芪甲苷組(n=10)、西格列汀組(n=10)、黃芪甲苷+西格列汀組(n=9)、模型組(n=10)，分別灌胃給予黃芪甲苷〔60 mg/(kg·d)〕、西格列汀〔10 mg/(kg·d)〕，黃芪甲苷〔30 mg/(kg·d)+西格列汀〔5 mg/(kg·d)〕及同體積生理鹽水，連續(xù)8 w。

1.3大鼠體重、血糖指標(biāo)檢測 最后一次給藥后，大鼠先禁食不禁水12 h,測量體重，采用剪尾取血法采取大鼠尾根部血。大鼠空腹血糖(FPG)采用葡萄糖氧化酶法檢測，空腹胰島素(FINS)、糖化血紅蛋白(HbA1c)采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測。

1.4大鼠血脂指標(biāo)水平檢測 最后一次給藥后，腹腔注射水合氯醛(30 mg/kg)，大鼠麻醉后，經(jīng)腹主動脈取血，4℃，3 500 r/min，離心15 min，取上清，放于-40℃冰箱保存。用全自動生化分析儀檢測大鼠TC、TG、HDL-L、LDL-L水平。

1.5大鼠腎臟氧化應(yīng)激指標(biāo)測定 大鼠麻醉取血后，快速剖腹取出大鼠兩側(cè)腎臟，分別保存于4%多聚甲醛中，用于后續(xù)檢測。實驗時，用生理鹽水將腎臟組織沖洗干凈，剪碎，加入適量裂解液，搖勻，采用Omega公司的試劑盒檢測MDA；SOD、GSH-Px，實驗步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.6采用RT-PCR 法檢測大鼠腎組織 TGF-β1、PI3K、Akt基因的表達(dá) 取腎臟組織，先提取總RNA，檢測含量鑒定合格后，按試劑盒說明將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，PCR法反應(yīng)擴(kuò)增PI3K、Akt基因產(chǎn)物，每個指標(biāo)重復(fù) 3 次，以β-actin為內(nèi)參采用2-△△Ct法計算所得數(shù)據(jù)，作為目的 mRNA 的相對表達(dá)水平。引物由深圳華大基因公司進(jìn)行合成，其中TGF-β1引物序列為：上游5′-CCAAGGAGACGGAATACAGG;下游 5′-GTGTTGGTTGTAGAGGGC-AAG-3′；PI3K的引物序列為：上游5′-CATCACTTCCTCCTGCTCTAT-3′；下游5′-CAGTTGGTTGGCAAT-CTTCTTC-3′；Akt的引物序列為：上游5′-AAACCTGGCGGCCACGCTAC-3′；下游5′-TTGGCCAGGGCCACCTCCAT-3′，β-actin 引物序列為：上游5′-CATCCTGCGTCTGGACCTGG-3′；下游5′-TAATGTCACGCACGATTTCC-3′。

1.7Western印跡檢測大鼠腎臟TGF-β1、PI3K、AKT蛋白含量 取大鼠腎臟組織作為樣品，往各樣品加入1 ml配好的RIPA裂解液，在冰上充分裂解后提取總蛋白，按照BCA試劑盒說明書測定蛋白濃度，再根據(jù)蛋白濃度計算上樣量。按照配膠、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉的順序進(jìn)行實驗，最后將蛋白條帶放置在Tanon 5200 Multi成像系統(tǒng)中進(jìn)行曝光成像。以β-actin為參考，用軟件Image J計算灰度值。

1.8統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、LSD-t檢驗、獨(dú)立樣本t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1各組體重、血糖指標(biāo)比較 正常組反應(yīng)靈敏，活動正常。與正常組相比，造模成功后，模型組出現(xiàn)典型多飲、多食、多尿的癥狀，體重明顯減輕，F(xiàn)PG、HbA1c水平顯著升高，F(xiàn)INS水平顯著降低(P<0.01)；與模型組比較，黃芪甲苷組、西格列汀組、黃芪甲苷+西格列汀組的“三多一少”癥狀均有不同程度緩解，體重、FINS水平升高，F(xiàn)PG、HbA1c水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)；與黃芪甲苷組和西格列汀組相比，黃芪甲苷+西格列汀組體重、FINS水平顯著更高，F(xiàn)PG、HbA1c水平顯著更低(P<0.05)。見表1。

2.2各組TGF-β1、PI3K、Akt mRNA比較 與正常組相比，模型組TGF-β1 mRNA明顯升高，而PI3K、Akt mRNA明顯下降(P<0.01)；與模型組相比，黃芪甲苷組+西格列汀組的TGF-β1 mRNA水平顯著下降，黃芪甲苷組、西格列汀組、黃芪甲苷組+西格列汀組的PI3K、Akt mRNA水平顯著升高；與黃芪甲苷組和西格列汀組相比，黃芪甲苷+西格列汀組TGF-β mRNA顯著減少，PI3K及Akt mRNA顯著增加(P<0.05，P<0.01)。見表1。

表1 各組體重、血糖指標(biāo)及TGF-β1、PI3K、Akt mRNA比較

2.3各組血脂水平比較 與正常組比較，模型組血脂數(shù)據(jù)均出現(xiàn)顯著異常(P<0.01)。與模型組相比，黃芪甲苷組、西格列汀組、黃芪甲苷+西格列汀組TC、TG、LDL-C水平顯著降低，黃芪甲苷+西格列汀組HDL-C水平顯著升高(P<0.05，P<0.01)，而黃芪甲苷組、西格列汀組HDL-C水平未見明顯變化(P>0.05)；與黃芪甲苷組和西格列汀組相比，黃芪甲苷+西格列汀組TC、TG、LDL-C水平顯著更低，HDL-C水平顯著升高(P<0.05)。見表2。

2.4各組氧化應(yīng)激水平比較 與正常組對比，模型組MDA水平顯著升高，SOD、GSH-Px的水平顯著降低(P<0.01)；與模型組相比，黃芪甲苷組、西格列汀組、黃芪甲苷+西格列汀組MDA顯著降低，SOD顯著升高，而西格列汀組、黃芪甲苷+西格列汀組GSH-Px水平顯著升高(P<0.05，P<0.01)。與黃芪甲苷組和西格列汀組相比，黃芪甲苷+西格列汀組MDA更低，GSH-Px更高(P<0.05)，SOD無明顯變化(P>0.05)。見表2。

表2 各組給藥后血脂及氧化應(yīng)激水平比較

2.5各組腎臟組織TGF-β1、PI3K、Akt蛋白表達(dá)水平 與正常組相比，模型組TGF-β1、p-PI3K、p-Akt蛋白水平顯著升高，PI3K、Akt顯著下降(P<0.01)；與模型組相比，黃芪甲苷組與西格列汀組TGF-β1蛋白水平無明顯變化(P>0.05)，黃芪甲苷+西格列汀組可顯著降低TGF-β1蛋白表達(dá)(P<0.01，P<0.05)。與模型組比較，黃芪甲苷組PI3K蛋白水平升高，p-Akt蛋白水平降低，而西格列汀組PI3K、Akt蛋白水平均升高，p-PI3K、p-Akt蛋白水平均降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。聯(lián)合給藥組與單獨(dú)給藥組及模型組相比，PI3K、Akt蛋白水平顯著增高，TGF-β1、p-PI3K、p-Akt蛋白水平顯著降低(P<0.05，P<0.01)。見表3和圖1。

表3 各組腎臟組織蛋白表達(dá)水平比較

1～5：正常組，模型組，黃芪甲苷組，西格列汀組，黃芪甲苷+西格列汀組圖1 各組腎臟組織TGF-β1、PI3K、Akt蛋白表達(dá)

3 討 論

T2DM占DM患者的90%～95%，主要是由內(nèi)源性分泌的胰島素?zé)o法完全對抗機(jī)體本身對胰島素的抵抗(IR)引起的〔11〕。胰島素主要通過PI3K/Akt信號通路發(fā)揮調(diào)節(jié)血糖作用的，在機(jī)體進(jìn)食后，胰島β細(xì)胞產(chǎn)生的胰島素釋放入血，影響肝細(xì)胞膜表面的胰島素受體，激活其β受體亞基中的磷酸化酪氨酸〔12〕，然后激活PI3K。Akt被激活后繼續(xù)通過下游分子的生物效應(yīng)發(fā)揮代謝調(diào)節(jié)作用〔13〕。糖尿病腎病(DN)是DM常見的并發(fā)癥，其中約35%的DM患者可發(fā)生腎臟損傷〔14〕。作為“最強(qiáng)的轉(zhuǎn)化因子”的TGF-β1在腎臟中具有高度表達(dá)，也是介導(dǎo)腎小球硬化的主要細(xì)胞因子〔15〕。研究表明，TGF-β1過度表達(dá)，可激活PI3K/Akt信號通路,介導(dǎo)腎小管上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化〔16〕。TGF-β1/PI3K/Akt信號通路出現(xiàn)異常與T2DM及DN的發(fā)生發(fā)展息息相關(guān)。

目前，DM的藥物包括胰島素、二甲雙胍、促胰島素分泌素藥物、胰島素增敏劑等。其中，西格列汀是用于治療T2DM的DPP-4抑制劑，能夠有效降低血糖〔17〕。報道顯示，西格列汀還可以有效保護(hù)DM大鼠腎臟〔18〕，改善腎功能〔19〕，其機(jī)制可能與PI3K/Akt信號通路有關(guān)〔16,20，21〕。臨床上經(jīng)常聯(lián)合使用西藥與含有黃芪的益氣中藥復(fù)方治療DM，而黃芪甲苷是黃芪的主要有效成分之一。馮小南等〔22〕表明黃芪消渴方與胰島素聯(lián)合治療新診斷的T2DM患者臨床療效較好、安全性較高，且患者的依從性比單純的胰島素治療好。劉曙艷等〔23〕研究者發(fā)現(xiàn)黃芪與降壓藥纈沙坦聯(lián)合治療DN，能夠有效降低患者的尿亮氨酸氨基肽酶(LAP)和足細(xì)胞標(biāo)志蛋白(PCX)水平及明顯改善患者的臨床癥狀。然而，對于黃芪甲苷單體聯(lián)合西藥治療DM方面的研究仍然較少，其中的作用機(jī)制仍不清晰。

本研究結(jié)果表明藥物聯(lián)合應(yīng)用的機(jī)制可能是通過共同激活PI3K/Akt通路，進(jìn)一步改善大鼠糖脂代謝及降低氧化應(yīng)激。劉長青等〔24〕的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷聯(lián)合氯沙坦通過提高 PI3K及Akt蛋白的水平，從而改善DM大鼠的氧化應(yīng)激和腎損傷，且聯(lián)合給藥療效同樣優(yōu)于單獨(dú)給藥組，與本實驗的研究結(jié)果相似。不同的是，黃芪甲苷與西格列汀單獨(dú)給藥對TGF-β1蛋白水平無明顯的影響，而聯(lián)合給藥組可以明顯降低其蛋白水平，表明聯(lián)合給藥可能通過抑制TGF-β1表達(dá)，激活了PI3K/Akt通路。劉晨旭等〔14〕報道稱黃芪甲苷在高糖誘導(dǎo)下，能夠抑制腎小球系膜細(xì)胞(MCs)的過度增殖，通過調(diào)控TGF-β1/Smad信號通路保護(hù)大鼠腎臟。研究發(fā)現(xiàn)西格列汀在早期DN應(yīng)用降低血清趨化素(chemerin)與TGF-β1水平，從而改善臨床患者的腎功能。相比之下，本實驗未設(shè)置各給藥組內(nèi)的濃度梯度實驗，因此，黃芪甲苷組與西格列汀單獨(dú)給藥對TGF-β1蛋白水平改變無統(tǒng)計學(xué)意義，可能與藥物濃度低于有效濃度有關(guān)。

綜上，聯(lián)合應(yīng)用西格列汀和黃芪甲苷治療DM療效好，其機(jī)制可能與TGF-β1/PI3K/Akt蛋白信號通路相關(guān)，但具體結(jié)果仍需在臨床上及更全面的基礎(chǔ)實驗中進(jìn)一步證明及探究。