李芳 姚嘉怡 姚建華 曹京旌 寧曉然

(1河北省人民醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，河北 石家莊 050000；2華北理工大學(xué)冀唐學(xué)院中醫(yī)系；3河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院老年病科)

高尿酸血癥(HUA)為一種因尿酸代謝功能障礙引起的慢性代謝疾病，可因尿酸鹽沉積而導(dǎo)致關(guān)節(jié)痛風(fēng)發(fā)作和尿酸性腎結(jié)石，并可引起血管內(nèi)皮功能異常、動(dòng)脈粥樣硬化、血管鈣化等心血管功能異?！?，2〕。研究表明，HUA與腦血管粥樣硬化有著密切聯(lián)系〔3〕，而尿酸誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)是造成腦血管粥樣硬化的主要病理基礎(chǔ)，清除氧自由基，抑制炎癥是對(duì)抗上述血管損傷的一種有效治療方法〔4，5〕。p38絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)/核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB可調(diào)控機(jī)體炎癥及氧化應(yīng)激過程，尿酸可增強(qiáng)p38 MAPK的磷酸化，進(jìn)而激活NF-κB信號(hào)，促使其核轉(zhuǎn)移及促炎因子表達(dá)，誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞炎癥；抑制p38 MAPK/NF-κB激活，可減少活性氧產(chǎn)生，降低炎癥因子表達(dá)，減輕動(dòng)脈血管炎癥損傷，改善動(dòng)脈粥樣硬化〔6，7〕。因此推測(cè)，p38 MAPK/NF-κB信號(hào)是治療HUA大鼠腦血管粥樣硬化的主要作用靶點(diǎn)。非布司他作為一種黃嘌呤氧化酶抑制劑，是臨床中用于治療HUA的一線藥物，可降低尿酸水平，對(duì)于慢性腎病HUA患者療效確切，安全可靠〔8，9〕，但非布司他對(duì)HUA大鼠p38 MAPK/NF-κB通路與其腦血管粥樣硬化的影響，目前還尚未有明確闡述，本文以不同劑量非布司他處理HUA模型大鼠，對(duì)此課題進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)Wistar大鼠購(gòu)自南方醫(yī)科大學(xué)，許可證號(hào)為SCXK(粵)2016-0041，雄性，體重200～220 g。在河北省人民醫(yī)院動(dòng)物房中嚴(yán)格參照《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》飼養(yǎng)，室內(nèi)環(huán)境保持清潔級(jí)，噪音不超過80 dB，通風(fēng)良好，溫度25℃，相對(duì)濕度55%，飼養(yǎng)適應(yīng)1 w后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.1.2試劑與儀器 非布司他片(規(guī)格：40 mg/片)，生產(chǎn)廠家：江蘇萬邦生化醫(yī)藥股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字：H20130058；別嘌醇片(規(guī)格：0.1 g/片)，生產(chǎn)廠家：上海信誼萬象藥業(yè)股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字：H31020334；超氧化物歧化酶(SOD)檢測(cè)試劑盒、丙二醛(MDA)檢測(cè)試劑盒，生產(chǎn)廠家：上海晶抗生物工程有限公司，貨號(hào)：JK-(a)-2293、JK-(a)-2197；兔源p38 MAPK、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)、NF-κB p65、磷酸化(p)-p38 MAPK及增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)一抗、大鼠白細(xì)胞介素(IL)-6及腫瘤壞死因子(TNF)-α酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒、耦聯(lián)辣根過氧化物酶(HRP)的山羊抗兔二抗，生產(chǎn)廠家：美國(guó)Abcam公司，貨號(hào)：ab181602、ab1194、ab16502、ab17942、ab18197、ab100772、ab5603、ab205718；蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒，生產(chǎn)廠家：北京金克隆生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：RS3390；氧嗪酸鉀，生產(chǎn)廠家：上海源葉生物科技有限公司，貨號(hào)：S17112；BCA試劑盒、蛋白裂解液，生產(chǎn)廠家：上海碧云天公司，貨號(hào)：P0011、P0013B等。SHE-3000酶標(biāo)儀，生產(chǎn)廠家：北京賽爾福知心科技有限公司；KEEBIO-600N電泳儀電源、KEEBIO-HE120水平電泳槽、轉(zhuǎn)移電泳槽KEEBIO-VE186，生產(chǎn)廠家：上海金鵬分析儀器有限公司；SD-1全自動(dòng)生化分析儀，生產(chǎn)廠家：成都斯馬特科技有限公司；HM355S全自動(dòng)輪轉(zhuǎn)式石蠟切片機(jī)，生產(chǎn)廠家：上海涵飛醫(yī)療器械有限公司；37XF-PC倒置生物顯微鏡，生產(chǎn)廠家：上海永亨光學(xué)儀器制造公司；WD-9413B化學(xué)凝膠成像儀，生產(chǎn)廠家：濟(jì)南來寶醫(yī)療器械有限公司等。

1.2方法

1.2.1大鼠HUA模型制備及分組給藥 遵循文獻(xiàn)〔10〕中方法，將氧嗪酸鉀溶于蒸餾水中，并拌入大鼠飼料中，使氧嗪酸鉀占飼料的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%。然后以2%的氧嗪酸鉀飼料喂養(yǎng)65只大鼠，6 w后進(jìn)行血清尿酸水平檢測(cè)，當(dāng)明顯高于正常飼料喂養(yǎng)大鼠時(shí)，即表明HUA模型構(gòu)建成功，共成功構(gòu)建模型60只，隨機(jī)分為M組、FX-L組、FX-M組、FX-H組、Allo組，每組12只模型大鼠，另取12只大鼠以正常飼料喂養(yǎng)同樣時(shí)間，設(shè)為NC組。

以生理鹽水溶解非布司他片及別嘌醇片，配制為0.1、0.2、0.4 mg/ml的非布司他〔11〕溶液和2.4 mg/ml的別嘌醇〔12〕溶液，F(xiàn)X-L組、FX-M組、FX-H組與Allo組大鼠分別以上述溶液10 ml/kg的劑量灌胃，M組和NC組以10 ml/kg的生理鹽水灌胃，每天1次，持續(xù)21 d。

1.2.2標(biāo)本采集及腦血管病理形態(tài)檢測(cè) 末次用藥后24 h，吸入乙醚麻醉大鼠，解剖、開腹，經(jīng)腹主動(dòng)脈取血3 ml，4℃，3 000 r/min，離心15 min，吸出上清即能得到各組血清，于-80℃冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆?；將各組大鼠斷頭取出大腦，分離動(dòng)脈血管，剪取約0.5 cm漂洗后，置于4%多聚甲醛溶液中固定，剩余血管儲(chǔ)存在液氮中備用。將固定后的腦血管組織依次浸入75%、90%、95%、100%濃度的梯度酒精中進(jìn)行脫水，取出切片浸入二甲苯中孵育透明后置于熱石蠟中包埋，將得到的石蠟組織塊放入切片機(jī)中做常連續(xù)切片，得到厚度約為5 μm的切片備用。

1.2.3大鼠血清尿酸、TNF-α及IL-6水平測(cè)定和腦血管組織中氧化應(yīng)激水平檢測(cè) 將1.2.2中儲(chǔ)存于-80℃冰箱中的血清置于冰水浴中解凍，以全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)其中尿酸含量，參照ELISA試劑盒說明書的操作步驟測(cè)定其中TNF-α、IL-6含量。

分別將1.2.2中的各組腦血管組織剪碎，與蛋白裂解液混勻后勻漿，每個(gè)樣品取出一半勻漿液提取總蛋白，剩余一半勻漿液提取核內(nèi)蛋白，運(yùn)用BCA法分別測(cè)定總蛋白和核內(nèi)蛋白濃度，步驟具體參照制造商說明書指導(dǎo)操作，每組各取500 μl總蛋白樣品液，使用檢測(cè)試劑盒并遵照其制造商說明書指導(dǎo)測(cè)得其中SOD、MDA水平，剩下的總蛋白和核內(nèi)蛋白樣品液后續(xù)做蛋白表達(dá)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4腦血管組織p38 MAPK/NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)檢測(cè)1.2.3中剩余的蛋白樣品液，根據(jù)蛋白濃度測(cè)定結(jié)果將其調(diào)至各組相同，每組總蛋白和核內(nèi)蛋白樣品液各取15 μl，變性蛋白后上樣跑十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，通過濕轉(zhuǎn)將分離膠中全部蛋白移至PVDF膜，將膜浸入5%脫脂奶粉溶液中室溫孵育2 h，對(duì)蛋白非特異抗原進(jìn)行封閉處理，然后分別以兔源GAPDH、p38 MAPK、p-p38 MAPK、NF-κB p65、PCNA一抗溶液4℃孵育過夜，稀釋比例均為1：2 000，TBST漂洗3次后將各蛋白膜浸入耦聯(lián)HRP的山羊抗兔二抗溶液(稀釋比例為1∶1 000)，室溫孵育2 h后TBST漂洗3次，于膜上滴加增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑對(duì)顯色蛋白條帶，在凝膠成像儀中采集各組蛋白條帶圖像，并運(yùn)用Image-J軟件分析圖片，定量各組蛋白灰度值后量化得到其相對(duì)表達(dá)量。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用軟件SPSS26.0進(jìn)行單因素方差分析、LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1非布司他對(duì)大鼠血清尿酸的影響 與NC組相比，M組血清尿酸明顯升高(P<0.05)；與M組相比，F(xiàn)X-L、FX-M、FX-H組及Allo組血清尿酸明顯降低(P<0.05)，且FX-L、FX-M、FX-H組之間呈劑量依賴性(P<0.05)；FX-H組與Allo組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

2.2非布司他對(duì)大鼠血清中TNF-α與IL-6水平的影響 與NC組相比，M組血清中TNF-α與IL-6水平明顯增高(P<0.05)；與M組相比，F(xiàn)X-L、FX-M、FX-H組及Allo組大鼠血清中TNF-α與IL-6水平顯著降低(P<0.05)，且FX-L、FX-M、FX-H組之間呈劑量依賴性(P<0.05)；FX-H組與Allo組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

2.3非布司他對(duì)大鼠腦血管組織氧化應(yīng)激的影響 與NC組相比，M組腦血管組織SOD水平顯著降低(P<0.05)，MDA水平顯著升高(P<0.05)；與M組相比，F(xiàn)X-L、FX-M、FX-H組及Allo組大鼠腦血管組織SOD水平均升高，MDA水平均降低，且FX-L、FX-M、FX-H組之間呈劑量依賴性(P<0.05)；FX-H組與Allo組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 各組血清尿酸、TNF-α、IL-6、SOD、MDA水平及腦血管組織p38 MAPK/NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較

2.4非布司他對(duì)大鼠腦動(dòng)脈血管病理形態(tài)的影響 NC組腦動(dòng)脈血管形態(tài)完好清晰，無損傷；M組腦動(dòng)脈可見血管平滑肌細(xì)胞增生，內(nèi)膜增厚，腔內(nèi)可見向里凸起的斑塊，并發(fā)生變性壞死，血管壁損傷等病理損傷；與M組相比，F(xiàn)X-L、FX-M、FX-H組及Allo組腦動(dòng)脈血管上述病理損傷減輕，且隨非布司他劑量升高而逐漸減輕；FX-H組與Allo組相比，腦動(dòng)脈血管上述病理損傷減輕程度無明顯差異，見圖1。

圖1 各組腦動(dòng)脈血管HE染色結(jié)果(×200)

2.5非布司他對(duì)大鼠腦血管組織p38 MAPK/NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與NC組相比，M組腦血管組織p38 MAPK/NF-κB通路相關(guān)蛋白p-p38 MAPK/p38 MAPK、核內(nèi)NF-κB p65表達(dá)明顯增高(P<0.05)；與M組相比，F(xiàn)X-L、FX-M、FX-H組及Allo組大鼠腦血管組織p-p38 MAPK/p38 MAPK、核內(nèi)NF-κB p65表達(dá)明顯降低(P<0.05)，且FX-L、FX-M、FX-H組之間呈劑量依賴性(P<0.05)；FX-H組與Allo組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1、圖2。

圖2 免疫印跡檢測(cè)各組大鼠腦血管組織p38 MAPK/NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)

3 討 論

近年來，隨著社會(huì)發(fā)展及生活水平的提高，人們膳食結(jié)構(gòu)發(fā)生很大改變，HUA的患病率隨之明顯增加，且患者呈明顯年輕化趨勢(shì)〔13，14〕。研究發(fā)現(xiàn)，尿酸可減少一氧化氮(NO)合成，誘導(dǎo)炎癥及氧化應(yīng)激反應(yīng)，損傷血管，促使血管鈣化，最終導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化，是引發(fā)心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素〔15，16〕。本文結(jié)果表明高血酸可引發(fā)嚴(yán)重的炎癥及氧化應(yīng)激反應(yīng)，損傷HUA大鼠腦動(dòng)脈血管。

非布司他是一種黃嘌呤氧化酶抑制劑，可通過減少血清尿酸含量達(dá)到治療HUA的目的，對(duì)尿酸性腎病患者有明顯腎臟保護(hù)作用，能明顯改善其腎動(dòng)脈粥樣硬化程度，還可減輕痛風(fēng)患者關(guān)節(jié)炎癥狀〔2，17〕，但非布司他對(duì)腦血管粥樣硬化的影響，鮮有報(bào)道。別嘌醇是臨床及基礎(chǔ)研究中探索HUA治療方法及機(jī)制的常用陽性對(duì)照藥。本文結(jié)果表明非布司他可減少HUA大鼠血清尿酸含量，抑制炎癥發(fā)生發(fā)展，降低氧化應(yīng)激水平，減輕腦動(dòng)脈血管損傷，改善腦血管粥樣硬化癥狀，并隨劑量升高而作用增強(qiáng)。

p38 MAPK/NF-κB是機(jī)體內(nèi)調(diào)控細(xì)胞遷移、增殖、衰老及凋亡、炎癥、脂質(zhì)過氧化反應(yīng)等生理病理過程的重要信號(hào)，在急性呼吸窘迫綜合征大鼠肺組織中，處于激活狀態(tài)，此時(shí)，p38 MAPK發(fā)生磷酸化，NF-κB大量轉(zhuǎn)入核內(nèi)，介導(dǎo)下游炎癥因子表達(dá)，促使炎癥進(jìn)展，加重肺組織損傷，而阻滯p38 MAPK/NF-κB傳導(dǎo)，可抑制炎癥反應(yīng)，減輕肺組織損傷〔18〕。另外p38 MAPK/NF-κB信號(hào)還可介導(dǎo)尿酸誘導(dǎo)的血管組織炎癥及過氧化損傷過程，抑制該信號(hào)傳導(dǎo)，可阻止炎癥與過氧化反應(yīng)發(fā)生與發(fā)展，減輕動(dòng)脈血管粥樣硬化癥狀〔6，7，19〕。本文結(jié)果表明p38 MAPK/NF-κB參與介導(dǎo)HUA大鼠腦血管粥樣硬化病理過程，非布司他可下調(diào)該信號(hào)表達(dá)，降低血清尿酸水平，改善HUA大鼠腦血管粥樣硬化癥狀。

綜上，非布司他可抑制尿酸合成，減輕p38 MAPK磷酸化，阻止NF-κB p65核轉(zhuǎn)移，降低炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-6合成分泌，抑制炎癥及氧化應(yīng)激發(fā)生發(fā)展，減輕腦血管病理損傷，緩解HUA大鼠腦血管粥樣硬化癥狀，阻滯p38 MAPK/NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)可能是其藥理機(jī)制之一。但本文只進(jìn)行了初步研究，證據(jù)效力不足，還需通過使用p38 MAPK/NF-κB信號(hào)激活劑和抑制劑來進(jìn)行對(duì)照驗(yàn)證。