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馬錢苷對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷神經(jīng)保護(hù)作用及Wnt/β-catenin通路的影響

2022-09-25 11:33:24王璐付蓉巫玉娟
中國老年學(xué)雜志 2022年18期
關(guān)鍵詞:尼莫地平腦組織引物

王璐 付蓉 巫玉娟

(貴陽市第二人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,貴州 貴陽 550018)

腦卒中是全球死亡和殘疾的主要原因之一,對于缺血性腦卒中患者,在發(fā)病后3.0~4.5 h內(nèi)給予組織纖溶酶原激活劑治療是最有效的方法之一,然而,恢復(fù)缺血大腦的血流可能會導(dǎo)致缺血再灌注(I/R)損傷,對缺血大腦造成更嚴(yán)重的傷害〔1〕。因此,迫切需要進(jìn)行探索性研究,以發(fā)現(xiàn)改善或預(yù)防腦I/R損傷的藥物,尼莫地平是目前常用藥物。中藥歷史悠久,已廣泛用于亞洲許多國家和地區(qū),如補(bǔ)陽還五湯和腦栓通等在實(shí)驗動物模型中顯示出有益反應(yīng),可減輕I/R損傷〔2〕。馬錢苷是從山茱萸中提取的主要有效成分,具有較強(qiáng)的抗炎和抗氧化能力。研究顯示,山茱萸提取物對缺血性腦損傷大鼠具有神經(jīng)保護(hù)作用,但馬錢苷對I/R損傷的作用研究較少〔3〕。研究發(fā)現(xiàn),腦卒中后神經(jīng)系統(tǒng)功能的重建涉及許多蛋白質(zhì)和信號通路,其中Wnt/β-連環(huán)蛋白(β-catenin)信號通路參與腦缺血后的神經(jīng)發(fā)生和功能恢復(fù),阻斷Wnt信號通路可抑制大鼠神經(jīng)祖細(xì)胞(NPC)的增殖和分化〔4〕。β-catenin是Wnt信號通路的關(guān)鍵下游介質(zhì),它激活涉及中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元存活和體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的多個靶基因〔5〕。研究表明,刺激Wnt/β-catenin通路可誘導(dǎo)缺血損傷后神經(jīng)元分化和存活的神經(jīng)源性環(huán)境〔6〕。此外,激活肝臟Wnt/β-catenin通路可通過改善氧化應(yīng)激和抑制促炎性細(xì)胞因子的釋放來減輕I/R損傷〔7〕。因此,Wnt/β-catenin通路是I/R治療的一個很好的潛在靶點(diǎn)。本研究探討馬錢苷對大鼠局灶性I/R的神經(jīng)保護(hù)作用,同時探討Wnt/β-catenin通路在該過程中的作用。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗動物 SPF級成年SD雄性大鼠購自重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗動物中心,8~10周齡,體重(230±20)g,動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(渝)2019-0003,動物使用許可證號:SYXK(渝)2019-0016,動物質(zhì)量合格證號:HR2019001746,在環(huán)境溫度(23±2)℃,相對濕度60%~70%,光照12 h明暗交替的環(huán)境中飼養(yǎng),適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后進(jìn)行實(shí)驗。

1.2主要試劑與儀器 馬錢苷(原料藥,純度99%,成都瑞芬思生物科技有限公司,批號:M-010-160516);尼莫地平片(上海世康特制藥有限公司,規(guī)格30mg,批號:20191225);戊巴比妥鈉(上海上藥新亞藥業(yè)有限公司,批號:SC-6017);2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染液(中生北控生物科技有限公司,批號:QM30217S);大鼠丙二醛(MDA)和谷胱甘肽(GSH)酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測試劑盒(上海生工生物工程有限公司,批號:SK039、YT297);Trizol試劑盒、PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR? Premix Ex TaqTM熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)試劑盒(大連寶生物工程有限公司,批號:DRR152A、DRR047A、DRR041A);HBS-1096B型酶標(biāo)儀(南京德鐵實(shí)驗設(shè)備有限公司);CFX96型實(shí)時熒光定量PCR儀(美國BD公司)。

1.3造模、分組及給藥 采用線栓法制備大鼠腦I/R模型:大鼠禁食12 h后用3%戊巴比妥鈉(300 mg/kg)進(jìn)行麻醉后分離勁總動脈、頸內(nèi)動脈和頸外動脈,結(jié)扎頸外動脈遠(yuǎn)端后,在頸外動脈上切開一個小切口,將一條絲線插入頸內(nèi)動脈約20 mm,并結(jié)扎,2 h后拔出絲線,以重新供應(yīng)血流制備再灌注模型〔8〕。將造模成功的48只大鼠按隨機(jī)數(shù)表法分為模型組、馬錢苷低劑量組、馬錢苷高劑量組和尼莫地平組,每組12只;另取12只大鼠作為假手術(shù)組,假手術(shù)組只分離血管不進(jìn)行阻塞血流。造模成功2 h后,假手術(shù)組和模型組灌胃生理鹽水(10 ml/kg);馬錢苷低劑量組和馬錢苷高劑量組分別灌胃50 mg/kg和100 mg/kg馬錢苷〔9〕(將馬錢苷和生理鹽水配制成濃度分別為5 mg/ml和10 mg/ml的溶液,灌胃體積10 ml/kg);尼莫地平組灌胃20 mg/kg尼莫地平〔10〕(將尼莫地平和生理鹽水配制成濃度為2 mg/ml的溶液,灌胃體積10 ml/kg),1次/d,連續(xù)給藥7 d。

1.4神經(jīng)運(yùn)動功能評分〔11〕末次給藥后1 h對大鼠的神經(jīng)運(yùn)動功能進(jìn)行評估:5分:完全無法走路;4分:無法自發(fā)行走和失去知覺;3分:走路時向內(nèi)傾斜;2分:走路時向內(nèi)旋轉(zhuǎn);1分:前爪無法完全伸展;0分:無神經(jīng)功能障礙癥狀。

1.5腦梗死體積百分比測定 采用脊髓脫臼法處死大鼠,取完整腦組織,將大鼠腦組織行冠狀位切片(2 mm),2%的TTC染液染色30 min,用Image Pro Plus6.0軟件測定腦梗死體積,計算腦梗死體積百分比,腦梗死體積百分比=腦梗死體積/完整腦組織體積×100%。

1.6ELISA檢測腦組織中MDA和GSH水平 取一塊腦組織,用磷酸鹽緩沖液洗滌2次,用研缽將腦組織研碎,離心取上清,根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行MDA和GSH水平測定。

1.7實(shí)時熒光定量-PCR(qRT-PCR)檢測腦組織中Wnt、β-catenin、神經(jīng)元生成素(Ngn)2、B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相關(guān)X 蛋白(Bax)mRNA水平測定 制成腦組織勻漿,加入Trizol試劑進(jìn)行總RNA的提取,用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。Wnt、β-catenin、Ngn2、Bcl-2、Bax和GAPDH引物由大連TaKaRa公司設(shè)計并合成,引物序列,Wnt正向引物:5′-TTCTGAGGAAGAACAGCATGAA-3′,反向:5′-CCTTTTGGAGTCTGACCATTTC-3′;β-catenin正向引物:5′-CTGCTAACTGACCAAAATGACG-3′,反向:5′-AACAGTGGGTAGGTATGATGGC-3′;Ngn2正向引物:5′-AGCGTCAACAGGGAGATG-3′,反向:5′-CTTCAGAGACAGCCAGGAG-3′;Bcl-2正向引物:5′-GGGAGGATTGTGGCCTTCTT-3′,反向:5′-TGTGCAGGTGCCGGTTCAG-3′;Bax正向引物:5′-ATCATGGGCTGGACATTGGA-3′,反向:5′-ACAGGGACATCAGTCGCTTCA-3′;GAPDH正向引物:5′-GCCAAGGCTGTGGGCAAGGT-3′,反向:5′-TCTCCAGGCGGCACGCAGA-3′。制備25 μl反應(yīng)體系,包括:SYBR? Premix Ex Taq 12.5 μl、正向引物1 μl、反向引物1 μl、cDNA模板2 μl、焦碳酸二乙酯(DEPC)水8.5 μl。在95℃預(yù)變性1 min,95℃變性30 s,58℃退火5 s,共30個循環(huán),72℃延伸5 s條件下進(jìn)行擴(kuò)增,以GAPDH作為內(nèi)參,采用 2-△△Ct法計算Wnt、β-catenin、Ngn2、Bcl-2、Bax mRNA的相對表達(dá)量。

1.8統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS24.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、SNK-q檢驗。

2 結(jié) 果

2.1各組神經(jīng)運(yùn)動功能評分和腦梗死體積百分比比較 與假手術(shù)組相比,其余各組神經(jīng)運(yùn)動功能評分和腦梗死體積百分比均顯著升高(P<0.05);與模型組相比,馬錢苷各劑量組和尼莫地平組神經(jīng)運(yùn)動功能評分和腦梗死體積百分比顯著降低(P<0.05),且馬錢苷高劑量組神經(jīng)運(yùn)動功能評分和腦梗死體積百分比顯著低于馬錢苷低劑量組(P<0.05);但馬錢苷各劑量組作用效果顯著差于尼莫地平組(P<0.05)。見表1。

表1 各組神經(jīng)運(yùn)動功能評分和腦梗死體積百分比比較

2.2各組腦組織中MDA和GSH水平比較 與假手術(shù)組相比,其余各組腦組織中MDA水顯著升高,GSH水平顯著降低(P<0.05);與模型組相比,馬錢苷各劑量組和尼莫地平組腦組織中MDA水平顯著降低,GSH水平顯著升高(P<0.05),且馬錢苷高劑量組腦組織中MDA水平顯著低于馬錢苷低劑量組,GSH水平顯著高于馬錢苷低劑量組(P<0.05);但馬錢苷各劑量組作用效果顯著差于尼莫地平組(P<0.05)。見表2。

表2 各組腦組織中MDA和GSH水平比較

2.3各組腦組織中Wnt、β-catenin、Ngn2 mRNA水平比較 與假手術(shù)組相比,其余各組腦組織中Wnt、β-catenin、Ngn2 mRNA水平顯著降低(P<0.05);與模型組相比,馬錢苷各劑量組和尼莫地平組腦組織中Wnt、β-catenin、Ngn2 mRNA水平顯著升高(P<0.05),且馬錢苷高劑量組腦組織中Wnt、β-catenin、Ngn2 mRNA水平顯著高于馬錢苷低劑量組(P<0.05);但馬錢苷各劑量組作用效果顯著差于尼莫地平組(P<0.05)。見表3。

表3 各組腦組織中Wnt、β-catenin、Ngn2 mRNA水平比較

2.4各組腦組織中Bcl-2、Bax mRNA及Bcl-2/Bax水平比較 與假手術(shù)組相比,其余各組腦組織中Bcl-2 mRNA和Bcl-2/Bax水平顯著降低,Bax mRNA水平顯著升高(P<0.05);與模型組相比,馬錢苷各劑量組和尼莫地平組腦組織中Bcl-2 mRNA和Bcl-2/Bax水平顯著升高,Bax mRNA水平顯著降低(P<0.05),且馬錢苷高劑量組腦組織中Bcl-2 mRNA和Bcl-2/Bax水平顯著高于馬錢苷低劑量組,Bax mRNA水平顯著低于馬錢苷低劑量組(P<0.05);但馬錢苷各劑量組的作用效果顯著差于尼莫地平組(P<0.05)。見表4。

表4 各組腦組織中Bcl-2、Bax mRNA及Bcl-2/Bax水平比較

3 討 論

山茱萸是一種傳統(tǒng)的中藥制劑,其提取物已廣泛用于腦血管疾病研究。馬錢苷是山茱萸的主要活性成分,已有研究證實(shí),馬錢苷通過抗炎和抗氧化作用對神經(jīng)損傷具有保護(hù)作用〔12〕。因為抗氧化劑可以保護(hù)嚙齒類動物腦缺血中的Wnt/β-catenin通路,保護(hù)NPC的丟失并恢復(fù)海馬體在面對全腦輻射時受損的神經(jīng)發(fā)生,所以馬錢苷的神經(jīng)保護(hù)和神經(jīng)發(fā)生促進(jìn)作用可能部分取決于它的抗氧化能力〔13〕。

Wnt/β-catenin通路在許多細(xì)胞事件的調(diào)節(jié)中很重要,包括預(yù)防細(xì)胞凋亡及促進(jìn)細(xì)胞再生。在腦組織中,Wnt/β-catenin通路不僅有助于促進(jìn)神經(jīng)元存活,而且與神經(jīng)膠質(zhì)增殖有關(guān)〔14〕。研究表明,在I/R損傷后,Wnt/β-catenin激動劑氯化鋰的給藥對學(xué)習(xí)和記憶引起神經(jīng)保護(hù)作用〔15〕。相反,缺血性腦卒中后,Wnt/β-catenin通路的拮抗劑Dickkopf(DKK)-1在缺血核心和半影區(qū)的神經(jīng)元中被顯著誘導(dǎo),并加劇神經(jīng)元的損害〔16〕。另外,通過小干擾RNA使β-catenin失活會增加成年大鼠腦卒中誘發(fā)的梗死體積〔17〕。因此,在腦缺血中激活Wnt/β-catenin通路可能是一個保護(hù)性靶點(diǎn)。Wnt蛋白廣泛分布在整個大腦中,是細(xì)胞外因子,在發(fā)育和成熟的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中起關(guān)鍵作用。經(jīng)典的Wnt信號通路是通過激活其跨膜受體卷曲蛋白(Frizzled)和低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白(LRP)-5/6,導(dǎo)致散亂蛋白(Dvl)的激活。Dvl作為細(xì)胞質(zhì)橋接分子,與β-catenin降解復(fù)合物(axin/GSK-3/APC)成員互激活,導(dǎo)致復(fù)合物解離,使β-catenin產(chǎn)生抗性,細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的β-catenin穩(wěn)定并進(jìn)入細(xì)胞核,并與轉(zhuǎn)錄因子(尤其是T細(xì)胞因子和淋巴增強(qiáng)因子)結(jié)合,以調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄〔18〕。Ngn2已被證明是Wnt /β-Catenin信號傳導(dǎo)中重要的神經(jīng)發(fā)生促進(jìn)因子,促進(jìn)海馬神經(jīng)母細(xì)胞的分化〔19〕。本研究發(fā)現(xiàn),馬錢苷可增加局灶性I/R大鼠腦組織中Wnt、β-catenin、Ngn2 mRNA的表達(dá),從而促進(jìn)I/R后的神經(jīng)發(fā)生。

易位到細(xì)胞核中的β-catenin,可以激活特定基因的表達(dá),如Bcl-2和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF),從而抑制細(xì)胞凋亡。β-catenin通過直接調(diào)控Bcl-2表達(dá)和以磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AkB)依賴的方式間接抑制Bax來抑制細(xì)胞凋亡〔20〕。由于Bcl-2/Bax活性對于細(xì)胞凋亡機(jī)制的激活/失活至關(guān)重要,因此這些蛋白很可能會參與I/R的發(fā)病機(jī)制〔21〕。Bcl-2通過阻止細(xì)胞色素C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)而具有抗凋亡作用,Bcl-2也中和Bax,防止它破壞線粒體膜。Bcl-2/Bax比值的增加或減少具有抗或促凋亡作用。缺血引起腦組織中Bcl-2水平降低和Bax表達(dá)增加,從而導(dǎo)致病變區(qū)域神經(jīng)元丟失〔22〕。與上述研究一致,本研究結(jié)果表明馬錢苷在缺血性腦卒中中具有抗凋亡的潛力。

綜上,馬錢苷可改善局灶性I/R大鼠神經(jīng)功能缺損,其機(jī)制可能與馬錢苷激活Wnt/β-catenin通路有關(guān)。

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