樊楚明 茹金 任靖宇 楊曉華 楊金偉 陳慶寧

(云南省第一人民醫(yī)院 1重癥醫(yī)學(xué)科，云南 昆明 650032；2普外二科；3皮膚科)

多黏菌素(PM)是從多粘桿菌培養(yǎng)液中分離出的一種多肽類抗生素，根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)的不同，分為A、B、C、D、E 5種，PME曾被用于治療革蘭陰性菌感染，因?yàn)槟I毒性被棄用〔1〕。隨著多耐藥革蘭陰性菌(尤其是銅綠假單胞菌和鮑曼不動(dòng)桿菌)的出現(xiàn)，新代抗生素的更新速度緩慢，PME的應(yīng)用受到臨床關(guān)注〔2〕。三七總皂苷(PNS) 是從三七中提取的有效生物成分，已有研究報(bào)道了其在免疫、心血管、內(nèi)分泌及中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的藥理作用〔3～6〕，PNS可能通過抑制線粒體途徑減少腎毒性。動(dòng)物研究表明，PNS能有效發(fā)揮治療腎小管間質(zhì)纖維化的作用〔7〕。本研究旨在探討PNS減弱PME誘導(dǎo)的小鼠腎毒性機(jī)制。

1 資料和方法

1.1體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

1.1.1動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 雌性昆明小鼠購自中國科學(xué)院上海藥物研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心〔生產(chǎn)許可SCXK：(滬)2019-0001；使用許可號(hào)：(滬)2019-0032〕，6～8周齡，體重18～20 g，SPF級(jí)。所有小鼠于SPF級(jí)動(dòng)物房適應(yīng)1 w后方可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將小鼠隨機(jī)分為4組，每組6只。對(duì)照組：肌肉注射生理鹽水(200 μl)；PNS組：肌肉注射PNS(10 mg/kg)；PME組：肌肉注射PME(15 mg/kg)；PNS+PME組：肌肉注射PNS(10 mg/kg)+ PME(15 mg/kg)。所有小鼠每天進(jìn)行2次肌肉注射，注射時(shí)間間隔≥8 h，連續(xù)2 w。實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)時(shí)，4%水合氯醛麻醉后心臟采血，處死后收集并保存小鼠雙腎進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。小鼠血液樣本離心(2 000 r/min，5 min)，取上層血清-80℃保存?zhèn)溆谩１狙芯咳〉冕t(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，倫理批號(hào)：2018LH095。

1.1.2評(píng)估指標(biāo) (1)實(shí)驗(yàn)期間，每天對(duì)小鼠稱重并記錄，實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)稱量小鼠雙腎質(zhì)量，計(jì)算腎系數(shù)，腎系數(shù)=(腎臟質(zhì)量/體重)×100%。(2)腎功能相關(guān)指標(biāo)：取小鼠血液上清，采用全自動(dòng)生化儀測(cè)定腎功能指標(biāo)：血尿素氮(BUN)、肌酐(CRE)。(3)腎臟組織氧化應(yīng)激指標(biāo)：取出小鼠的腎臟組織，研磨器手工研磨，加入冷生理鹽水制成勻漿，離心(3 500 r/min，10 min)，取上清液，檢測(cè)超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)及谷胱甘肽過氧化酶(GSH-PX)。(4) 腎臟組織病理學(xué)改變?nèi)⌒∈竽I臟組織，經(jīng)10%甲醛固定，包埋、切片后，蘇木素-伊紅(HE)染色后在顯微鏡下觀察組織病理學(xué)變化。

1.2體外實(shí)驗(yàn)

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 小鼠腎小管上皮細(xì)胞(TCMK)-1購自美國模式培養(yǎng)物集存庫(ATCC)。在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置于5%CO2、37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后分別加入各組。對(duì)照組：不加任何其他物質(zhì)。PME組：加入不同濃度的PME，根據(jù)PME濃度的不同分為不同的亞組，PME25組：PME處理濃度為25 μg/ml；PME50組：PME處理濃度為50 μg/ml；PME100組：PME處理濃度為100 μg/ml；PME200組：PME處理濃度為200 μg/ml；PME400組：PME處理濃度為400 μg/ml。PNS+PME組：加入同一濃度PME的同時(shí)(100 μg/ml)，加入不同濃度的PNS，根據(jù)PNS濃度的不同分為不同的亞組，PNS0組：PNS處理濃度為0 μg/ml；PNS25組：PNS處理濃度為25 μg/ml；PNS50組：PNS處理濃度為50 μg/ml；PNS100組：PNS處理濃度為100 μg/ml；PNS200組：PNS處理濃度為200 μg/ml。加入不同物質(zhì)后繼續(xù)培養(yǎng)12 h，檢測(cè)評(píng)估指標(biāo)。

1.2.2評(píng)估指標(biāo) (1)細(xì)胞活性采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活性，CCK-8試劑盒購自日本同仁化學(xué)，按照說明書操作，計(jì)算細(xì)胞活性率。(2)細(xì)胞凋亡率采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，Annexin V-FITC凋亡檢測(cè)試劑盒購自美國BD Pharmingen。收集細(xì)胞(1×105個(gè)細(xì)胞)用不含乙二胺四乙酸(EDTA)的胰酶消化后，用PBS洗滌后加入Annexin V-FITC，避光、室溫孵育15 min后加入碘化丙啶，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。(3)細(xì)胞活性氧簇(ROS)生成采用氧化敏感的氟探針2′，7′-二氯熒光素二乙酸鹽(DCFH-DA，試劑盒購自中國大連美侖生物)。棄去細(xì)胞培養(yǎng)液加入DCFH-DA，室溫孵育30 min，收集細(xì)胞，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)二氯熒光素陽性細(xì)胞。(4)氧化應(yīng)激指標(biāo)的檢測(cè)收集細(xì)胞，離心(5 000 r/min，5 min)，收集上清，分別采用SOD、MDA和GSH-Px試劑盒分別檢測(cè)SOD、MDA和GSH-Px水平。(5)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶(caspase)mRNA的檢測(cè)。收集細(xì)胞，采用TRIZOL法提取細(xì)胞RNA，反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測(cè)caspase-3、caspase-9的mRNA含量。caspase-3-正義鏈：5′-CCGGAGTCTGACTGGAAAGCC-3′；caspase-3-反義鏈：5′-GCATACAGGAAGTCGGCCTCC-3′;caspase-9-正義鏈：5′-ATACACCCTGGACTCGGATCC-3′；caspase-9-反義鏈：5′-TGCTGAAGCTTCTCACAGTCC-3′。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，作圖采用Graphpad prism6.0進(jìn)行作圖分析。

2 結(jié) 果

2.1體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

2.1.1各組體重變化 對(duì)照組和PNS組體重增長平緩，PME組體重在試驗(yàn)期間無顯著變化，PNS和PME共同處理小鼠7 d內(nèi)體重增長較慢，7～14 d內(nèi)體重增長加快，見表1。

表1 各組小鼠體重變化

2.1.2各組腎功能指標(biāo)比較 PME組腎系數(shù)、BUN、CRE均顯著大于其他3組(P<0.05)，PNS+PME組各項(xiàng)腎功能指標(biāo)均接近對(duì)照組正常腎功能指標(biāo)，見表2。

表2 各組腎功能及腎組織氧化性損傷指標(biāo)的比較

2.1.3各組腎組織氧化性損傷 PME組腎組織中SOD及GSH-Px水平均顯著小于其他3組，MDA值顯著大于其他3組(P<0.05)，見表2。

2.1.4各組腎臟組織病理學(xué)變化 不同處理組小鼠腎臟組織切片，PNS組腎臟組織無明顯異常，PME組可見腎小管擴(kuò)張、水腫，間質(zhì)增大，炎性細(xì)胞浸潤，管型形成，伴有輕微的腎小管上皮細(xì)胞壞死等。經(jīng)PNS+PME處理的小鼠，腎臟組織有了明顯的改善，但仍有輕微的腎小管擴(kuò)張、水腫，見圖1。

圖1 各組腎臟組織病理學(xué)變化(HE染色，×200)

2.2體外實(shí)驗(yàn)

2.2.1PME 作用于TCMK-1細(xì)胞活性變化以對(duì)照組細(xì)胞活性率作為參照(100%)，不同PME濃度對(duì)細(xì)胞活性的影響不同，隨著PME濃度的升高，細(xì)胞活性逐漸降低，PME25組細(xì)胞活性為(112.42±9.17)%、PME50組細(xì)胞活性為(104.28±8.87)%、PME100組細(xì)胞活性為(82.64±7.80)%、PME200組細(xì)胞活性為(59.62±8.13)%、PME400組細(xì)胞活性為(59.55±8.06)%。

2.2.2PNS對(duì)PME處理細(xì)胞活性、氧化應(yīng)激及caspase活性的影響 經(jīng)同一濃度PME和不同PNS濃度處理的細(xì)胞，隨著PNS濃度的增加，細(xì)胞活性逐漸上升，凋亡率逐漸下降；隨著PNS濃度的增加，ROS、MDA逐漸減小，與對(duì)照組間的差距越來越小，SOD、GSH-Px逐漸增大，與對(duì)照組間的距離越來越小；隨著PNS濃度的增加，細(xì)胞凋亡相關(guān)基因caspase-3、caspase-9 mRNA含量均逐漸減小，與對(duì)照組間的距離越來越小，見表3。

表3 PNS對(duì)PME處理細(xì)胞細(xì)胞活性、氧化應(yīng)激及caspase活性的影響

3 討 論

近年來，細(xì)菌耐藥性問題越來越普遍，但是新的抗生素開發(fā)速度緩慢，尤其是多耐藥革蘭陰性菌如鮑曼不動(dòng)菌的出現(xiàn)，已成為臨床亟待攻克的難關(guān)。傷口感染、尿路感染、敗血癥及呼吸系統(tǒng)疾病病例數(shù)目越來越龐大，PME的使用愈發(fā)廣泛，但是PME導(dǎo)致的腎毒性發(fā)生率高達(dá)60%，嚴(yán)重限制了其臨床應(yīng)用〔8〕。PME導(dǎo)致的腎毒性機(jī)制目前尚缺乏明確的結(jié)論，但是研究〔9，10〕表明，氧化損傷加劇及caspase介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)通路被激活與腎毒性的發(fā)生機(jī)制有關(guān)。本研究結(jié)果表明PME有腎毒性作用，PNS可有效緩解PME導(dǎo)致的腎毒性作用。

有研究〔11〕表明，PNS主要成分包括三七皂苷、人參皂苷Rg1及人參皂苷Rb1。三七皂苷可減輕大鼠的腎臟缺血再灌注損傷，人參皂苷可發(fā)揮抑制氧化應(yīng)激作用，人參皂苷Rb1通過抑制絲裂原激活的蛋白激酶、激活胱天蛋白酶達(dá)到減緩他克莫司引起的腎毒性〔12〕。本研究結(jié)果表明，PME誘導(dǎo)的小鼠腎功能損傷，同時(shí)接受PNS處理后，其腎功能指標(biāo)顯著改善，與文獻(xiàn)〔13〕結(jié)論一致。氧化應(yīng)激指的是抗氧化防御系統(tǒng)產(chǎn)生的ROS失衡導(dǎo)致的氧化損傷，ROS是氧化還原反應(yīng)過程中產(chǎn)生的一系列化合物的總稱，具有化合物活性，可破壞DNA、酶及蛋白質(zhì)等，受到外界干擾平衡被打破，則導(dǎo)致氧化損傷〔14〕，可能與腎毒性的發(fā)生機(jī)制間存在關(guān)聯(lián)。體內(nèi)ROS的清除系統(tǒng)包括酶和非酶兩種途徑，酶類抗氧化物包括SOD、GSH-Px等，非酶抗氧化物包括維生素E、維生素C等。SOD由蛋白質(zhì)和金屬離子組成，具有特定的生物催化功能，可有效清除內(nèi)源性或外源性超氧自由基，具有重要的抗氧化作用〔15〕。GSH-Px主要分布于細(xì)胞質(zhì)和線粒體中，可有效發(fā)揮消除生物大分子過氧化物作用，保護(hù)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能免受過氧化物的破壞〔16〕。MDA是由脂質(zhì)過氧化物降解形成的一組醛，檢測(cè)其含量通常可反映脂質(zhì)過氧化的程度〔17〕。本研究結(jié)果提示，PNS可有效緩解PME導(dǎo)致的氧化損傷，PNS可有效改善小鼠的抗氧化系統(tǒng)，增強(qiáng)小鼠的清除自由基能力。一項(xiàng)體外研究〔18〕結(jié)果表明，經(jīng)PME誘導(dǎo)的腎毒性細(xì)胞模型中，經(jīng)PNS處理后ROS、MDA水平降低，SOD、GSH-Px活性及GSH含量均顯著升高，與本研究結(jié)論一致。

細(xì)胞凋亡指的是在基因調(diào)節(jié)下，細(xì)胞自主、有序的主動(dòng)死亡過程，凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)包括兩種主要途徑：死亡受體途徑和線粒體途徑〔19〕。PME引起的腎毒性可能是由于其在腎小管細(xì)胞線粒體中累積，導(dǎo)致氧化應(yīng)激失衡。caspase-3、caspase-9參與細(xì)胞凋亡線粒體途徑的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，本研究結(jié)果顯示，經(jīng)PME處理的TCMK-1細(xì)胞，caspase-3、caspase-9活性顯著升高，可能與線粒體膜電位發(fā)生變化，從而導(dǎo)致線粒體膜的通透性發(fā)生改變，使得Caspase蛋白家族介導(dǎo)的級(jí)聯(lián)通路被激活，使得細(xì)胞凋亡。添加PNS處理的PME誘導(dǎo)的TCMK-1細(xì)胞，caspase-3、caspase-9水平隨著PNS濃度的增加顯著降低。綜上，三七總皂苷可通過緩解氧化應(yīng)激反應(yīng)及細(xì)胞凋亡，達(dá)到有效減輕PME誘導(dǎo)的小鼠腎毒性，聯(lián)合使用三七總皂苷和PME可能用于臨床革蘭陰性菌感染。