劉曉 李穎 李英華

(哈勵遜國際和平醫(yī)院血液科，河北 衡水 053000)

骨髓瘤是一種B淋巴細(xì)胞的惡性腫瘤，主要是在骨髓中的惡性增殖，臨床主要表現(xiàn)為骨疼、缺鐵性貧血、腎衰竭等〔1〕。骨髓瘤細(xì)胞(MC)的生長與增殖受骨髓微環(huán)境的影響較大，骨髓中細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)與細(xì)胞、蛋白與可溶性調(diào)節(jié)因子如趨化因子、細(xì)胞因子和生長因子等均與骨髓內(nèi)微環(huán)境有密切關(guān)系。性別決定區(qū)Y框蛋白(SOX)2是MC的一種轉(zhuǎn)錄因子，參與維持胚胎干細(xì)胞多功能性和包括MC形態(tài)發(fā)生的多種發(fā)育過程，決定著細(xì)胞分化的方向與速度〔2〕。評估手術(shù)切除Ⅰ期肺鱗狀細(xì)胞癌(ACA)中SOX2表達(dá)的預(yù)后價(jià)值，證明SOX2可能與肺ACA預(yù)后不良有關(guān)〔3〕。單核細(xì)胞趨化蛋白(MCP)-1是趨化因子的一員，其同時(shí)使用CC類趨化因子受體(CCR)1和CCR2作為功能受體〔4～7〕。本研究探討SOX2蛋白及趨化相關(guān)基因CCR1、CCR2、MCP-1影響MC生物學(xué)特性的分子機(jī)制。

1 資料和方法

1.1一般資料 篩選2019年2月至2020年3月送檢的40例骨髓瘤標(biāo)本。其中男22例，女18例，平均年齡為(62.61±5.62)歲。入組標(biāo)準(zhǔn)：①年齡：60～75歲；②經(jīng)骨髓形態(tài)學(xué)確診為多發(fā)性骨髓瘤；③臨床資料完整；④患者的家屬知情并且同意。排除伴先天性免疫性疾病者；獲得內(nèi)部評審委員會的批準(zhǔn)。隨機(jī)分為兩組，對照(A)組，男8例，女12例，平均年齡(63.38±6.19)歲；試驗(yàn)(B)組男14例，女6例， 平均年齡(61.27±4.54)歲。兩組一般資料比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，具有可比性。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) 取兩組患者骨髓5 ml，常規(guī)制備單個(gè)核細(xì)胞，將細(xì)胞置于含10%胎牛血清100 U/ml青霉素、100 U/ml鏈霉素和20 U/ml谷胺酞胺的RFMI1640培養(yǎng)液內(nèi)，于37℃、5% CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細(xì)胞用于試驗(yàn)。細(xì)胞培養(yǎng)基主要成分包括10%胎牛血清、50 μg/ml鏈霉素和2 mmol/L谷胺酞胺，并補(bǔ)充1%的青霉素，放置于37℃含有5% CO2的條件下培養(yǎng)。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)20次，A組：只添加培養(yǎng)液；B組：MC以慢病毒SOX2熒光素酶表達(dá)載體(rLV-hsox2-Z s-Green-Puro)轉(zhuǎn)染。慢病毒轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)步驟：①慢病毒轉(zhuǎn)染前24 h，將細(xì)胞 以1×105/孔鋪到24孔板中。使細(xì)胞在慢病毒轉(zhuǎn)染時(shí)的數(shù)量為2×105/孔左右；②用含有6 μg/ml聚凝胺的2 ml新鮮培養(yǎng)基替換原培養(yǎng)基，加入適量病毒懸液，37℃孵育；③4 h后加入2 ml新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，用新鮮培養(yǎng)基替換含有病毒的培養(yǎng)基。

1.3細(xì)胞存活試驗(yàn) 將MC在密度為103個(gè)/孔的96孔板中培養(yǎng)，在37℃下培養(yǎng)，然后進(jìn)行MTT試驗(yàn)。轉(zhuǎn)染5 d后，無菌MTT (20 ml，5 mg/ml)被添加到每個(gè)的96孔板，37℃孵化4 h。取150 ml的二甲基亞砜(DMSO)加入96孔板中，那么光密使用NanoDrop 2000分光光度計(jì)測量490 nm處的光密度(OD)值。在菌落形成試驗(yàn)中，將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞放置在6孔板上，密度為每孔200個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)2 w，每3 d更換一次培養(yǎng)基。菌落在4%多聚甲醛固定15 min后，用1%結(jié)晶紫顯影20 min染色。

1.4細(xì)胞的增殖檢測 制備細(xì)胞懸液，接種到96孔板中，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，加入10 μl CCK8，培養(yǎng)2 h，測定450 nm吸光度。

1.5細(xì)胞的凋亡檢測 將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×106/孔/ml，用離心機(jī)于3 000 r/min離心10 min，棄去上清液。加人200 μl的結(jié)合沖液重懸細(xì)胞，用5 μl的膜聯(lián)蛋白(Annexin)V-異硫氰酸熒光素(FIFC)避光室溫25℃標(biāo)記15 min，用5 μl的碘化丙啶(PI)溶液避光標(biāo)記5 min，最后加人300 μl的結(jié)合緩沖液,流式細(xì)胞儀進(jìn)行流式檢測，并根據(jù)結(jié)果計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.6RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)PCR定量 使用TRIzol試劑按照說明書從細(xì)胞中分離出總RNA，用Hairpin-itTMPCR定量試劑盒按照廠家說明書進(jìn)行cDNA合成及后續(xù)實(shí)時(shí)定量PCR，內(nèi)源對照為小核GAPDH。基因表達(dá)評估用TransScript第一鏈cDNA合成SuperMix進(jìn)行總RNA的逆轉(zhuǎn)錄，使用TransStart Top Green qPCR SuperMix，按照制造商提供的協(xié)議進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR。該過程使用7500序列檢測系統(tǒng)進(jìn)行，使用分析軟件計(jì)算miRNA和基因的表達(dá)水平。引物序列：上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游5′-AACGCTTCACGAAT TTGCGT-3′；上游引物：5′-CGCTTCGGCAGCATTACT-3′，下游5′-GTCGAGATGGGATAC CCTT-3′；上游引物：5′-CTGACGTCGAGTGGGC-3′，下游5′-AGTCG-AGATGGGATAC CCTTA-3′；上游引物：5′-ACAG-TCGAGATGGGATAC CCTTACCATTACT-3′，下游5′-CT-GCTGACGTCGAGTGGGCAA-3′。

1.7SOX2蛋白表達(dá)水平 免疫印跡分析法對總蛋白進(jìn)行分離和定量分析。將預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)淋洗3次。然后加入裂解液對細(xì)胞〔RIPA：苯甲基磺酰氟(PMSF)=100∶1〕進(jìn)行裂解，低溫裂解30 min后，破碎細(xì)胞主要利用超聲細(xì)胞粉碎儀，3 000 r/min離心10 min，離心所得上清液即總蛋白，-80℃保存，備用。用BCA法測定蛋白的濃度，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將上述提取得到的總蛋白跑十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉(zhuǎn)膜至聚偏氟乙烯(PVDF)膜并將所得膜封閉在5%脫脂奶粉液中，室溫封存40 min。然后將SOX2的一抗和兔抗人SOX2多克隆抗體分別加入其中孵育過夜。加入兔抗鈣黏蛋白多克隆抗體(1∶1 000)、兔抗波形蛋白多克隆抗體(1∶5 000)、兔抗Snai1多克隆抗體(1∶1 000 )、兔抗NT5E多克隆抗體(1∶500)、鼠抗β-actin單克隆抗體(1∶2 000)，4℃水平過夜，加入二抗孵育2 h，用電化學(xué)發(fā)光(ECL)法顯色。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1細(xì)胞總數(shù)測定 與A組相比，B組細(xì)胞總數(shù)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

2.2細(xì)胞存活率 與A組相比，B組細(xì)胞存活率降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表1。

2.3細(xì)胞凋亡檢測 與A組相比，B組細(xì)胞凋亡率升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，見表1。

2.4SOX2蛋白表達(dá) 與A組相比，B組SOX2蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1、圖1。

表1 兩組細(xì)胞總數(shù)、存活率、凋亡率、SOX2蛋白及CCR1、CCR2、MCP-1 mRNA相對表達(dá)量比較

圖1 兩組SOX2蛋白表達(dá)水平

2.5CCR1、CCR2、MCP-1 mRNA表達(dá) 與A組相比，B組CCR1、CCR2、MCP-1 mRNA基因表達(dá)的上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1、圖2。

圖2 兩組CCR1、CCR2、MCP-1 mRNA的表達(dá)水平

3 討 論

骨髓瘤患者通常以骨痛起病，溶骨性病變是典型的臨床癥狀〔8〕，骨病變部位大多位于人體的中心骨架、顱骨及長骨，可引起劇烈的骨疼痛、病理性骨折及骨質(zhì)疏松等〔9〕。MC在疾病進(jìn)展的過程中，很少位于骨髓以外的組織和器官，其大部分時(shí)間內(nèi)位于骨髓中〔10〕。MC細(xì)胞附近破骨細(xì)胞的增多及激活，成骨細(xì)胞的減少及活性抑制，都有可能導(dǎo)致溶骨增多或者成骨減少，從而誘發(fā)骨髓瘤病變〔11〕。MC毗鄰處，溶骨性損害往往更顯著，這可能與MC所處的骨髓微環(huán)境密切相關(guān)，微環(huán)境的改變常引起SOX2蛋白表達(dá)異常，但是SOX2蛋白在MC中表達(dá)尚未得到廣泛研究〔12〕。

本研究結(jié)果說明SOX2蛋白在MC的產(chǎn)生和增殖過程中具有重要作用。研究表明〔13〕，在骨髓瘤的發(fā)生和發(fā)展中，骨髓微環(huán)境起著至關(guān)重要的作用。Eltoukhy等〔14〕研究表明癌癥治療結(jié)果預(yù)測算法包含了對“干細(xì)胞”通路的基因組分析通路，在包括肺癌在內(nèi)的多種腫瘤類型的回顧性研究中顯示出較高的預(yù)后準(zhǔn)確性。MCP-1具有趨化作用，可激活多種炎性細(xì)胞，其對白細(xì)胞的作用譜與MCP-3相似，包括單核細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、自然殺傷(NK)細(xì)胞、嗜堿性細(xì)胞、肥大細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞，但與MCP-3不同，MCP-1對嗜酸性粒細(xì)胞無活性。Fu等〔15〕從白細(xì)胞研究中獲得的證據(jù)表明MCP-2可能與這些C-C趨化因子共享受體，但MCP-2的實(shí)際功能受體尚未被確認(rèn)。

由于細(xì)胞的趨化因子受體表達(dá)多樣性和功能性質(zhì)，主要由破骨細(xì)胞產(chǎn)生，在這些細(xì)胞上很難識別特定配體所使用的受體。大量的CCR1和CCR2趨化因子受體已被克隆，并在細(xì)胞上進(jìn)行功能表達(dá)〔16～18〕。CCR1是MCP-3和MIP-1a/RANTES的受體，而CCR2主要由MCP-1和MCP-3共享。雖然CCR2已被報(bào)道無法直接對MCP-2產(chǎn)生作用，但相關(guān)結(jié)論是由于合成的MCP-2不能誘導(dǎo)轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞所含的鈣作用，及MCP-2未能使MCP-1所誘導(dǎo)的鈣通量脫敏〔19〕。而MCP-1具有在單核細(xì)胞誘導(dǎo)過程中的鈣動員效果不佳的情況及單核細(xì)胞的趨化活動，使得MCP-1使用的信號通路不同于其他的碳趨化因子〔20〕。盡管如此，MCP-1亦可有效地使MCP-1-induced單核細(xì)胞的遷移過程減弱，并通過同源失活的過程以利用同一MCP-1受體。然而，在本次研究中，這顯然不能通過本機(jī)建立細(xì)胞，而需使用轉(zhuǎn)染的細(xì)胞以表達(dá)單一的趨化因子受體，亦是今后的研究方向。

綜上，多發(fā)性骨髓瘤雖為漿細(xì)胞病，但MC與正常漿細(xì)胞的免疫表型不同。SOX2蛋白在細(xì)胞特定周期的高效表達(dá)可加速M(fèi)C快速凋亡，且CCR1、CCR2和MCP-1基因通過在細(xì)胞中的過表達(dá)可調(diào)節(jié)MC的增殖，導(dǎo)致疾病及抗凋亡反應(yīng)的發(fā)生。