国产日韩欧美一区二区三区三州_亚洲少妇熟女av_久久久久亚洲av国产精品_波多野结衣网站一区二区_亚洲欧美色片在线91_国产亚洲精品精品国产优播av_日本一区二区三区波多野结衣 _久久国产av不卡

404 Not Found


nginx
404 Not Found

404 Not Found


nginx
404 Not Found

404 Not Found


nginx
404 Not Found

404 Not Found


nginx
404 Not Found

404 Not Found


nginx
404 Not Found

404 Not Found


nginx

SOX2蛋白及趨化相關(guān)基因CCR1、CCR2、MCP-1影響骨髓瘤細(xì)胞生物學(xué)特性的分子機(jī)制

2022-09-25 11:33:02劉曉李穎李英華
中國老年學(xué)雜志 2022年18期
關(guān)鍵詞:趨化因子骨髓瘤孔板

劉曉 李穎 李英華

(哈勵遜國際和平醫(yī)院血液科,河北 衡水 053000)

骨髓瘤是一種B淋巴細(xì)胞的惡性腫瘤,主要是在骨髓中的惡性增殖,臨床主要表現(xiàn)為骨疼、缺鐵性貧血、腎衰竭等〔1〕。骨髓瘤細(xì)胞(MC)的生長與增殖受骨髓微環(huán)境的影響較大,骨髓中細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)與細(xì)胞、蛋白與可溶性調(diào)節(jié)因子如趨化因子、細(xì)胞因子和生長因子等均與骨髓內(nèi)微環(huán)境有密切關(guān)系。性別決定區(qū)Y框蛋白(SOX)2是MC的一種轉(zhuǎn)錄因子,參與維持胚胎干細(xì)胞多功能性和包括MC形態(tài)發(fā)生的多種發(fā)育過程,決定著細(xì)胞分化的方向與速度〔2〕。評估手術(shù)切除Ⅰ期肺鱗狀細(xì)胞癌(ACA)中SOX2表達(dá)的預(yù)后價(jià)值,證明SOX2可能與肺ACA預(yù)后不良有關(guān)〔3〕。單核細(xì)胞趨化蛋白(MCP)-1是趨化因子的一員,其同時(shí)使用CC類趨化因子受體(CCR)1和CCR2作為功能受體〔4~7〕。本研究探討SOX2蛋白及趨化相關(guān)基因CCR1、CCR2、MCP-1影響MC生物學(xué)特性的分子機(jī)制。

1 資料和方法

1.1一般資料 篩選2019年2月至2020年3月送檢的40例骨髓瘤標(biāo)本。其中男22例,女18例,平均年齡為(62.61±5.62)歲。入組標(biāo)準(zhǔn):①年齡:60~75歲;②經(jīng)骨髓形態(tài)學(xué)確診為多發(fā)性骨髓瘤;③臨床資料完整;④患者的家屬知情并且同意。排除伴先天性免疫性疾病者;獲得內(nèi)部評審委員會的批準(zhǔn)。隨機(jī)分為兩組,對照(A)組,男8例,女12例,平均年齡(63.38±6.19)歲;試驗(yàn)(B)組男14例,女6例, 平均年齡(61.27±4.54)歲。兩組一般資料比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),具有可比性。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) 取兩組患者骨髓5 ml,常規(guī)制備單個(gè)核細(xì)胞,將細(xì)胞置于含10%胎牛血清100 U/ml青霉素、100 U/ml鏈霉素和20 U/ml谷胺酞胺的RFMI1640培養(yǎng)液內(nèi),于37℃、5% CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細(xì)胞用于試驗(yàn)。細(xì)胞培養(yǎng)基主要成分包括10%胎牛血清、50 μg/ml鏈霉素和2 mmol/L谷胺酞胺,并補(bǔ)充1%的青霉素,放置于37℃含有5% CO2的條件下培養(yǎng)。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)20次,A組:只添加培養(yǎng)液;B組:MC以慢病毒SOX2熒光素酶表達(dá)載體(rLV-hsox2-Z s-Green-Puro)轉(zhuǎn)染。慢病毒轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)步驟:①慢病毒轉(zhuǎn)染前24 h,將細(xì)胞 以1×105/孔鋪到24孔板中。使細(xì)胞在慢病毒轉(zhuǎn)染時(shí)的數(shù)量為2×105/孔左右;②用含有6 μg/ml聚凝胺的2 ml新鮮培養(yǎng)基替換原培養(yǎng)基,加入適量病毒懸液,37℃孵育;③4 h后加入2 ml新鮮培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)24 h,用新鮮培養(yǎng)基替換含有病毒的培養(yǎng)基。

1.3細(xì)胞存活試驗(yàn) 將MC在密度為103個(gè)/孔的96孔板中培養(yǎng),在37℃下培養(yǎng),然后進(jìn)行MTT試驗(yàn)。轉(zhuǎn)染5 d后,無菌MTT (20 ml,5 mg/ml)被添加到每個(gè)的96孔板,37℃孵化4 h。取150 ml的二甲基亞砜(DMSO)加入96孔板中,那么光密使用NanoDrop 2000分光光度計(jì)測量490 nm處的光密度(OD)值。在菌落形成試驗(yàn)中,將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞放置在6孔板上,密度為每孔200個(gè)細(xì)胞,培養(yǎng)2 w,每3 d更換一次培養(yǎng)基。菌落在4%多聚甲醛固定15 min后,用1%結(jié)晶紫顯影20 min染色。

1.4細(xì)胞的增殖檢測 制備細(xì)胞懸液,接種到96孔板中,37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng),加入10 μl CCK8,培養(yǎng)2 h,測定450 nm吸光度。

1.5細(xì)胞的凋亡檢測 將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×106/孔/ml,用離心機(jī)于3 000 r/min離心10 min,棄去上清液。加人200 μl的結(jié)合沖液重懸細(xì)胞,用5 μl的膜聯(lián)蛋白(Annexin)V-異硫氰酸熒光素(FIFC)避光室溫25℃標(biāo)記15 min,用5 μl的碘化丙啶(PI)溶液避光標(biāo)記5 min,最后加人300 μl的結(jié)合緩沖液,流式細(xì)胞儀進(jìn)行流式檢測,并根據(jù)結(jié)果計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.6RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)PCR定量 使用TRIzol試劑按照說明書從細(xì)胞中分離出總RNA,用Hairpin-itTMPCR定量試劑盒按照廠家說明書進(jìn)行cDNA合成及后續(xù)實(shí)時(shí)定量PCR,內(nèi)源對照為小核GAPDH。基因表達(dá)評估用TransScript第一鏈cDNA合成SuperMix進(jìn)行總RNA的逆轉(zhuǎn)錄,使用TransStart Top Green qPCR SuperMix,按照制造商提供的協(xié)議進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR。該過程使用7500序列檢測系統(tǒng)進(jìn)行,使用分析軟件計(jì)算miRNA和基因的表達(dá)水平。引物序列:上游引物:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,下游5′-AACGCTTCACGAAT TTGCGT-3′;上游引物:5′-CGCTTCGGCAGCATTACT-3′,下游5′-GTCGAGATGGGATAC CCTT-3′;上游引物:5′-CTGACGTCGAGTGGGC-3′,下游5′-AGTCG-AGATGGGATAC CCTTA-3′;上游引物:5′-ACAG-TCGAGATGGGATAC CCTTACCATTACT-3′,下游5′-CT-GCTGACGTCGAGTGGGCAA-3′。

1.7SOX2蛋白表達(dá)水平 免疫印跡分析法對總蛋白進(jìn)行分離和定量分析。將預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)淋洗3次。然后加入裂解液對細(xì)胞〔RIPA:苯甲基磺酰氟(PMSF)=100∶1〕進(jìn)行裂解,低溫裂解30 min后,破碎細(xì)胞主要利用超聲細(xì)胞粉碎儀,3 000 r/min離心10 min,離心所得上清液即總蛋白,-80℃保存,備用。用BCA法測定蛋白的濃度,以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將上述提取得到的總蛋白跑十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),轉(zhuǎn)膜至聚偏氟乙烯(PVDF)膜并將所得膜封閉在5%脫脂奶粉液中,室溫封存40 min。然后將SOX2的一抗和兔抗人SOX2多克隆抗體分別加入其中孵育過夜。加入兔抗鈣黏蛋白多克隆抗體(1∶1 000)、兔抗波形蛋白多克隆抗體(1∶5 000)、兔抗Snai1多克隆抗體(1∶1 000 )、兔抗NT5E多克隆抗體(1∶500)、鼠抗β-actin單克隆抗體(1∶2 000),4℃水平過夜,加入二抗孵育2 h,用電化學(xué)發(fā)光(ECL)法顯色。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1細(xì)胞總數(shù)測定 與A組相比,B組細(xì)胞總數(shù)升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

2.2細(xì)胞存活率 與A組相比,B組細(xì)胞存活率降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表1。

2.3細(xì)胞凋亡檢測 與A組相比,B組細(xì)胞凋亡率升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001),見表1。

2.4SOX2蛋白表達(dá) 與A組相比,B組SOX2蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表1、圖1。

表1 兩組細(xì)胞總數(shù)、存活率、凋亡率、SOX2蛋白及CCR1、CCR2、MCP-1 mRNA相對表達(dá)量比較

圖1 兩組SOX2蛋白表達(dá)水平

2.5CCR1、CCR2、MCP-1 mRNA表達(dá) 與A組相比,B組CCR1、CCR2、MCP-1 mRNA基因表達(dá)的上調(diào),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表1、圖2。

圖2 兩組CCR1、CCR2、MCP-1 mRNA的表達(dá)水平

3 討 論

骨髓瘤患者通常以骨痛起病,溶骨性病變是典型的臨床癥狀〔8〕,骨病變部位大多位于人體的中心骨架、顱骨及長骨,可引起劇烈的骨疼痛、病理性骨折及骨質(zhì)疏松等〔9〕。MC在疾病進(jìn)展的過程中,很少位于骨髓以外的組織和器官,其大部分時(shí)間內(nèi)位于骨髓中〔10〕。MC細(xì)胞附近破骨細(xì)胞的增多及激活,成骨細(xì)胞的減少及活性抑制,都有可能導(dǎo)致溶骨增多或者成骨減少,從而誘發(fā)骨髓瘤病變〔11〕。MC毗鄰處,溶骨性損害往往更顯著,這可能與MC所處的骨髓微環(huán)境密切相關(guān),微環(huán)境的改變常引起SOX2蛋白表達(dá)異常,但是SOX2蛋白在MC中表達(dá)尚未得到廣泛研究〔12〕。

本研究結(jié)果說明SOX2蛋白在MC的產(chǎn)生和增殖過程中具有重要作用。研究表明〔13〕,在骨髓瘤的發(fā)生和發(fā)展中,骨髓微環(huán)境起著至關(guān)重要的作用。Eltoukhy等〔14〕研究表明癌癥治療結(jié)果預(yù)測算法包含了對“干細(xì)胞”通路的基因組分析通路,在包括肺癌在內(nèi)的多種腫瘤類型的回顧性研究中顯示出較高的預(yù)后準(zhǔn)確性。MCP-1具有趨化作用,可激活多種炎性細(xì)胞,其對白細(xì)胞的作用譜與MCP-3相似,包括單核細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、自然殺傷(NK)細(xì)胞、嗜堿性細(xì)胞、肥大細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞,但與MCP-3不同,MCP-1對嗜酸性粒細(xì)胞無活性。Fu等〔15〕從白細(xì)胞研究中獲得的證據(jù)表明MCP-2可能與這些C-C趨化因子共享受體,但MCP-2的實(shí)際功能受體尚未被確認(rèn)。

由于細(xì)胞的趨化因子受體表達(dá)多樣性和功能性質(zhì),主要由破骨細(xì)胞產(chǎn)生,在這些細(xì)胞上很難識別特定配體所使用的受體。大量的CCR1和CCR2趨化因子受體已被克隆,并在細(xì)胞上進(jìn)行功能表達(dá)〔16~18〕。CCR1是MCP-3和MIP-1a/RANTES的受體,而CCR2主要由MCP-1和MCP-3共享。雖然CCR2已被報(bào)道無法直接對MCP-2產(chǎn)生作用,但相關(guān)結(jié)論是由于合成的MCP-2不能誘導(dǎo)轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞所含的鈣作用,及MCP-2未能使MCP-1所誘導(dǎo)的鈣通量脫敏〔19〕。而MCP-1具有在單核細(xì)胞誘導(dǎo)過程中的鈣動員效果不佳的情況及單核細(xì)胞的趨化活動,使得MCP-1使用的信號通路不同于其他的碳趨化因子〔20〕。盡管如此,MCP-1亦可有效地使MCP-1-induced單核細(xì)胞的遷移過程減弱,并通過同源失活的過程以利用同一MCP-1受體。然而,在本次研究中,這顯然不能通過本機(jī)建立細(xì)胞,而需使用轉(zhuǎn)染的細(xì)胞以表達(dá)單一的趨化因子受體,亦是今后的研究方向。

綜上,多發(fā)性骨髓瘤雖為漿細(xì)胞病,但MC與正常漿細(xì)胞的免疫表型不同。SOX2蛋白在細(xì)胞特定周期的高效表達(dá)可加速M(fèi)C快速凋亡,且CCR1、CCR2和MCP-1基因通過在細(xì)胞中的過表達(dá)可調(diào)節(jié)MC的增殖,導(dǎo)致疾病及抗凋亡反應(yīng)的發(fā)生。

猜你喜歡
趨化因子骨髓瘤孔板
核電廠高壓安注系統(tǒng)再循環(huán)管線節(jié)流孔板的分析與改進(jìn)
多發(fā)性骨髓瘤伴腎損傷的發(fā)病機(jī)制與治療進(jìn)展
硼替佐米治療多發(fā)性骨髓瘤致心律失常2例并文獻(xiàn)復(fù)習(xí)
限流孔板的計(jì)算與應(yīng)用
廣州化工(2020年6期)2020-04-18 03:30:20
骨髓瘤相關(guān)性腎輕鏈淀粉樣變1例
長距離礦漿管道系統(tǒng)中消能孔板的運(yùn)行優(yōu)化
趨化因子及其受體在腫瘤免疫中調(diào)節(jié)作用的新進(jìn)展
微RNA-34a在多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞RPMI-8226中的作用及其機(jī)制
肝細(xì)胞癌患者血清趨化因子CXCR12和SA的表達(dá)及臨床意義
氣田集輸站場火災(zāi)泄壓放空限流孔板計(jì)算解析
404 Not Found

404 Not Found


nginx
404 Not Found

404 Not Found


nginx
404 Not Found

404 Not Found


nginx
404 Not Found

404 Not Found


nginx
404 Not Found

404 Not Found


nginx
崇义县| 拜泉县| 通许县| 荥经县| 娄烦县| 建水县| 治多县| 前郭尔| 芒康县| 崇义县| 息烽县| 石门县| 红桥区| 新龙县| 河东区| 嫩江县| 西丰县| 福州市| 汝城县| 仙桃市| 海丰县| 彭州市| 永昌县| 罗定市| 兴国县| 平遥县| 湖北省| 宁国市| 西青区| 仁寿县| 泉州市| 大洼县| 定日县| 中阳县| 黎平县| 锡林浩特市| 青河县| 永定县| 中方县| 望谟县| 法库县|