王彥平 王季堃 劉金豪 陳彥雷 馬雪倩 馮揚(yáng) 喬世峰

(錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 1結(jié)直腸外科2病區(qū)，遼寧 錦州 121001;2腫瘤病區(qū))

結(jié)直腸癌是最常見的惡性腫瘤之一，在我國發(fā)病率排第三位，死亡率居第四位，且逐年遞增〔1〕。然而僅有少數(shù)結(jié)直腸癌患者可在早期發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)被確診時(shí)已經(jīng)出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，5年生存率大幅度降低。遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致結(jié)直腸癌患者死亡的主要原因，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是結(jié)直腸癌最常見的轉(zhuǎn)移途徑，也是評估病情及判斷預(yù)后的重要因素。據(jù)統(tǒng)計(jì)，結(jié)直腸癌患5年生存率為70%，但由于存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，5年生存率降至13%〔2〕。目前關(guān)于結(jié)直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具體機(jī)制尚未明確，因此成為研究熱點(diǎn)之一。研究表明，M2型巨噬細(xì)胞在腫瘤發(fā)生與發(fā)展中扮演著重要角色，并且CD163是M2型巨噬細(xì)胞的特異性標(biāo)志〔3〕。癌胚抗原(CEA)是判斷結(jié)直腸癌嚴(yán)重程度的重要實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)，也是結(jié)直腸癌發(fā)生轉(zhuǎn)移的特異性診斷指標(biāo)〔4〕。本文檢測淋巴結(jié)組織中M2型巨噬細(xì)胞數(shù)量與血清CEA水平，探討其之間的關(guān)系及臨床意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2020年1～5月在錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院結(jié)直腸外科2病區(qū)收治的結(jié)直腸癌患者104例，收集臨床資料及術(shù)后淋巴結(jié)組織標(biāo)本。其中男70例，女34例，年齡38～89歲，平均(65.6±9.7)歲。分為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組和淋巴結(jié)正常組。依據(jù)2017年美國癌癥聯(lián)合會(AJCC)臨床TNM分期標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ期15例，Ⅱ期41例，Ⅲ期43例，Ⅳ期5例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①原發(fā)性結(jié)直腸癌；②初次接受手術(shù)治療；③同意參與本研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：①確診之后接受過化療或放療等治療；②確診之后接受過免疫靶向治療；③有多個(gè)部位的腸道惡性腫瘤或合并其他系統(tǒng)惡性腫瘤。本研究經(jīng)錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書。

1.2實(shí)驗(yàn)方法 采用免疫組化鏈霉菌抗生素蛋白-過氧化物酶鏈接(SP)法：所有標(biāo)本用甲醛固定，石蠟包埋，切成4 μm厚的切片。經(jīng)二甲苯脫蠟和乙醇水化后，乙二胺四乙酸緩沖液(pH9.0)加熱抗原修復(fù)，內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑室溫下孵育10 min，山羊血清封閉30 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗，加入即用型鼠抗人CD163單克隆抗體室溫下孵育60 min，依次加入生物素標(biāo)記的IgG聚合物及鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶，最后用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色和蘇木素進(jìn)行染色，脫水封片。上述試劑均購自中國福州邁新生物技術(shù)有限公司。結(jié)果判定：巨噬細(xì)胞的細(xì)胞膜上出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為CD163陽性表達(dá)。先低倍鏡下(×200)選取CD163陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)量最多的5個(gè)區(qū)域，然后在高倍鏡下(×400)計(jì)數(shù)并取平均值。光學(xué)生物顯微鏡由日本奧林巴斯公司生產(chǎn)。術(shù)前采用電化學(xué)發(fā)光法測定血清CEA水平：所有研究對象清晨空腹采取靜脈血5～7 ml,離心留取血清，由該院檢驗(yàn)科人員嚴(yán)格按照操作流程進(jìn)行檢測。血清CEA≥5 ng/ml即陽性。免疫分析儀及檢測試劑盒均由美國羅氏公司生產(chǎn)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS24.0軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)及χ2檢驗(yàn)，M2型巨噬細(xì)胞數(shù)量與術(shù)前CEA水平之間的相關(guān)性采用Spearman 相關(guān)分析。

2 結(jié) 果

2.1兩組淋巴結(jié)組織中CD163表達(dá) 免疫組化結(jié)果顯示，淋巴結(jié)正常組M2型巨噬細(xì)胞主要浸潤到髓竇內(nèi)；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組M2型巨噬細(xì)胞主要浸潤到轉(zhuǎn)移腫瘤組織的間質(zhì)內(nèi)。見圖1。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組M2型細(xì)胞數(shù)量〔(26.44±7.33)個(gè)〕顯著高于淋巴結(jié)正常組〔(14.66±4.38)個(gè)；P<0.05〕。

圖1 兩組CD163陽性表達(dá)(SP法，×400)

2.2淋巴結(jié)組織中M2型巨噬細(xì)胞數(shù)量與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 M2型巨噬細(xì)胞在淋巴結(jié)組織中表達(dá)數(shù)量在腫瘤浸潤深度、TNM分期及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移上有明顯差異(t=4.598,10.224,10.224;P<0.05)。見表1。

表1 轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織中M2型巨噬細(xì)胞數(shù)量與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系個(gè))

2.3術(shù)前血清CEA水平與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 術(shù)前CEA血清水平在腫瘤直徑、TNM分期、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及分化程度上差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 術(shù)前血清CEA水平與患者臨床病理參數(shù)關(guān)系(n)

2.4術(shù)前血清CEA水平與淋巴結(jié)組織中M2型巨噬細(xì)胞數(shù)量相關(guān)性 Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示，術(shù)前血清CEA水平與淋巴結(jié)組織中M2型巨噬細(xì)胞數(shù)量呈正相關(guān)(r=0.347,P=0.007)。見圖2。

圖2 術(shù)前血清CEA水平與M2型巨噬細(xì)胞數(shù)量相關(guān)性

3 討 論

巨噬細(xì)胞是腫瘤微環(huán)境中的主要免疫細(xì)胞，因具有表型和功能可塑性，可被微環(huán)境中不同細(xì)胞因子刺激分化為不同的表型，微環(huán)境中的干擾素-γ、脂多糖和腫瘤壞死因子-α等細(xì)胞因子刺激巨噬細(xì)胞分化為M1型巨噬細(xì)胞。而白細(xì)胞介素-4、白細(xì)胞介素-10和轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β等細(xì)胞因子刺激巨噬細(xì)胞分化為M2巨噬細(xì)胞。M1巨噬細(xì)胞可分泌多種促炎細(xì)胞因子，主要起殺傷病原體和腫瘤細(xì)胞的作用，有助于免疫監(jiān)測；M2巨噬細(xì)胞產(chǎn)生較低數(shù)量的促炎細(xì)胞因子和大量抗炎細(xì)胞因子，主要起到免疫抑制作用，有助于免疫耐受〔5〕。最近在胰腺癌的研究中表明，M2巨噬細(xì)胞浸潤前哨淋巴結(jié)的時(shí)間早于轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞〔6〕，所以本研究推測M2型巨噬細(xì)胞導(dǎo)致淋巴結(jié)內(nèi)免疫抑制環(huán)境增強(qiáng)為腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移創(chuàng)造條件。既往研究表明〔7～9〕，M2型巨噬細(xì)胞在胃癌、結(jié)直腸癌及宮頸癌等惡性腫瘤組織中高表達(dá)與腫瘤細(xì)胞侵襲性增加顯著相關(guān)。本研究結(jié)果與既往研究結(jié)果一致。CEA是一種大分子量糖蛋白，參與腫瘤細(xì)胞黏附、轉(zhuǎn)移及抑制細(xì)胞免疫等多個(gè)方面〔10,11〕。在疾病的早期階段，CEA水平升高很少被檢測到，一旦檢測出來高于正常值表明患者預(yù)后較差〔12〕。研究證實(shí)CEA與TGF-βⅠ型受體(TGF-βRⅠ)結(jié)合，激活下游TGF-β/pSmad3信號通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖與轉(zhuǎn)移〔13〕。本研究結(jié)果提示CEA與結(jié)直腸癌進(jìn)展有密切聯(lián)系。因此，術(shù)前血清CEA水平可評估結(jié)直腸癌患者的病情(如腫瘤分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移)，為臨床治療和判斷預(yù)后提供指導(dǎo)。經(jīng)Spearmam相關(guān)性分析顯示，M2型巨噬細(xì)胞數(shù)量與術(shù)前CEA水平呈正相關(guān)，同時(shí)有學(xué)者發(fā)現(xiàn)CEA可刺激白細(xì)胞介素-10釋放，后者可激活酪氨酸激酶(JAK)1/信號傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化因子(STAT)3信號通路而使巨噬細(xì)胞分化為M2型巨噬細(xì)胞〔14,15〕，恰好驗(yàn)證了本研究分析結(jié)果。綜上，CEA與M2型巨噬細(xì)胞相互作用為腫瘤細(xì)胞創(chuàng)造免疫抑制環(huán)境，導(dǎo)致結(jié)直腸癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，可能為結(jié)直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移機(jī)制提供新的思路，M2型巨噬細(xì)胞可能成為治療結(jié)直腸癌新的靶點(diǎn)。