許暉 董江濤 王世龍 王惠 趙冬

(石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科， 新疆 石河子 832008)

膠質(zhì)瘤作為顱內(nèi)最常見惡性腫瘤，以無限增殖和浸潤著稱，其中神經(jīng)膠質(zhì)瘤占顱內(nèi)原發(fā)腫瘤的40%～50%〔1〕，威脅患者安全。微小RNA(miRNA)存在于所有細(xì)胞中，在轉(zhuǎn)錄后參與約1/3基因調(diào)控，從而影響癌細(xì)胞增殖、分化、凋亡等發(fā)揮作用〔2〕。miR-196b定位于同源盒(HOX)基因簇，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，從而在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起調(diào)控作用〔3〕。HOXA9作為HOX基因簇一員，在膠質(zhì)瘤中發(fā)揮致癌作用〔4〕，且miR-196b可通過靶向調(diào)節(jié)HOXA9抑制骨髓瘤細(xì)胞的增殖和遷移，從而影響疾病〔5〕。推測miR-196b在膠質(zhì)瘤中可能有類似功能。因此，本研究以神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞系為研究對象，過表達(dá)或干擾miR-196b后，探究其對U251細(xì)胞集落形成及凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞系 人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心。

1.2試劑及儀器 CCK-8試劑盒、Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(碧云天科技有限公司，貨號分別為C0037、C1062L)；RNA提取試劑盒、Thermo Scientific RevertAid第一鏈cDNA合成試劑盒(賽默飛世爾科技公司，貨號分別為：12183018A、K1622)；一抗兔抗HOXA9、B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH，英國Abcam公司，貨號分別為：ab191178、ab32124、ab232479、ab181602)；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，貨號：D0010)；miR-196b mimic、miR-196b mimic NC、miR-196b inhibitor、miR-196b inhibitor NC、Lipofectamine 2000、HOXA9 3′UTR-WT和3′UTR-MUT均購自廣州銳博生物科技有限公司；miR-196b、HOXA9、GAPDH均由上海生工生物有限公司合成。實時熒光定量-聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)儀(美國ABI公司，型號：7500)；全自動凝膠成像分析系統(tǒng)(深圳市三利化學(xué)有限公司，型號：ZF-388)。

1.3細(xì)胞分組及處理 實驗分為正常組、mimic對照組、miR-196b mimic組、inhibitor對照組、miR-196b inhibitor組。含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液在37℃ 5%CO2孵箱中培養(yǎng)U251，至對數(shù)期時，除正常組外，其余各組參照Lipofectamine 2000說明書分別轉(zhuǎn)染miR-196b mimic NC、miR-196b mimic、miR-196b inhibitor NC、miR-196b inhibitor，培養(yǎng)6 h后去除培養(yǎng)液，更換為DMEM培養(yǎng)液(含胎牛血清10%)培養(yǎng)。

1.4CCK-8檢測細(xì)胞增殖情況 U251接種至96孔板中(1.0×103個/孔)，按照1.3處理各組細(xì)胞，分別在培養(yǎng)0、12、24、36、48 h時，按照說明書操作加入CCK-8試劑，酶標(biāo)儀檢測450 nm下各孔細(xì)胞光密度(OD)450，每組6個重復(fù)。

1.5qRT-PCR檢測細(xì)胞中miR-196b、HOXA9 mRNA水平 U251接種至6孔板中，按照1.3處理各組細(xì)胞24 h，RNA提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA，Thermo Scientific RevertAid第一鏈cDNA合成試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄成第一鏈cDNA。引物序列miR-196b-正義鏈：5′-TAGGTAGTTTCCTGTTGTTGGG-3′，反義鏈：5′-ACGTGCTTCTTTGTAATGACCA-3′；U6正義鏈：5′-ATATGGACGCTTCAATT-3′，反義鏈：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；HOXA9正義鏈：5′-GCTGAGAATGAGAGCGGG-3′，反義鏈5′-CAGTTCCAGGGTCTGGTGTT-3′；GAPDH正義鏈：5′-GGTTGTCTCCTGCGACTTCA-3′，反義鏈5′-CCCTAGGCCCCTCCTGTTAT-3′。qRT-PCR儀對miR-196b、U6、HOXA9、GAPDH進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系(20 μl)：2×SYBR qPCR Mix(10 μl)，cDNA(40 ng/μl，1 μl)，上/下游引物(10 μmol/L，0.5/0.5 μl)，ddH2O(8 μl)；反應(yīng)條件：94℃、60 s；95℃、40 s，60℃、45 s，共40個循環(huán)。2-ΔΔCt法計算miR-196b、HOXA9相對表達(dá)水平。

1.6集落形成實驗 U251接種至6孔板中，按照1.3處理各組細(xì)胞24 h，將各組細(xì)胞與DMEM制成細(xì)胞懸液，接種細(xì)胞至6孔板中，200個/孔，置于37℃ 5%CO2孵箱中培養(yǎng)10～14 d，4%多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色5 min，清水清洗，至背景色干凈后，觀察細(xì)胞集落情況，計數(shù)并拍照。集落形成率=集落數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%。

1.7Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒檢測細(xì)胞凋亡情況 U251接種至6孔板中，按照1.3處理各組細(xì)胞24 h，4℃預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗細(xì)胞2次，結(jié)合緩沖液用去離子水經(jīng)1:9稀釋后將細(xì)胞濃度調(diào)節(jié)至1×106個/ml，加入5 μl Annexin V-FITC、10 μl碘化丙啶染色液輕輕混勻，室溫避光染色15 min，流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡率。

1.8Western印跡檢測細(xì)胞中HOXA9、BCL2、BAX蛋白水平 U251接種至6孔板中，按照1.3處理各組細(xì)胞24 h，每孔加200 μl蛋白裂解液冰上裂解20 min，10 000 r/min離心20 min，上清為總蛋白。凝膠電泳分離蛋白質(zhì)、聚偏氟乙烯(PVDF)轉(zhuǎn)膜；5%脫脂奶粉室溫封閉；對應(yīng)加入一抗HOXA9、Bcl-2、Bax、GAPDH，4℃孵育過夜；加入對應(yīng)二抗，室溫孵育1 h；二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒避光顯色，全自動凝膠成像分析系統(tǒng)拍照和定量分析。

1.9雙熒光素酶鑒定miR-196b與HOXA9的靶向關(guān)系 TargetScan查找HOXA9 mRNA的3′UTR與miR-196b結(jié)合位點。設(shè)計合成HOXA9的3′UTR-WT和3′UTR-MUT，分別與miR-196b mimic或miR-196b mimic NC共轉(zhuǎn)染，雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測各組熒光素酶相對活性。

1.10統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS25.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、SNK-q檢驗。

2 結(jié) 果

2.1miR-196b對細(xì)胞增殖的影響 5組在細(xì)胞培養(yǎng)0 h OD450差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與正常組、mimic對照組相比，miR-196b mimic組細(xì)胞培養(yǎng)12、24、36、48 h OD450均明顯升高(P<0.05)；與正常組、inhibitor對照組相比，miR-196b inhibitor組細(xì)胞培養(yǎng)12、24、36、48 h OD450均明顯降低(P<0.05)。見表1。

表1 5組細(xì)胞OD450比較

2.2miR-196b對細(xì)胞中miR-196b、HOXA9 mRNA水平的影響 與正常組、mimic對照組相比，miR-196b mimic組細(xì)胞中miR-196b、HOXA9 mRNA水平均明顯升高(P<0.05)；與正常組、inhibitor對照組相比，miR-196b inhibitor組細(xì)胞中miR-196b、HOXA9 mRNA水平均明顯降低(P<0.05)。見表2。

2.3miR-196b對細(xì)胞集落形成的影響 與正常組、mimic對照組相比，miR-196b mimic組細(xì)胞集落形成率均明顯升高(P<0.05)；與正常組、inhibitor對照組相比，miR-196b inhibitor組細(xì)胞集落形成率均明顯降低(P<0.05)。見表2、圖1。

2.4miR-196b對細(xì)胞凋亡的影響 與正常組、mimic對照組相比，miR-196b mimic組細(xì)胞凋亡率明顯降低(P<0.05)；與正常組、inhibitor對照組相比，miR-196b inhibitor組細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.05)。見表2、圖2。

表2 5組細(xì)胞中miR-196b、HOXA9 mRNA水平及細(xì)胞集落形成率、細(xì)胞凋亡率比較

圖1 5組細(xì)胞集落形成

圖2 5組細(xì)胞凋亡情況

2.5miR-196b對細(xì)胞中HOXA9、Bcl-2、Bax蛋白水平的影響 與正常組、mimic對照組相比，miR-196b mimic組細(xì)胞中HOXA9、Bcl-2蛋白水平明顯升高，Bax蛋白水平明顯降低(P<0.05)；與正常組、inhibitor對照組相比，miR-196b inhibitor組細(xì)胞中HOXA9、Bcl-2蛋白水平明顯降低，Bax蛋白水平明顯升高(P<0.05)。見圖3、表3。

1～5：正常組，mimic對照組，miR-196b mimic組，inhibitor對照組，miR-196b inhibitor組。圖3 5組細(xì)胞中HOXA9、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)

表3 5組細(xì)胞中HOXA9、Bcl-2、Bax蛋白水平比較

2.6雙熒光素酶驗證靶向關(guān)系 TargetScan分析發(fā)現(xiàn)HOXA9 mRNA的3′UTR含有miR-196b序列保守堿基。熒光素酶實驗驗證二者的靶向關(guān)系結(jié)果顯示，與miR-196b NC+3′UTR-WT組細(xì)胞熒光素酶活性(1.01±0.14)相比，miR-196b mimic+3′UTR-WT組(0.39±0.06)明顯下降(P<0.05)。見圖4。

圖4 TargetScan預(yù)測miR-196b與HOXA9的靶向關(guān)系

3 討 論

神經(jīng)膠質(zhì)瘤發(fā)生于神經(jīng)外胚層，屬惡性腫瘤；發(fā)展源自細(xì)胞增殖、凋亡失衡，細(xì)胞增殖增加、凋亡降低增加膠質(zhì)瘤細(xì)胞數(shù)量，局部侵襲和浸潤導(dǎo)致疾病復(fù)發(fā)率高且預(yù)后較差〔6,7〕。因此，改變神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、凋亡可從源頭上改善疾病，實現(xiàn)對疾病的保護(hù)。

miRNA是一類長度9～24個核苷酸的非編碼小RNA分子，可與目的基因3′UTR區(qū)域結(jié)合，影響目的基因表達(dá)，影響其mRNA或翻譯水平，從而影響其功能〔8〕；而目的基因功能多樣，在細(xì)胞中參與新陳代謝、氧化應(yīng)激、細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、細(xì)胞分化和凋亡等多種過程〔9〕。其中miR-196b具有多功能性，在白血病、前列腺癌中表現(xiàn)出抑癌特征，在結(jié)腸癌、肺癌、胃癌、膠質(zhì)瘤中表現(xiàn)出癌基因特征〔10〕；在膠質(zhì)瘤中隨著病理臨床分期的嚴(yán)重而水平增加，轉(zhuǎn)染miR-196b可促進(jìn)細(xì)胞增殖〔11〕。miR-196b靶向mRNA影響細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲等過程，從而影響疾病進(jìn)程。高表達(dá)miR-196b靶向精氨酸琥珀酸合成酶1促進(jìn)胃癌的侵襲和發(fā)展〔12〕；靶向叉頭框P2基因在肝細(xì)胞癌中促進(jìn)細(xì)胞遷移和侵襲〔13〕。在急性髓性白血病中可根據(jù)miR-196b靶向HOXA9基因調(diào)控特異基因開發(fā)出特異si-RNA用于治療疾病〔14〕。HOXA9編碼產(chǎn)物是一種重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，與腫瘤的發(fā)生、侵襲轉(zhuǎn)移等關(guān)系密切〔15〕。HOXA9在膠質(zhì)瘤發(fā)生中的致癌潛能，使膠質(zhì)母細(xì)胞瘤更具侵襲性，TCGA和倫勃朗的兩個大數(shù)據(jù)集中證實HOXA9在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者中具有預(yù)后價值，其中高水平的HOXA9與較短的生存期相關(guān)〔16,17〕。本研究結(jié)果提示膠質(zhì)瘤U251中升高miR-196b水平可促進(jìn)HOXA9表達(dá)從而增加細(xì)胞增殖、促進(jìn)癌細(xì)胞生長，減少細(xì)胞凋亡，從而加重疾病進(jìn)程；降低miR-196b可通過HOXA9緩解上述過程從而緩解疾病，實現(xiàn)對疾病的保護(hù)。

Bcl-2是線粒體凋亡途徑的重要基因，減少線粒體中Bcl-2/Rac1復(fù)合物的形成可改善神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷〔18〕。Bax是Bcl-2家族中研究最廣泛的促凋亡基因，與Bcl-2作用相反，可與Bcl-2結(jié)合成二聚體正負(fù)調(diào)節(jié)基因〔19〕。HOXA9促進(jìn)活體原位永生化星形膠質(zhì)細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化，并導(dǎo)致腫瘤相關(guān)死亡，是通過上調(diào)Bcl-2實現(xiàn)的〔20〕。本研究結(jié)果提示過表達(dá)miR-196b可以延緩細(xì)胞凋亡；降低miR-196b水平可以降低HOXA9水平表達(dá)，下調(diào)抗凋亡基因表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，同時抑制癌細(xì)胞生長，實現(xiàn)對膠質(zhì)瘤的保護(hù)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-196b與HOXA9存在靶位點。

綜上，miR-196b在膠質(zhì)瘤中低表達(dá)可促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡、抑制集落形成，從而實現(xiàn)對膠質(zhì)瘤的保護(hù)，可能是通過降低HOXA9實現(xiàn)的。但miR-196b可能存在多個靶位點，也可能通過其他通路共同影響凋亡，發(fā)現(xiàn)新的通路并探討其機(jī)制是本研究接下來的重點。