修福曉,王國華,李炳志

(1.中國刑事警察學(xué)院 警犬技術(shù)學(xué)院，遼寧 沈陽110034；2.西北農(nóng)林科技大學(xué) 動物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100；3.河北北方學(xué)院 動物科技學(xué)院，河北 張家口075131)

隨著中國經(jīng)濟(jì)發(fā)展和社會不斷進(jìn)步，寵物犬和工作犬作為人類忠實的伴侶，對其數(shù)量、質(zhì)量的要求也越來越高。由于犬存在特殊的生殖生理特性和繁殖規(guī)律，并且犬的人工授精技術(shù)還未成熟，若錯過發(fā)情期或發(fā)情期未受孕，產(chǎn)仔數(shù)就會大大減少。目前，應(yīng)用外源激素誘導(dǎo)同期發(fā)情的技術(shù)在豬、牛等家畜上研究較多，并且取得了良好的效果。國內(nèi)外對犬同情發(fā)情研究也有相關(guān)報道。張躍駿等采用孕馬血清促性腺激素(pregnant mare serum gonadotropin, PMSG)、人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin, HCG)兩種激素聯(lián)合使用，誘導(dǎo)母犬同期發(fā)情和排卵，取得良好的同期發(fā)情率(100%)和排卵率(55%～75%)，說明使用PMSG和HCG等外源激素可以對乏情期的母犬達(dá)到有效的誘導(dǎo)同期發(fā)情和排卵作用。趙興旺聯(lián)合使用5種外源激素對4只母犬進(jìn)行同期發(fā)情和超數(shù)排卵試驗，結(jié)果表明，4只試驗犬在使用藥物后18 d左右進(jìn)入發(fā)情排卵期。Concannon等研究促性腺激素釋放激素(gonadotropin-releasing hormone, GnRH)不同使用劑量和使用時間對比格犬同情發(fā)情的影響，連續(xù)注射3～5 d后同期發(fā)情率較高。Michelle對以往使用不同激素誘導(dǎo)犬同期發(fā)情研究結(jié)果進(jìn)行回顧總結(jié)，發(fā)現(xiàn)外源性促性腺激素(促黃體生成素(luteinizing hormone, LH)、卵泡刺激素(Follicle stimulating hormone, FSH)、HCG、PMSG)相比其他激素可以較好地誘導(dǎo)犬同期發(fā)情。目前研究大都集中在外源激素對母犬發(fā)情率以及同期發(fā)情的效果上，對同期發(fā)情后的懷孕率和產(chǎn)仔數(shù)的研究較少。本試驗應(yīng)用不同外源性激素組合來優(yōu)化同期發(fā)情的方案，對發(fā)情后的母犬進(jìn)行配種，進(jìn)一步觀察其懷孕率和產(chǎn)仔數(shù)，旨在建立一種能夠提高犬誘同期發(fā)情率、懷孕率以及產(chǎn)仔數(shù)的技術(shù)方案，提高犬的繁殖率，同時方便人們對犬進(jìn)行統(tǒng)一配種、繁殖、撫育和管理等。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

選取沈陽某警犬基地3～4歲健康德國牧羊犬母犬36只，體重為 27.56±3.41 kg，所有試驗犬發(fā)情正常且自然交配后能夠分娩產(chǎn)仔。經(jīng)常規(guī)體檢與編號后，分別飼養(yǎng)于陽光充足且有足夠運動空間的犬舍中，統(tǒng)一飼喂商品化犬糧。

1.2 試劑及設(shè)備

用于陰道上皮細(xì)胞涂片和染色的試劑、器械：0.9%滅菌生理鹽水、甲醇溶液、瑞吉氏染色液、無菌棉簽、載玻片、顯微鏡。

用于同期發(fā)情的激素和卵巢監(jiān)測設(shè)備：前列腺素(PG，0.5 mg/支)、孕馬血清促性腺激素(PMSG 1 000 IU/支)、人絨毛膜促性腺激素(HCG 1 000 IU/支)、PG600(PMSG 400 IU+HCG 200 IU/支)、FG600(FSH 400 IU+HCG 200 IU/支)均來自于廣州威生醫(yī)藥科技有限公司；彩色多普勒超聲儀(型號為MyLab50，意大利百勝集團(tuán))。

1.3 外源激素使用的時間

試驗中所選取的犬只使用外源激素的時間為距離上次發(fā)情5～6個月。

1.4 試驗方案

將選取的3～4歲健康德國牧羊犬母犬36只，隨機(jī)分為A、B、C 3個試驗組和對照組D組。每組9只，每組設(shè)3個重復(fù)，每個重復(fù)3只。A、B、C、D組分別采用不同激素(PG/PMSG/HCG、PG/PG600/HCG、PG/FG600/HCG、空白)組合進(jìn)行同期發(fā)情處理，外源激素處理方案見表1。

表1 外源激素處理方案

1.5 檢測內(nèi)容及項目

1.5.1 各組同期發(fā)情率、受胎率、產(chǎn)仔數(shù)的測定 同期發(fā)情率以經(jīng)激素處理后發(fā)情時間不超過5 d視為同期發(fā)情；各組受胎率=(配種后經(jīng)超聲檢查懷孕犬?dāng)?shù)÷各組總?cè)當(dāng)?shù))×100%；產(chǎn)仔數(shù)為母犬配種后分娩的仔犬?dāng)?shù)。

1.5.2 多普勒超聲儀對卵泡的監(jiān)測 使用彩色多普勒超聲儀監(jiān)測各組卵泡最大直徑、卵泡透亮度和卵泡數(shù)量。每天監(jiān)測1次，結(jié)果取平均值。同期發(fā)情的判定，以各犬間開始發(fā)情時間不超過5 d視為同期發(fā)情。對于外源激素處理組和空白對照組,在發(fā)情后用公犬自然交配，通過最終是否產(chǎn)仔犬來確定受胎率。

1.5.3 陰道角化上皮細(xì)胞的檢測 每組隨機(jī)選擇具有發(fā)情癥狀的5只犬，對其發(fā)情前2 d、發(fā)情當(dāng)天(記為0)、發(fā)情后的第2、4、6、8、10、12、14天的陰道進(jìn)行采樣、涂片,用瑞吉氏染色液進(jìn)行染色、鏡檢。

1.6 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與分析

2.1 同期發(fā)情率的檢測

A、B、C、D組同期發(fā)情率檢測結(jié)果見表2。結(jié)果顯示：B組同期發(fā)情率最高，與A、C、D組差異顯著(<0.05)，其次為A組，C組最低。

表2 各組同期發(fā)情率檢測結(jié)果

2.2 彩色多普勒超聲儀對卵巢發(fā)育的監(jiān)測

超聲儀監(jiān)測結(jié)果表明：4組卵泡平均最大直徑差異不顯著(>0.05)，但A、B、C組卵泡數(shù)量較對照組多，且平均排卵時間較對照組縮短(表3)。對卵巢和卵泡發(fā)育及形態(tài)進(jìn)行超聲監(jiān)測結(jié)果顯示(圖1)：A組，HCG注射后第4天觀察到3個卵泡，其中遠(yuǎn)離探頭的卵泡透亮，接近探頭的2個卵泡不透亮；B組，HCG注射后第4天觀察到的卵泡最大直徑為2.69 cm，卵泡透亮，卵泡界限明顯；C組，HCG注射后第4天觀察到一側(cè)卵巢內(nèi)有3個卵泡，卵泡均比較透亮，卵泡最大直徑0.9 cm。D組發(fā)情后第3天的卵泡最大直徑為1.06 cm，但是與A、B、C相比卵巢內(nèi)界限模糊，卵泡不明顯。

表3 各組卵泡發(fā)育超聲監(jiān)測

圖1 卵巢和卵泡發(fā)育的超聲監(jiān)測

2.3 陰道上皮細(xì)胞完全角化時間檢查結(jié)果

隨機(jī)選取A、B、C、D組中具有發(fā)情癥狀的5只犬，將涂片檢查陰道上皮細(xì)胞完全角化(圖2)的犬編號記錄在相應(yīng)天數(shù)內(nèi)。結(jié)果表明，A、B、C組陰道上皮細(xì)胞完全角化時間比D組提前，主要集中在發(fā)情后的6～8 d，而D組陰道上皮細(xì)胞完全角化時間集中在發(fā)情后的10～14 d。具體見圖3。

圖2 陰道涂片角化上皮細(xì)胞檢查(100×)

圖3 陰道上皮細(xì)胞完全角化時間

2.4 受胎率和產(chǎn)仔數(shù)

對A、B、C、D組受胎率和產(chǎn)仔數(shù)的統(tǒng)計結(jié)果見表4。結(jié)果顯示：C組受胎率最高，與A、B、D組差異顯著(<0.05)。A、B、C組的平均產(chǎn)仔數(shù)均高于對照組，差異顯著(<0.05)，A組產(chǎn)仔數(shù)最高，與B組產(chǎn)仔數(shù)相比差異不顯著(>0.05),與C、D組產(chǎn)仔數(shù)相比差異顯著(<0.05)。

表4 各組受胎率和產(chǎn)仔數(shù)

3 討 論

3.1 多種外源激素聯(lián)合使用能夠誘導(dǎo)德國牧羊犬同期發(fā)情

國內(nèi)外學(xué)者在開展誘導(dǎo)犬同期發(fā)情激素的選擇上，有使用單一激素誘導(dǎo)，如Dernsis等將3只處于乏情期的比格犬用PMSG按500 IU/d的注射劑量進(jìn)行處理，直到出現(xiàn)發(fā)情癥狀，使用外源激素處理時間最長為10 d左右。也有采用2種外源激素誘導(dǎo)犬同期發(fā)情，如張躍駿等采用1次注射PMSG 500 IU/只、24 h/次，連用5 d，第10天1次注射HCG 500 IU/只和1次注射PMSG 500 IU/只、24 h/次，連用7 d，第10天1次注射HCG 500 IU/只2個處理方案，結(jié)果表明2個外源激素處理方案均能很好地誘導(dǎo)犬同情發(fā)情及排卵，同期發(fā)情率達(dá)100%，排卵率分別為55%和75%。張玉西等研究表明，PMSG、PG、HCG聯(lián)合使用時具有較好的催情作用，用PMSG+PG和PMSG+HCG處理的發(fā)情率最高，達(dá)62.96%和61.54%，催情效果優(yōu)于PMSG單獨使用。本研究依據(jù)不同外源激素的作用機(jī)理，如PG具有較好的溶解黃體作用、促使卵巢上的卵泡發(fā)育而發(fā)情，PMSG具有催情和排卵的作用，HCG具有使卵泡成熟和排卵的作用等，采用不同激素聯(lián)合使用后，A、B、C組出現(xiàn)發(fā)情的平均天數(shù)為4～7 d，而對照組出現(xiàn)發(fā)情的平均天數(shù)為11 d，且并未出現(xiàn)同期發(fā)情。說明多種外源激素聯(lián)合使用可以誘導(dǎo)德國牧羊犬同期發(fā)情，并可以縮短母犬的發(fā)情時間。其中B組同期發(fā)情率最高，同期發(fā)情率為90%；這可能是該組藥物中PG600所含的PMSG能夠促進(jìn)卵泡成熟，HCG能夠促進(jìn)排卵的原因。本試驗結(jié)果對犬同期發(fā)情的效果要優(yōu)于張玉西的報道，與張躍駿報道相一致。

3.2 外源激素聯(lián)合使用未對德國牧羊犬卵泡發(fā)育產(chǎn)生影響

Renton研究表明，通過超聲儀連續(xù)監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)與激素水平變化不相符的卵泡發(fā)育情況：使用外源激素后，導(dǎo)致了部分試驗犬卵泡發(fā)育過大。因此通過超聲儀監(jiān)測卵泡發(fā)育，發(fā)現(xiàn)藥物是否對卵巢產(chǎn)生影響，尤其是對卵巢過度刺激征象情況進(jìn)行監(jiān)測，有利于對臨床用藥劑量合理調(diào)整進(jìn)行指導(dǎo)。本試驗中，通過超聲對卵泡監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，使用外源激素后，僅加快了卵泡成熟和排卵時間，并未對卵泡的發(fā)育形態(tài)產(chǎn)生影響(各激素組卵泡最大直徑與對照組之間差異不顯著)。這是否與試驗中各試驗組所選取試驗犬?dāng)?shù)量有限，以及試驗犬為3～4歲的青年犬等因素帶來的試驗差異有關(guān)，還有待進(jìn)一步的驗證。

3.3 對陰道上皮細(xì)胞的監(jiān)測可以預(yù)判外源激素誘導(dǎo)犬同期發(fā)情時間

Hatoya等對陰道上皮細(xì)胞的變化與發(fā)情周期之間的關(guān)系研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)陰道上皮細(xì)胞完全角化時，犬處于發(fā)情期，可對犬進(jìn)行配種。但是在使用藥物后，對發(fā)情周期產(chǎn)生影響的犬，其陰道上皮細(xì)胞的變化情況，還未見報道。本試驗通過對犬陰道上皮的涂片監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)使用外源激素后，可以使陰道上皮細(xì)胞完全角化時間提前到6～8 d，結(jié)合超聲儀對卵泡的發(fā)育監(jiān)測，使用外源激素后，陰道上皮細(xì)胞完全角化的時間與卵泡成熟的時間基本一致。因此，使用外源激素后，也同樣可以通過對陰道上皮細(xì)胞的變化，來預(yù)判犬的發(fā)情周期。

3.4 外源激素聯(lián)合使用可有效提高德國牧羊犬的受胎率和產(chǎn)仔數(shù)

豐培金等認(rèn)為聯(lián)合使用PMSG和HCG，可誘導(dǎo)母犬同期發(fā)情，但人工授精后受胎率較低，主要原因在于P4降低導(dǎo)致黃體功能不足。結(jié)合以往的研究結(jié)果，本試驗在選擇外源激素對各試驗組的處理上，增加使用PG，以提高黃體功能。試驗結(jié)果表明，使用PG聯(lián)合其它外源激素處理后的各試驗組，受孕率與自然交配的受孕率基本一致，并未降低。試驗C組受胎率最高，是否與FSH有關(guān)，有待進(jìn)一步驗證。本試驗中的外源激素方案A組合(PG/PMSG/HCG)使德國牧羊犬的產(chǎn)仔數(shù)最高，該結(jié)果與張玉西的報道相一致。由于不同犬種、不同體型的犬在發(fā)情周期、平均產(chǎn)仔數(shù)方面存在部分差異。本試驗結(jié)果是否對其他犬種適用，還需要更多的相關(guān)數(shù)據(jù)來驗證。

4 結(jié) 論

本試驗通過對德國牧羊母犬采用外源激素組合進(jìn)行處理后，發(fā)現(xiàn)陰道上皮細(xì)胞完全角化的時間與卵泡成熟的時間基本一致；外源激素A組合(PG/PMSG/HCG)誘導(dǎo)德國牧羊犬同期發(fā)情并自然交配后產(chǎn)仔數(shù)最高，對于犬的高效繁殖具有重要的臨床意義，可以在德國牧羊犬的繁殖中進(jìn)行推廣應(yīng)用。