梁淑芳

(四川大學(xué) 生物治療國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 四川 成都 610041)

合成生物學(xué)是綜合分子和細(xì)胞生物學(xué)、進(jìn)化系統(tǒng)學(xué)、生物化學(xué)、信息學(xué)、數(shù)學(xué)、計(jì)算機(jī)和工程學(xué)等多學(xué)科技術(shù)體系發(fā)展起來(lái)的交叉新學(xué)科.作為21世紀(jì)初新興的生物學(xué)研究領(lǐng)域,合成生物學(xué)是在闡明并模擬生物合成的基本規(guī)律之上,基于標(biāo)準(zhǔn)化、去耦化和模塊化達(dá)到人工設(shè)計(jì)并構(gòu)建新的、有特定生理功能的生物系統(tǒng),從而建立藥物、功能材料或能源替代品等的生物制造途徑.隨著基因組測(cè)序技術(shù)的飛躍發(fā)展,大量微生物、真菌甚至植物的基因組序列測(cè)序完成并公開(kāi)共享,這也推動(dòng)了合成生物學(xué)在微生物領(lǐng)域的應(yīng)用.一系列微生物遺傳操作工具和技術(shù)方法被不斷發(fā)展和優(yōu)化,進(jìn)而靶向改造現(xiàn)有的微生物天然產(chǎn)物生物合成途徑,甚至創(chuàng)造潛在的有特定生理功能的生物合成途徑,最終實(shí)現(xiàn)目標(biāo)產(chǎn)物的高效制造[1].

微生物源天然產(chǎn)物不僅包括抗生素(如鏈霉素、達(dá)托霉素)[2]、免疫抑制劑(如雷帕霉素)[3]、抗真菌藥(如哈霉素)[4]、抗腫瘤藥物(如博萊霉素、紫杉醇)[5]等醫(yī)療藥物,還有能源、農(nóng)業(yè)抗蟲(chóng)劑、食品、芳香劑等用途[6-7].微生物因?yàn)閾碛休^快的生長(zhǎng)速度、較高的生產(chǎn)效率、簡(jiǎn)單的遺傳操作而被廣大研究者關(guān)注和研究.除此之外,微生物還擁有豐富的輔因子、天然產(chǎn)物前體代謝產(chǎn)物及復(fù)雜的翻譯后修飾系統(tǒng).因此,微生物被不斷改造以便提供最優(yōu)的天然產(chǎn)物合成途徑.部分微生物,如大腸桿菌、酵母、枯草芽孢桿菌、鏈霉菌等,因其廣泛的碳源利用能力、復(fù)雜的翻譯后修飾系統(tǒng)、高效的分泌系統(tǒng)而被不斷改造成工程菌,為高效生產(chǎn)高附加值的天然產(chǎn)物提供良好的平臺(tái)[8].隨著人工智能的快速發(fā)展,機(jī)器人技術(shù)和集成軟件也被廣泛應(yīng)用于自動(dòng)化標(biāo)準(zhǔn)工作流程,從而促進(jìn)合成生物學(xué)工作效率的顯著提升,進(jìn)而推動(dòng)天然產(chǎn)物發(fā)掘工作的飛躍發(fā)展.

本文對(duì)合成生物學(xué)在微生物領(lǐng)域的最新研究?jī)?nèi)容及應(yīng)用案例進(jìn)行了概述,并對(duì)提升微生物天然產(chǎn)物產(chǎn)量的合成生物學(xué)策略和工具進(jìn)行了總結(jié)和討論,還對(duì)人工智能應(yīng)用于微生物天然產(chǎn)物產(chǎn)量的提升和發(fā)掘進(jìn)行了總結(jié)和展望.

1 設(shè)計(jì)構(gòu)建微生物天然產(chǎn)物的合成路徑

1.1 理性設(shè)計(jì)天然產(chǎn)物生物合成通路通過(guò)文本挖掘工具進(jìn)行文獻(xiàn)挖掘、通過(guò)網(wǎng)絡(luò)模型進(jìn)行模型預(yù)測(cè)、通過(guò)合成生物學(xué)進(jìn)行人工途徑合理設(shè)計(jì)重構(gòu),來(lái)探索和設(shè)計(jì)有效生產(chǎn)所需化合物的合成途徑(圖1A).生物學(xué)研究前沿和路徑設(shè)計(jì)中數(shù)據(jù)源的積累仍然記錄在文獻(xiàn)中,這些文獻(xiàn)提供了大量的生物學(xué)信息.文獻(xiàn)挖掘已經(jīng)從簡(jiǎn)單的術(shù)語(yǔ)識(shí)別發(fā)展到相互作用關(guān)系的綜合分析,并從蛋白質(zhì)相互作用的單一認(rèn)知擴(kuò)展到路徑合作的系統(tǒng)調(diào)控.一方面,建立了以Pubmed和Medline為主的海量文獻(xiàn)高效處理平臺(tái);另一方面,一系列的文本挖掘工具,如Textpresso[9]、LitMiner[10]等,不僅可以識(shí)別、提取、整合和分析文獻(xiàn)數(shù)據(jù),還能發(fā)現(xiàn)新的、隱藏的或不可預(yù)測(cè)的信息.

隨著基因組學(xué)及相關(guān)技術(shù)的發(fā)展,大量的微生物基因組序列分析解讀用于產(chǎn)生高質(zhì)量的基因組規(guī)模的代謝重建,可用于產(chǎn)生綜合代謝模型.因此,一系列數(shù)據(jù)庫(kù)隨之興盛,為微生物代謝譜解析及代謝重構(gòu)提供參考[11].其中,antiSMASH作為一個(gè)網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器和獨(dú)立的工具,已成為鑒定和分析細(xì)菌、真菌及植物基因簇最廣泛使用的工具[12].除此之外,BIGG作為高質(zhì)量基因組規(guī)模代謝模型的集中存儲(chǔ)庫(kù),已完成了165個(gè)代謝模型(http://bigg.ucsd.edu),涵蓋78種微生物[13].這些基因組規(guī)模代謝模型的應(yīng)用從理論研究到實(shí)用研究都是為了彌合基因型和表型之間的差距,其收錄的代謝產(chǎn)物及代謝反應(yīng)依然為微生物的代謝重建提供參考.總之,通過(guò)文獻(xiàn)調(diào)研、生物信息學(xué)分析、計(jì)算機(jī)建模等,合理設(shè)計(jì)科學(xué)、可行的生物合成通路.

1.2 構(gòu)建和優(yōu)化生物合成通路大多數(shù)次級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成基因簇在常規(guī)培養(yǎng)條件下是轉(zhuǎn)錄沉默的,不利于天然產(chǎn)物的表達(dá)積累[14].因此,激活沉默基因簇是發(fā)現(xiàn)新活性天然產(chǎn)物的有效途徑之一.天然產(chǎn)物的生物合成通常是包含多種基因及其控制元件完成的多步驟途徑,對(duì)這些基因或操控元件進(jìn)行改造優(yōu)化,可實(shí)現(xiàn)天然產(chǎn)物產(chǎn)量的提升或新產(chǎn)物的發(fā)掘.基因表達(dá)的精確調(diào)控是天然產(chǎn)物產(chǎn)生的關(guān)鍵步驟,如通過(guò)對(duì)影響產(chǎn)物合成過(guò)程中關(guān)鍵途徑關(guān)鍵酶的活性或表達(dá)豐度的提升以最大限度地合成目標(biāo)產(chǎn)物.啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄因子工程是實(shí)現(xiàn)基因精準(zhǔn)調(diào)控的重要途徑,模塊化工程則是實(shí)現(xiàn)目標(biāo)產(chǎn)物修飾的高效途徑之一(圖1B).

一方面,內(nèi)源性啟動(dòng)子由于不能及時(shí)控制和持續(xù)最大化細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄水平而受到限制,通過(guò)位點(diǎn)選擇突變?cè)鰪?qiáng)啟動(dòng)子強(qiáng)度,或以核心啟動(dòng)子區(qū)域和上游激活序列為重點(diǎn)構(gòu)建啟動(dòng)子文庫(kù),篩選高活性啟動(dòng)子[15].總之,啟動(dòng)子工程作為合成生物學(xué)不可或缺的一部分,是調(diào)節(jié)遺傳回路和協(xié)調(diào)生物合成途徑的關(guān)鍵因素.另一方面,因?yàn)閱?dòng)子只能精準(zhǔn)控制一個(gè)元件或基因,所以存在一定局限性.而轉(zhuǎn)錄因子因能同時(shí)控制代謝途徑中多種酶的豐度或活性廣泛應(yīng)用于提高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量[16].研究人員在不斷尋找高效正調(diào)控因子的同時(shí),對(duì)已有轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)域或模塊進(jìn)行編輯或融合來(lái)顯著提高轉(zhuǎn)錄因子的活性[17].另外,轉(zhuǎn)錄因子誘餌通過(guò)模擬與負(fù)調(diào)控因子結(jié)合從而阻止負(fù)調(diào)控因子結(jié)合相關(guān)DNA靶點(diǎn),以此來(lái)干擾基因調(diào)控,實(shí)現(xiàn)天然產(chǎn)物合成通路的激活[18].

此外,基于遺傳操作優(yōu)化生物合成通路,從而產(chǎn)生目標(biāo)化合物的各種衍生物也成為篩選活性天然產(chǎn)物的重要途徑之一.Kudo等[19]基于CRISPR-Cas9及Gibson組裝技術(shù)對(duì)雷帕霉素(rapamycin)合成基因簇中的模塊進(jìn)行刪除及替換,從而獲得一系列活性較好、毒性較低的rapamycin衍生物.

1.3 生物合成通路異源高效表達(dá)除了通過(guò)優(yōu)化生物合成途徑提高天然產(chǎn)物合成效率,提高微生物發(fā)酵的產(chǎn)率也很重要.許多微生物內(nèi)源次級(jí)代謝產(chǎn)物積累的水平不能滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需求,是因?yàn)椴糠痔烊划a(chǎn)物在本宿主中沒(méi)有充足的碳氮源、前體或代謝中間產(chǎn)物的供給來(lái)滿足目標(biāo)代謝途徑的需求,因而產(chǎn)量極低.相反,生產(chǎn)工程菌在經(jīng)過(guò)一系列的基因組優(yōu)化、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、蛋白質(zhì)工程和代謝工程優(yōu)化后,有著高效的調(diào)控系統(tǒng)、高性能的催化系統(tǒng)及豐富的前體和輔因子,還擁有最優(yōu)的流向目標(biāo)化合物同時(shí)降低或消除競(jìng)爭(zhēng)途徑消耗的代謝流[20].因此,適宜規(guī)?；a(chǎn)的工程菌為可再生和可持續(xù)的化工替代品的生產(chǎn)提供了高效環(huán)保的細(xì)胞工廠(圖1C).

圖1 合成生物學(xué)技術(shù)挖掘微生物天然產(chǎn)物

工程菌在經(jīng)過(guò)一系列的靶向代謝重編程后,其代謝流集中流向目標(biāo)化合物.因此,眾多天然產(chǎn)物合成基因簇在轉(zhuǎn)入工程菌后,其產(chǎn)量被提高數(shù)倍甚至數(shù)千倍[21].例如,將灰紫紅菌素(griseorhodin)生物合成通路轉(zhuǎn)入變鉛青鏈霉菌(Streptomyceslividans,S.lividans)ΔYA10工程菌后,其產(chǎn)量比野生型提高了5倍;而在轉(zhuǎn)入白色鏈霉菌(Streptomycesalbus,S.albus)Del14底盤(pán)細(xì)胞后,其產(chǎn)量更是提高了11倍[22].不僅如此,越來(lái)越多的植物天然產(chǎn)物也嘗試構(gòu)建微生物工程菌生產(chǎn),大大縮短了生產(chǎn)周期并提高了產(chǎn)量[23].例如,青蒿素、人參皂甙在轉(zhuǎn)入糧酒酵母工程菌后,其產(chǎn)量都有了質(zhì)的飛躍[24-25].

2 幾種合成生物學(xué)有關(guān)的技術(shù)

2.1 基因編輯技術(shù)源源不斷的基因組信息促進(jìn)了一系列基因組編輯工具的發(fā)展,而這些不斷更新的DNA編輯工具則進(jìn)一步促進(jìn)了沉默基因簇的重構(gòu)和激活[26],最終提高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量.目前,聚類規(guī)則間隔短回文重復(fù)序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)/CRISPR相關(guān)蛋白(Cas)系統(tǒng)廣泛應(yīng)用于眾多生物體的基因功能研究.CRISPR/Cas9系統(tǒng)在引導(dǎo)RNA(Guide RNA,gRNA)的介導(dǎo)下,靶向基因組DNA,并招募Cas9蛋白對(duì)靶DNA進(jìn)行切割形成雙鏈斷裂(Double-strand break,DSB),并以外源導(dǎo)入的同源DNA為模板,通過(guò)體內(nèi)同源重組酶進(jìn)行同源修復(fù)(Homology-direct repair,HDR),從而達(dá)到基因敲除、插入及突變的目的(圖2A).

CRISPR/Cas9系統(tǒng)極大地促進(jìn)了對(duì)微生物高效率的基因組編輯[27],但即使在減少gRNA的情況下,Cas9毒性仍然存在,并且導(dǎo)致Cas9逐漸丟失[28].因此,其他基因組編輯工具如Cas12a等也在不斷被開(kāi)發(fā)優(yōu)化[26],以期獲得更高的基因編輯效率和更低的毒性.通過(guò)失活Cas9的核酸內(nèi)切酶活性而獲得dead Cas9(dCas9)[29].dCas9應(yīng)用于無(wú)DSB的、單核苷酸刪除的基因組編輯系統(tǒng).dCas9連接DNA脫氨酶以進(jìn)行基因編輯,該系統(tǒng)包括一個(gè)胞苷和一個(gè)基于腺苷脫氨酶的堿基編輯器(Base editor),利用dCas9-gRNA復(fù)合物發(fā)現(xiàn)并結(jié)合目標(biāo)DNA,胞苷脫氨酶通過(guò)胞苷脫氨基作用將目標(biāo)C轉(zhuǎn)化為U(圖2B).類似地,該系統(tǒng)也能在約7個(gè)核苷酸框內(nèi)將A:T堿基對(duì)轉(zhuǎn)化為G:C堿基對(duì)[30].

文獻(xiàn)[31]還發(fā)展了將多種嵌合的dCas9-DNA脫氨酶融合進(jìn)行精確的基因編輯和位點(diǎn)特異性突變的生成,然后用于選擇耐藥表型.堿基編輯器降低了DSB對(duì)染色體的壓力和Cas9的毒性,除了引入終止密碼子使基因失活外,還具有巨大的應(yīng)用潛力,如通過(guò)糾正不理想的點(diǎn)突變或使假基因恢復(fù)功能狀態(tài),通過(guò)在體內(nèi)交換關(guān)鍵殘基進(jìn)行蛋白質(zhì)工程改造,以及通過(guò)在一個(gè)結(jié)構(gòu)中復(fù)用gRNAs來(lái)進(jìn)行全路徑工程優(yōu)化[30].總之,堿基編輯器是對(duì)CRISPR-Cas基因組編輯工具技術(shù)的補(bǔ)充.

除此之外,將dCas9與轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子(如RNA聚合酶因子σ因子、bEBPs結(jié)合蛋白、AsiA)結(jié)合,在gRNA的介導(dǎo)下靶向目標(biāo)序列,從而使轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子增加目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄水平[32](圖2C).類似地,失活的dCas9在gRNA的介導(dǎo)下準(zhǔn)確地靶向基因組DNA后,與dCas9形成復(fù)合物,在空間上阻止RNA聚合酶的進(jìn)展并抑制目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄,從而達(dá)到抑制基因表達(dá)的效果(圖2D).目前,dCas9與不同的酶活性蛋白聯(lián)系起來(lái),從而廣泛應(yīng)用至轉(zhuǎn)錄調(diào)控、表觀遺傳修飾和熒光基因組追蹤等[33].

圖2 CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)

2.2 基因簇克隆技術(shù)在一個(gè)可遺傳的宿主中異源表達(dá)單個(gè)基因、一串基因甚至整個(gè)生物合成基因簇是挖掘相應(yīng)天然產(chǎn)物的一種有效途徑[34].為了將

這些天然產(chǎn)物生物合成基因簇引入異源宿主,快速獲取這些基因簇都是必不可少的.獲取生物合成基因簇的方法可歸結(jié)為2種方法：一是直接克隆方法,二是體內(nèi)外重構(gòu)方法.

直接克隆方法中經(jīng)典且廣泛應(yīng)用的是篩選基因組文庫(kù),即通過(guò)限制性內(nèi)切酶酶切基因組,將基因組片段化,隨后將基因組片段克隆至能承載大基因組片段的載體,如細(xì)菌的BAC載體系列和P1噬菌體的PAC載體系列[35]、大腸桿菌-鏈霉菌穿梭質(zhì)粒pStreptoBAC V[36],來(lái)獲得目的基因簇.BAC載體系列是基于大腸桿菌F-可繁殖質(zhì)粒,能容納長(zhǎng)達(dá)300 kb的基因組大片段,使其適合于大多數(shù)基因簇的捕獲[37].通過(guò)這種方法可建立一個(gè)基因組文庫(kù),并可通過(guò)高通量篩選新化合物(圖3A).然而,這種基于限制性內(nèi)切酶的基因組消化,沒(méi)有靶向性,即使有高通量篩選助力,也增加了研究者的工作量.

此外,部分直接克隆方法是基于整合酶介導(dǎo)的位點(diǎn)特異性重組來(lái)克隆獲得目的基因.Du等[38]開(kāi)發(fā)了一種φBT1整合酶介導(dǎo)的位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng),并應(yīng)用該系統(tǒng)克隆了鏈霉菌中長(zhǎng)達(dá)157 kb的基因簇.盡管該方法可抓取大的DNA片段,獲得較高的克隆效率,然而,該方法需要經(jīng)過(guò)一輪單交叉和一輪雙交叉,耗時(shí)耗力.文獻(xiàn)[39]結(jié)合限制酶和RecET重組(exonuclease combined with RecET recombination,ExoCET)直接將細(xì)菌和哺乳動(dòng)物基因組中任何選擇的區(qū)域克隆到目標(biāo)質(zhì)粒中(圖3B).ExoCET結(jié)合了體外核酸內(nèi)切酶和退火以及全長(zhǎng)RecET同源重組(HDR)從基因組DNA制備物中提取特定區(qū)域.該方法結(jié)合限制性內(nèi)切酶和同源重組,靶點(diǎn)明確,顯著降低盲目性,且目標(biāo)基因簇及載體借助RecET同源重組酶在大腸桿菌中進(jìn)行同源重組,一周內(nèi)就可完成一輪基因簇的克隆抓取,顯著縮短工作周期,提高工作效率,但該方法往往受限制性內(nèi)切酶限制.因此,該團(tuán)隊(duì)隨后嘗試結(jié)合CRISPR-Cas9酶切和RecET同源重組酶進(jìn)行基因簇抓取克隆,然而這個(gè)嘗試并沒(méi)有獲得良好的克隆效率,甚至效率很低[40].

目前也開(kāi)發(fā)了多種體內(nèi)外DNA組裝工具以便高效、快速地重構(gòu)優(yōu)化生物合成通路[41](圖4).Gibson assembly及其他一些基于重組酶的體外重組、體內(nèi)酵母重組[42],在生物合成通路重構(gòu)方面都取得好的進(jìn)展.其中,基于5′外切酶、DNA聚合酶和DNA連接酶協(xié)同作用的Gibson assembly,已被用于組裝高達(dá)900 kb的DNA片段[43](圖4A).體內(nèi)重組,主要是基于酵母及大腸桿菌體內(nèi)的重組酶介導(dǎo)具有相同同源臂的DNA片段連接成環(huán)狀DNA(圖4B).iCOPE則是基于Cas12a突變體及其gRNA、T4連接酶、可在一個(gè)反應(yīng)中編輯或組裝DNA片段的方法.Cas12a突變體擁有廣泛的識(shí)別位點(diǎn),在體外轉(zhuǎn)錄的一對(duì)相應(yīng)gRNA的引導(dǎo)下,在特定位點(diǎn)上切割靶DNA,隨后在T4連接酶作用下,將具有相同黏性末端的DNA片段鏈接,從而將DNA片段組裝成環(huán)狀DNA(圖4C).iCOPE不僅高效,且在操作大質(zhì)粒方面也很有前景[44].

隨著DNA組裝工具的不斷發(fā)展,開(kāi)發(fā)了眾多體外重組試劑盒且應(yīng)用廣泛.酵母作為高效且廣泛應(yīng)用的體內(nèi)重組系統(tǒng),用于天然產(chǎn)物合成通路的重組及優(yōu)化.如基于酵母重組,利用即插即用方法激活多個(gè)沉默天然產(chǎn)物基因簇[45].除了將基因簇各元件擴(kuò)增后再重組而激活目標(biāo)基因簇,在原始基因組或者直接克隆的帶有目標(biāo)基因簇的載體上進(jìn)行修飾進(jìn)而優(yōu)化通路,同樣可以達(dá)到激活基因簇的目的.除此之外,通過(guò)在宿主基因組的主要結(jié)構(gòu)基因前插入強(qiáng)啟動(dòng)子、激活通路特異性正向調(diào)控因子等措施同樣可以有效提高天然產(chǎn)物的產(chǎn)量[46-47].

2.3 酶工程蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)的主要承擔(dān)者,在自然界中發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)傳統(tǒng)上是最常用的生物催化劑,用于生產(chǎn)從商品化學(xué)品到藥物等多種天然產(chǎn)物.酶工程在代謝工程的發(fā)展中,特別是在天然產(chǎn)物的生物合成中,已經(jīng)成為一個(gè)強(qiáng)大的生物技術(shù)工具箱.近年來(lái),酶工程已成為天然產(chǎn)物生物合成中提高酶活性、提高酶穩(wěn)定性、擴(kuò)大產(chǎn)物譜的一種有效方法[48].

從蛋白活性方面入手激活天然產(chǎn)物.天然產(chǎn)物生物合成的主要瓶頸之一是涉及的催化或合成酶活性有限.將外源酶整合到微生物底盤(pán)中可能會(huì)降低其催化活性,甚至導(dǎo)致功能喪失.提高酶活性以加速生產(chǎn)過(guò)程是這一領(lǐng)域的主要目標(biāo).通過(guò)隨機(jī)突變提高酶對(duì)特定底物的催化活性是蛋白質(zhì)工程中使用的典型策略.如通過(guò)隨機(jī)突變,釀酒酵母異戊烯基二磷酸異構(gòu)酶的催化活性提高了2.53倍,從而使番茄紅素產(chǎn)量(1.24 g/L)比野生型提高2.1倍[49].然而,這種隨機(jī)突變策略產(chǎn)生的酶庫(kù)通常是巨大的,而且大多數(shù)變異體已降低到無(wú)活性,使得篩選工作耗時(shí)耗力且效率低下.因此,首選的方法是分析目標(biāo)酶的結(jié)構(gòu),并在結(jié)合位點(diǎn)或活性域附近設(shè)計(jì)位點(diǎn)定向突變,以提高其催化活性.

酶活性固然重要,酶穩(wěn)定性依然不可忽視.酶的穩(wěn)定性是多方面的,包括熱穩(wěn)定性、pH耐受性、溶解度以及對(duì)鹽和有機(jī)溶劑的耐受性.提高熱穩(wěn)定性可以使酶在高溫下發(fā)揮作用[50].分子分析表明,熱穩(wěn)定性的提高是由于表面電荷增加和結(jié)構(gòu)柔韌性降低所致[51].在結(jié)構(gòu)導(dǎo)向一致性概念的指導(dǎo)下,葡萄糖1-脫氫酶的熱穩(wěn)定變體在65 ℃下產(chǎn)生并顯示出極大的半衰期改善(3.5 d),后來(lái)發(fā)現(xiàn)它也能耐受高濃度的鹽和有機(jī)溶劑[52].酶也被設(shè)計(jì)來(lái)適應(yīng)所需的環(huán)境pH值.例如,在木質(zhì)素降解中起主要作用的漆酶,喜歡更高的溫度和pH值.一種來(lái)自Botrytis aclada的真菌漆酶經(jīng)過(guò)定向進(jìn)化獲得了更高的最適pH值,在中性pH值下其活性增加了5倍[53].

3 人工智能加速微生物天然產(chǎn)物創(chuàng)制

合成生物學(xué)技術(shù)大大提高了發(fā)掘創(chuàng)造活性化合物的速度.隨著人工智能的快速發(fā)展,機(jī)器人技術(shù)和集成軟件也被廣泛應(yīng)用于自動(dòng)化標(biāo)準(zhǔn)工作流程,從而使合成生物學(xué)工作的效率得以顯著提升.合成生物學(xué)是由多種非線性工作流程組成的“按需制造”,而生物學(xué)實(shí)驗(yàn)存在異質(zhì)性和動(dòng)態(tài)性,使得工作流程因批次間的變化而更加復(fù)雜[54].

近年來(lái),生物鑄造廠(Biofoundries)已經(jīng)發(fā)展成為自動(dòng)化設(shè)計(jì)—建造—測(cè)試—工程周期一體化,解決了生物工程過(guò)程中緩慢、昂貴且重復(fù)性低的幾大難題[55].已有機(jī)器人系統(tǒng)結(jié)合機(jī)器學(xué)習(xí)算法的應(yīng)用,該應(yīng)用可完成完全自動(dòng)化生物系統(tǒng)的設(shè)計(jì)、構(gòu)建、測(cè)試和學(xué)習(xí)過(guò)程[56].這個(gè)全自動(dòng)的機(jī)器人平臺(tái)BioAutomata評(píng)估了不到1%的可能變異,比隨機(jī)篩選高出77%,并且研究者利用機(jī)器人平臺(tái)優(yōu)化了番茄紅素生物合成途徑,提高其產(chǎn)量.

4 展望

在過(guò)去的20年,全基因組測(cè)序的突破揭示了微生物尚未開(kāi)發(fā)的生物合成潛力,從而奠定了深入研究微生物和挖掘微生物天然產(chǎn)物的基礎(chǔ).蛋白質(zhì)組測(cè)序則有助于找出微生物應(yīng)對(duì)體內(nèi)外刺激所做出的生化反應(yīng),從而為研究和揭示相關(guān)蛋白功能及生化過(guò)程提供重要參考[57-59].利用多組學(xué)數(shù)據(jù)和基因組規(guī)模的代謝網(wǎng)絡(luò)模型進(jìn)行系統(tǒng)分析,預(yù)測(cè)代謝工程的目標(biāo),并重新設(shè)計(jì)代謝通量,以最大限度地提高目標(biāo)天然產(chǎn)物的產(chǎn)量[58,60].新的分子操作工具如DNA組裝、重組和基因組編輯技術(shù)的發(fā)展減少了克隆和編輯基因簇所需的時(shí)間,提高了克隆和編輯基因簇的效率.新技術(shù)的出現(xiàn)也促進(jìn)了異源宿主的工程化,從而使天然產(chǎn)物在遺傳上易于產(chǎn)生.此外,通過(guò)合成基因的模塊進(jìn)行重新編程,可以生產(chǎn)出新的天然化合物衍生物,擴(kuò)展天然產(chǎn)物的生物活性.

對(duì)天然或改進(jìn)的基因進(jìn)行模塊化重構(gòu),無(wú)論是天然產(chǎn)物修飾還是產(chǎn)生新分子,都是一種非常有效的方法.這些技術(shù)的集成將有助于我們理解復(fù)雜的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和代謝網(wǎng)絡(luò),從而通過(guò)基因簇編輯、通路改造、代謝通量?jī)?yōu)化、酶工程、調(diào)控電路重連和宿主修飾來(lái)發(fā)現(xiàn)和生產(chǎn)新的天然產(chǎn)物.隨著知識(shí)和信息的增加,天然產(chǎn)物“谷歌地圖”也將隨之產(chǎn)生,類似于Lee等[61]報(bào)道的“生物化學(xué)地圖”,突出了單個(gè)或多個(gè)生化反應(yīng)的策略和途徑,為設(shè)計(jì)和生產(chǎn)特定的感興趣的天然產(chǎn)物提供重要依據(jù).

近年來(lái),人工智能技術(shù)和集成軟件也逐漸拓展到生命科學(xué)研究.機(jī)器人的應(yīng)用,避免了人為因素導(dǎo)致的誤差或低效率,在節(jié)約成本的同時(shí),快速精準(zhǔn)地完成項(xiàng)目?jī)?nèi)容.盡管目前還未廣泛應(yīng)用機(jī)器人等人工智能系統(tǒng),但隨著人工智能的快速發(fā)展,相信在不久的將來(lái),人工智能系統(tǒng)會(huì)被廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物的發(fā)掘和生產(chǎn),更多更優(yōu)的天然產(chǎn)物來(lái)源產(chǎn)品更快地問(wèn)世,以滿足人們的需求.

總之,代謝工程和合成生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)展將為發(fā)現(xiàn)和生產(chǎn)多種有價(jià)值的活性化合物提供強(qiáng)大的解決方案,并有望開(kāi)啟天然產(chǎn)物發(fā)掘的新黃金時(shí)代.合成生物學(xué)技術(shù)及產(chǎn)品因其高效性、精準(zhǔn)性已被廣泛應(yīng)用于市場(chǎng),其對(duì)人口健康、生物醫(yī)藥等領(lǐng)域?qū)a(chǎn)生深遠(yuǎn)影響[62-63].

致謝本文得到四川大學(xué)生物治療國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和四川省人民醫(yī)院張丹博士在圖片構(gòu)思編輯上的大力協(xié)作,在此一并致謝.