胡勁召，張璇，王永強(qiáng)，徐佳敏，盧洪斌，葉長(zhǎng)兵，劉曉暉，陳中兵，盧少勇*

1.海南熱帶海洋學(xué)院

2.湖泊水污染治理與生態(tài)修復(fù)技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室, 中國(guó)環(huán)境科學(xué)研究院

3.玉溪師范學(xué)院化學(xué)生物與環(huán)境學(xué)院

4.捷克生命科學(xué)大學(xué)環(huán)境科學(xué)學(xué)院

磺胺類(lèi)抗生素(sulfonamides，SAs)是我國(guó)生產(chǎn)、銷(xiāo)售和使用量最大的抗生素之一，具有抗菌譜廣、穩(wěn)定性高、親水性較強(qiáng)的特性，能干擾和抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)與繁殖[1-2]?；前奉?lèi)抗生素在自然水體表層水中檢出濃度在ng/L～μg/L量級(jí)，在污泥、沉積物及土壤中檢出濃度在μg/kg～mg/kg量級(jí)[3]。水環(huán)境中的SAs主要來(lái)源于畜禽養(yǎng)殖廢水、生活污水和污水處理廠出水。阮?lèi)傡车萚4]在養(yǎng)殖水體沉積物中發(fā)現(xiàn)磺胺甲噻二唑、磺胺二甲氧嘧啶的檢出率較高，濃度為1.5～30.1 μg/kg。Samaraweera等[5]對(duì)位于科倫坡和?？ǘ磐叩?個(gè)市政污水處理廠連續(xù)7 d和24 h進(jìn)出水樣品中17種常見(jiàn)抗生素進(jìn)行監(jiān)測(cè)，發(fā)現(xiàn)所有出水樣品中均可檢測(cè)到磺胺甲惡唑(sulfamethoxazole，SMX)、甲氧芐氨嘧啶(trimethoprim)、諾氟沙星(norfloxacin)、氧氟沙星(ofloxacin)和環(huán)丙沙星(ciprofloxacin)，在污水處理過(guò)程中抗生素僅被部分去除。由于抗生素不斷進(jìn)入水環(huán)境，對(duì)水生動(dòng)植物和人類(lèi)健康構(gòu)成極大威脅[6-7]。

人工濕地(constructed wetlands，CWs)常被用于去除水中常規(guī)污染物，同時(shí)作為二級(jí)污水處理系統(tǒng)對(duì)包括抗生素在內(nèi)的新污染物可以起到良好的凈化效果[8-10]。人工濕地內(nèi)植物的吸收和富集與微生物的生物降解對(duì)污染物的去除起到重要作用。人工濕地植物作為濕地生物過(guò)程中的主體，是濕地生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，在濕地運(yùn)行中起著非常重要的作用[11]。Liang等[12]研究發(fā)現(xiàn)，水生植物蘆葦、香蒲、香根草和美人蕉對(duì)人工濕地中的SMX去除率約為73%。楊月琴等[13]研究不同水生植物對(duì)布洛芬和羅紅霉素的去除效果，發(fā)現(xiàn)美人蕉對(duì)布洛芬的去除率最高(69.74%)，花葉蘆竹對(duì)羅紅霉素的去除率最高(94.06%)。植物通過(guò)光合作用將氧氣運(yùn)輸?shù)街参锔担瑸槲⑸锾峁┝己玫纳姝h(huán)境，促進(jìn)微生物對(duì)水體中污染物的降解。然而，人工濕地植物在處理含抗生素廢水的過(guò)程中會(huì)受到抗生素的長(zhǎng)期脅迫，由于抗生素濃度和植物本身的耐受程度不同，植物的響應(yīng)機(jī)制也存在差異[7]。Liu等[14]研究了不同濃度鹽酸環(huán)丙沙星、鹽酸土霉素和磺胺甲嘧啶對(duì)蘆葦?shù)臐撛谟绊懀l(fā)現(xiàn)抗生素濃度大于10 g/L時(shí)對(duì)根活性和葉綠素有毒性作用，而濃度為0.1～10 g/L時(shí)對(duì)植物根系活力和葉片葉綠素有促進(jìn)作用。Liu等[15]研究發(fā)現(xiàn)，模擬廢水中紅霉素濃度為0.06 mg/L時(shí)，羊角月牙藻(Pseudokirchneriella subcapitata)的生物量開(kāi)始下降。此外，抗生素可能通過(guò)影響根際微生物群落的結(jié)構(gòu)和功能間接影響植物發(fā)育。有研究表明，抗生素脅迫可以減少微生物多樣性，抑制與硫和氮循環(huán)相關(guān)的功能細(xì)菌群[16]。Zhang等[17]研究發(fā)現(xiàn)，四環(huán)素濃度為1 μg/L時(shí)，可以顯著改變序批式活性污泥反應(yīng)器（SBR）中微生物群落結(jié)構(gòu)，Shannon-Weiner指數(shù)和Simpson指數(shù)達(dá)到最大值。Button等[18]研究發(fā)現(xiàn)，SMX進(jìn)入濕地系統(tǒng)后微生物群落優(yōu)勢(shì)菌群相對(duì)豐度減少，微生物活性受到了抑制。

目前針對(duì)高濃度抗生素脅迫下植物與根際微生物聯(lián)合修復(fù)中植物理化指標(biāo)及根際微生物群落的響應(yīng)特征研究仍然不足。筆者以人工濕地中分布較廣泛的5種挺水植物為研究對(duì)象，探究濕地典型挺水植物與根際微生物聯(lián)合修復(fù)對(duì)不同濃度SMX的去除效果，選擇根系較發(fā)達(dá)的唐菖蒲和風(fēng)車(chē)草，對(duì)其根系活力、活性氧與抗氧化系統(tǒng)在不同濃度SMX脅迫以及溫度變化下的響應(yīng)差異進(jìn)行評(píng)價(jià)和分析，同時(shí)探究根際微生物群落結(jié)構(gòu)組成與功能的變化，以期為植物與根際微生物聯(lián)合修復(fù)技術(shù)在水污染處理中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試水生植物唐菖蒲(A)、風(fēng)車(chē)草(B)、燈心草(C)、水蔥(D)和水芹(E)，購(gòu)自江蘇宿遷飛達(dá)花卉園藝公司。選取SMX為目標(biāo)抗生素，其純度為98%，購(gòu)自上海百舜生物科技有限公司。Hoagland營(yíng)養(yǎng)液為格林凱爾公司生產(chǎn)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

用去離子水洗凈植物根系，將植物根部表面附著的沉積物去除，用1/5 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液水培60 d至植物生長(zhǎng)穩(wěn)定。選取生理表型一致的植株作為試驗(yàn)對(duì)象，在營(yíng)養(yǎng)液中加入 0、1、10、30、50、100 mg/L不同濃度梯度的SMX進(jìn)行處理，以0 mg/L為對(duì)照，不同處理中水生植物的種植密度為16株/m2，設(shè)置3個(gè)平行，每5 d更換1次營(yíng)養(yǎng)液，運(yùn)行周期為60 d。試驗(yàn)于2019年在山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝實(shí)驗(yàn)站進(jìn)行，自然光照，培養(yǎng)溫度為20～25 ℃，濕度為60%～80%。試驗(yàn)的前30 d，對(duì)不同濃度SMX在5種植物與根際微生物聯(lián)合修復(fù)中的去除效果進(jìn)行測(cè)定與分析。依據(jù)SMX的去除效果，對(duì)2組去除效果較好的植物，采集其葉片及根部進(jìn)行植物活性氧、抗氧化系統(tǒng)的測(cè)定；并在人工模擬氣候室中，調(diào)節(jié)溫度分別為4、8、12、24 ℃，測(cè)定溫度脅迫下2種植物活性氧、抗氧化系統(tǒng)的變化；對(duì)2種植物在0 mg/L（CK）、1 mg/L（S1）、50 mg/L（S50）營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)下的根際微生物進(jìn)行采集，進(jìn)行微生物群落多樣性分析。

1.3 抗生素的測(cè)定

1.3.1 色譜條件

使用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜LC-30AD+LCMS-8060(Shimadzu，日本)測(cè)定抗生素濃度。色譜柱為InertSustainTM Bio-C18(2.1×100 mm，1.9 μm)，流動(dòng)相A相為0.1%甲酸，B相為乙腈，流速為0.4 mL/min；柱溫為 40 ℃，進(jìn)樣量為 2 μL，洗脫方式為梯度洗脫。梯度洗脫程序：0～1.0 min，90% A相，10% B 相，流速 0.40 mL/min；1.0～8.0 min，5% A 相，95% B 相 ， 流 速 0.40 mL/min；8.0～ 10.0 min，5%A 相，95% B 相，流速 0.40 mL/min；10.0～10.10 min，90% A相，10% B相，流速0.40 mL/min。

1.3.2 色譜條件

離子源為ESI，加熱模塊溫度為400 ℃，霧化氣流速為3.0 L/min；干燥氣流速為10.0 L/min，加熱氣流速為 10.0 L/min；掃描模式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(multiple-reaction monitoring，MRM)，接口溫度為 300℃，駐留時(shí)間為17 ms；DL溫度為250 ℃。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢測(cè)限

抗生素檢測(cè)采用內(nèi)標(biāo)法定量，內(nèi)標(biāo)物質(zhì)為磺胺甲惡唑-d4(SMX-d4)。各抗生素的標(biāo)準(zhǔn)曲線為f(x)=383 987x+589 143，相關(guān)系數(shù)(R2)為0.996 8。檢出限為 0.03 μg/L，定量限為 0.10 μg/L，精密度為 4.12%，回收率為96.33%。樣品抗生素檢出限與定量限按照信噪比3倍與10倍設(shè)定，分別進(jìn)行了場(chǎng)地空白、方法空白和平行樣試驗(yàn)，用于控制背景值影響及交叉影響。

1.4 根系活力與抗氧化系統(tǒng)指標(biāo)測(cè)定

1.4.1 根系活力的測(cè)定

根系活力采用TTC法[19]測(cè)定。稱(chēng)取混合根系樣品0.5 g 放入遮光處理的試管中，加入0.4% TTC溶液和磷酸緩沖液等量混合液10 mL，使根充分浸沒(méi)，在37 ℃水浴鍋中保溫3 h后加入2 mL硫酸，對(duì)照為先加硫酸再加根系。將根取出，吸干水分后與3～4 mL乙酸乙酯一起磨碎，將紅色提取液移入試管中，并將殘?jiān)礈旄蓛?，使最終體積為10 mL，在485 nm下比色。

1.4.2 抗氧化系統(tǒng)的測(cè)定

稱(chēng)取0.5 g新鮮葉片，加入2 mL磷酸緩沖液(0.05 mol/L，pH為7.8)，冰浴研磨，轉(zhuǎn)移至離心管中，再以2 mL的緩沖液清洗研缽，4 ℃下10 000 r/min離心20 min后，取上清液冷藏保存。依據(jù)湯葉濤等[20]的研究方法測(cè)定丙二醛(MDA)、過(guò)氧化氫(H2O2)和超氧陰離子(O2-)濃度。超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化物酶(POD)和過(guò)氧化氫酶(CAT)的活性測(cè)定與Liu等[21]的方法相同。

1.5 高通量測(cè)序

1.5.1 DNA提取

參考de Bulgarelli等[22]的方法，隨機(jī)取植物根部(5 g)浸沒(méi)于無(wú)菌PBS溶液中，180 r/min孵育10 min后取出，此過(guò)程重復(fù)3次，將3次洗滌液匯總后過(guò)0.22 μm濾膜，收集濾膜備測(cè)植物根部微生物菌群。備測(cè)濾膜置于-80 ℃超低溫冰箱，避光保存。

1.5.2 微生物多樣性檢測(cè)與分析

根據(jù) E.Z.N.A.? soil DNA kit (Omega Bio-tek,Norcross, GA, 美國(guó))說(shuō)明書(shū)進(jìn)行DNA 抽提，使用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的提取質(zhì)量，使用NanoDrop 2000 UV-vis spectrophotometer (Thermo Scientific, Wilmington，美國(guó))測(cè)定DNA濃度和純度。利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)系統(tǒng)內(nèi)的不同微生物聚集形態(tài)進(jìn)行分析，引物由上海生工生物工程股份有限公司制備，PCR 反應(yīng)：預(yù)變性，95 ℃，3 min；變性，95 ℃，30 s；退火，56 ℃，30 s；延伸，72 ℃，40 s 變性至延伸步驟，重復(fù)35次。序列F:TCCTACGGGAG GCAGCAGT； 序 列R:GGACTACCAGGGTATCTA ATCCTGTT。在97%的相似水平下對(duì)所有序列進(jìn)行OTUs (operational taxonomic units)劃分并與RDP(Ribosomal Database Project)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，基于此進(jìn)行物種組成、Alpha多樣性及群落結(jié)構(gòu)分析。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)均采用Excel 2016軟件進(jìn)行預(yù)處理，并用Origin 2017軟件進(jìn)行繪圖；采用Alpha多樣性分析評(píng)價(jià)微生物群落的豐富度和多樣性，利用PICRUSt功能預(yù)測(cè)軟件進(jìn)行微生物群落代謝功能預(yù)測(cè)。使用單因素方差法分析不同植物對(duì)相同濃度SMX的去除率以及同一植物在不同濃度SMX脅迫下生理指標(biāo)間的差異性，其中當(dāng)P＜0.05時(shí)認(rèn)為具有顯著性差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 5種人工濕地植物對(duì)SMX的去除效果

5種植物水培30 d后對(duì)不同初始濃度的SMX(1～100 mg/L )的去除率如圖1所示。由圖1可見(jiàn)，當(dāng)SMX濃度為1和10 mg/L 時(shí)，對(duì)SMX去除率最高的是水芹(65.39%、52.97%)，其次是風(fēng)車(chē)草(61.47%、48.56%)。SMX濃度為30～100 mg/L時(shí)，對(duì)SMX去除率最高的為風(fēng)車(chē)草(35.87%～43.22%)，其次是唐菖蒲(27.45%～35.21%)。值得注意的是，水蔥、水芹對(duì)SMX的去除率隨著時(shí)間的推移而顯著下降。SMX濃度較低時(shí)，抗生素對(duì)植物的脅迫作用較弱，此時(shí)植物根部通過(guò)主動(dòng)吸收和物理吸附去除SMX，而高濃度SMX可能對(duì)這2種植物的根系產(chǎn)生較強(qiáng)影響。SMX的去除分為2個(gè)階段：前期大量SMX被吸附于植物根部；隨著抑制作用增強(qiáng)，根系活力受到影響，無(wú)法吸收根表富集的SMX，使得SMX從根部重新釋放于水中。周品成等[23]研究發(fā)現(xiàn)，隨著水培液中抗生素濃度的增加，高濃度(大于100 μg/L)的抗生素會(huì)抑制植物生長(zhǎng)，使植株株高和葉綠素濃度顯著小于對(duì)照處理；Liu等[14]發(fā)現(xiàn)較高濃度(大于10 μg/L)環(huán)丙沙星、土霉素和磺胺嘧啶對(duì)蘆葦根活力及葉片葉綠素合成有抑制作用，而較低濃度(0.1～1.0 μg/L)抗生素則有促進(jìn)作用。5種人工濕地植物中，唐菖蒲和風(fēng)車(chē)草對(duì)1～100 mg/L的SMX的平均去除率分別為27.45%～45.32%和35.87%～61.48%。唐菖蒲為根莖型植物，耐污能力較強(qiáng)，而風(fēng)車(chē)草為須根型植物，根系發(fā)達(dá)，能夠更好地適應(yīng)和耐受抗生素環(huán)境，生物代謝活性高，這可能是2種植物具有較強(qiáng)SMX去除性能的重要原因。研究表明，人工濕地植物對(duì)抗生素環(huán)境的耐受性很可能取決于其根系發(fā)達(dá)程度，根系越發(fā)達(dá)，分泌的根系分泌物就越多，從而更好地緩解抗生素的脅迫和改善周?chē)母H環(huán)境，降低外界環(huán)境毒性[22]。

2.2 SMX脅迫下唐菖蒲和風(fēng)車(chē)草生理指標(biāo)變化

2.2.1 根系活力

根系活力大小可以反映根系代謝強(qiáng)度大小。由圖2可見(jiàn)，SMX濃度為1和10 mg/L時(shí)，2種植物的根系活力均高于SMX濃度為0 mg/L時(shí)，說(shuō)明植物根系對(duì)SMX脅迫有一定的抵抗能力，可通過(guò)提高代謝作用來(lái)緩解SMX對(duì)自身的傷害。鮑陳燕等[24]研究發(fā)現(xiàn)，在土霉素、恩諾沙星濃度為50～100 μg/L時(shí)，水芹根系活力并未受到抑制，反而進(jìn)一步促進(jìn)了水芹根系的生長(zhǎng)。但張?zhí)飕摰萚25]研究發(fā)現(xiàn)，磺胺二甲基嘧啶濃度達(dá)到10 mg/L、環(huán)丙沙星濃度達(dá)到5 mg/L時(shí)，均能抑制小麥的根系活力，且隨著抗生素濃度的升高小麥根系氧化還原力降低，根系活力逐漸減弱。本研究中，SMX濃度高于30 mg/L時(shí)，2種植物的根系活力顯著下降(均低于SMX濃度為0 mg/L時(shí))，且SMX濃度越大，根系活力受抑制程度越強(qiáng)，進(jìn)而影響植物固氮能力，并且原生質(zhì)形成和葉酸合成也會(huì)受到抑制，從而影響谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶和一系列抗氧化系統(tǒng)酶的合成表達(dá)[26]?？梢?jiàn)，抗生素濃度一旦超過(guò)臨界濃度，就會(huì)抑制植物根系活力，影響根系養(yǎng)分的吸收。這與廖德潤(rùn)等[27]的研究結(jié)果類(lèi)似，其研究表明，低濃度的抗生素對(duì)空心菜植株的生長(zhǎng)具有刺激效應(yīng)，而高濃度條件則表現(xiàn)出抑制效應(yīng)。

圖 1 5種植物水培30 d后對(duì)不同初始濃度SMX的去除率Fig.1 Removal rates of SMX with different initial concentrations of five plants after 30 days of hydroponic cultivation

圖 2 不同SMX濃度下唐菖蒲和風(fēng)車(chē)草根系活力變化Fig.2 Changes of root activity of Gladiolus hybridus and Cyperus alternifolius in the presence of different initial concentrations of SMX

2.2.2 活性氧與抗氧化系統(tǒng)指標(biāo)

植物細(xì)胞在代謝過(guò)程中，會(huì)通過(guò)光還原反應(yīng)、梅勒反應(yīng)及光呼吸等過(guò)程產(chǎn)生一系列活性氧自由基(ROS)，如超氧陰離子（O2-）、過(guò)氧化氫（H2O2）、丙二醛（MDA）等[28]。ROS常被稱(chēng)為植物體內(nèi)的毒副作物，當(dāng)ROS積累到超過(guò)植物抗氧化清除能力的程度時(shí)，可造成膜脂過(guò)氧化及蛋白質(zhì)、DNA損傷。MDA是膜脂過(guò)氧化作用的終產(chǎn)物，也是表征膜系統(tǒng)受害程度的重要指標(biāo)。本研究中，唐菖蒲和風(fēng)車(chē)草體內(nèi)ROS、H2O2和MDA隨SMX濃度上升而不斷增加（圖3）。當(dāng)SMX濃度超過(guò)10 mg/L時(shí)，與0 mg/L相比，唐菖蒲和風(fēng)車(chē)草體內(nèi)MDA濃度最高增加1.66和1.45倍。Nie等[29]觀察到究乳糖酸紅霉素、鹽酸環(huán)丙沙星和SMX脅迫下羊角月牙藻(Pseudokirchneriella subcapitata)發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化，MDA濃度顯著增加。楊彎彎等[30]也觀察到抗生素脅迫下銅綠微囊藻中MDA濃度增加的現(xiàn)象。

植物體內(nèi)抗氧化酶主要包括SOD、CAT、POD。SOD是超氧化物自由基清除劑，可將超氧化物催化轉(zhuǎn)化為O2和H2O，在植物抵抗外界環(huán)境脅迫中起著非常重要的作用。當(dāng)植物處于逆境時(shí)，CAT等保護(hù)酶能有效地清除過(guò)氧化物所產(chǎn)生的活性氧物質(zhì)，防御植物細(xì)胞膜過(guò)氧化，降低植物受傷害的程度。POD是植物體內(nèi)普遍存在的、活性較高的一種酶，其活性大小反映了植物生長(zhǎng)條件的好壞。由圖3可知，與對(duì)照組相比，SMX濃度為1 mg/L時(shí)，CAT、POD、SOD活性均升高，說(shuō)明植物在SMX存在時(shí)受到了氧化脅迫，誘導(dǎo)了抗氧化酶活性，以清除過(guò)多的ROS，使植物對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力增強(qiáng)而有利于水體污染物的去除。這與陳友媛等[31]的研究結(jié)果一致。當(dāng)SMX濃度為50和100 mg/L時(shí)，由于植物體內(nèi)ROS大量產(chǎn)生并積累，抑制了抗氧化酶的活性，該SMX濃度已經(jīng)超過(guò)植物自身抗氧化酶系統(tǒng)保護(hù)的范圍，說(shuō)明抗氧化酶系統(tǒng)保護(hù)是有限的。Riaz等[32]在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，氟喹諾酮類(lèi)抗生素濃度為300 mg/L時(shí)，抗氧化酶系統(tǒng)無(wú)法保護(hù)小麥免受抗生素增加的脅迫。因此，在SMX脅迫下，會(huì)促進(jìn)植物體內(nèi)ROS的產(chǎn)生，抑制植物抗氧化酶系統(tǒng)。

2.3 溫度脅迫下唐菖蒲和風(fēng)車(chē)草生理指標(biāo)變化

溫度是影響植物生長(zhǎng)發(fā)育最重要的非生物因素之一[33]，其不僅影響植物的生長(zhǎng)，而且對(duì)植物體內(nèi)的ROS含量、抗氧化酶系統(tǒng)產(chǎn)生明顯影響。通過(guò)人工模擬氣候室的溫控系統(tǒng)進(jìn)行調(diào)控，不同溫度脅迫下唐菖蒲和風(fēng)車(chē)草ROS含量及抗氧化酶活性變化如圖4所示。由圖4可知，隨著溫度降低，SOD、CAT、POD含量均減少。研究表明，低溫脅迫下植物抗氧化防御系統(tǒng)會(huì)遭到破壞，酶活性下降[34]。但本研究發(fā)現(xiàn)，O2-和MDA含量隨溫度的降低而逐漸增加。這是由于植物體內(nèi)的活性氧一般處于動(dòng)態(tài)平衡，低溫脅迫能引起植物體內(nèi)活性氧含量增加，植物膜脂過(guò)氧化程度加大，導(dǎo)致植物MDA產(chǎn)生量增加[35]。李任任等[36]研究也發(fā)現(xiàn)，低溫出苗下，甜菜幼苗葉片中MDA含量較高。因此，溫度的變化在一定程度上刺激植物活性氧含量增加，抑制了植物抗氧化酶的活性。

圖 3 不同濃度SMX對(duì)唐菖蒲和風(fēng)車(chē)草的活性氧自由基含量和抗氧化酶活性的影響Fig.3 Effects of SMX at different concentrations on reactive oxygen species content and antioxidant enzyme activity of Gladiolus hybridus and Cyperus alternifolius

2.4 微生物群落多樣性分析

2.4.1 多樣性與豐富度指數(shù)

采用α多樣性指數(shù)(Shannon-Weiner指數(shù)、ACE指數(shù)、Chao指數(shù)、Simpson指數(shù)和樣品覆蓋率)評(píng)價(jià)唐菖蒲和風(fēng)車(chē)草的物種豐富度和微生物群落多樣性[37-38]，結(jié)果如表1所示。由表1可知，所有樣本覆蓋率均超過(guò)98%，說(shuō)明序列分析可以覆蓋幾乎完整的細(xì)菌種群和相應(yīng)數(shù)量的OTUs[39-40]。添加1 mg/L SMX時(shí)，唐菖蒲和風(fēng)車(chē)草根際微生物Chao指數(shù)大于對(duì)照組，而在該濃度下根系活力也有所提高，說(shuō)明添加1 mg/L 的SMX促進(jìn)植物根系活力提升的同時(shí)也促進(jìn)微生物物種豐富度增加。Xu等[41]研究表明，低劑量抗生素可刺激微生物群落活性，增加根際細(xì)菌群落的豐度和多樣性。但添加50 mg/L 的SMX時(shí)，唐菖蒲和風(fēng)車(chē)草根際微生物Chao指數(shù)小于添加1 mg/L的SMX。Xie等[40]的研究同樣發(fā)現(xiàn)，Chao指數(shù)在MFC系統(tǒng)中隨著SMX濃度增加而降低。

表 1 樣品中微生物群落組成的豐富度指數(shù)Table 1 Richness index of microbial community composition in the sample

Shannon-Weiner指數(shù)常用于表征物種的多樣性，同時(shí)反映物種的豐富度和均勻度[42]。添加1 mg/L的SMX后，唐菖蒲Shannon-Weiner指數(shù)從4.26降至3.81，風(fēng)車(chē)草Shannon-Weiner指數(shù)從4.83增至5.14。在SMX濃度為50 mg/L 時(shí)，唐菖蒲和風(fēng)車(chē)草根際微生物Shannon-Weiner指數(shù)相比于SMX為0和1 mg/L 時(shí)均顯著降低。其原因可能是在SMX去除過(guò)程中起作用的微生物作為優(yōu)勢(shì)種保留下來(lái)，而其他微生物被消除，導(dǎo)致物種豐富度降低。同樣的現(xiàn)象在污水處理廠中也被發(fā)現(xiàn)，如魏健等[43]研究發(fā)現(xiàn)，向污水處理廠的曝氣生物濾池中逐漸通入抗生素廢水，OTUs 從264降至220，微生物多樣性指數(shù)從3.06降至3.01。類(lèi)似的研究還表明，過(guò)度的抗生素污染會(huì)降低根際微生物的多樣性[44]。

2.4.2 根際微生物群落結(jié)構(gòu)與組成分析

在不同水平上檢測(cè)微生物的相對(duì)豐度，以確定不同植物-微生物耦合體系處理SMX時(shí)微生物群落組成和結(jié)構(gòu)的響應(yīng)特征（圖5）。

在門(mén)水平上〔圖5（a）〕，按相對(duì)豐度從大到小選擇11個(gè)菌門(mén)（相對(duì)豐度均大于1%）進(jìn)行分析。變形菌門(mén)（Proteobacteria）是各樣品中的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)（豐度為72.87%），其次是放線菌門(mén)(Actinobacteria，豐度為8.49%)和擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes，豐度為6.08%)，說(shuō)明SMX的引入增加了變形菌門(mén)、放線菌門(mén)、擬桿菌門(mén)的相對(duì)豐度，這3個(gè)優(yōu)勢(shì)菌門(mén)在處理含抗生素廢水的人工濕地中分布廣泛[45]。其中，變形菌門(mén)包括很多與碳、氮和硫循環(huán)中相關(guān)的細(xì)菌，擬桿菌門(mén)與有機(jī)物的降解密切相關(guān)[46-47]。唐菖蒲和風(fēng)車(chē)草根際微生物群落組成在門(mén)水平上變化較明顯，隨著SMX濃度增加，變形菌門(mén)、厚壁菌門(mén)相對(duì)豐度有不同程度增加。先前有研究表明，變形菌門(mén)包括多種抗生素抗性細(xì)菌(ARB)，SMX的加入可以促進(jìn)變形菌門(mén)在體外循環(huán)中的生長(zhǎng)，并且變形菌有助于芳香族化合物的降解[48]。厚壁菌門(mén)可以產(chǎn)生芽孢，能夠抵抗外部極端環(huán)境，并且厚壁菌門(mén)及其附屬菌群能夠分泌一種降解廢水中有機(jī)污染物的細(xì)胞外酶，如纖維素、脂肪酶和蛋白酶等[42]。此外，系統(tǒng)內(nèi)放線菌門(mén)、擬桿菌門(mén)相對(duì)豐度隨SMX濃度升高而減小。因此，抗生素脅迫影響根際微生物對(duì)污染物和有機(jī)物的吸收、降解和功能代謝。

圖 5 不同水平上檢測(cè)到的微生物的相對(duì)豐度Fig.5 Relative abundance of microorganisms detected at different levels

在屬水平上〔圖5（b）〕，按相對(duì)豐度從大到小選擇20個(gè)菌屬（相對(duì)豐度均大于1%）進(jìn)行分析。優(yōu)勢(shì)菌屬主要為unclassified_f_Burkholderiaceae(豐度為9.41%)、耐熱單胞菌屬 (Thermomonas，豐度為6.70%)、不粘柄菌屬 (Asticcacaulis，豐度為 6.19%)。SMX濃度為0 mg/L時(shí)唐菖蒲根際微生物主要優(yōu)勢(shì)菌屬為耐熱單胞菌屬、檸檬酸桿菌屬 (Citrobacter)，風(fēng)車(chē)草根際微生物主要優(yōu)勢(shì)菌屬為德沃斯氏菌屬(Devosia)、鞘氨醇菌屬 (Sphingomonas)。添加1、50 mg/L SMX后，根際微生物群落的菌屬豐度發(fā)生不同的變化。唐菖蒲中耐熱單胞菌屬、unclassified_f_Burkholderiaceae的豐度先降低后升高，說(shuō)明伯克霍爾德氏菌屬逐漸成為磺胺耐藥菌；而檸檬酸桿菌屬的豐度隨著SMX濃度的增加而降低。unclassified_f_Burkholderiaceae作為變形菌門(mén)中具有代表性的菌科，其中大部分菌屬具有發(fā)酵代謝作用。Qi等[49]在研究中也發(fā)現(xiàn)unclassified_f_Burkholderiaceae可能對(duì)SMX中的苯環(huán)降解起到關(guān)鍵作用。在風(fēng)車(chē)草對(duì)照組中發(fā)現(xiàn)的優(yōu)勢(shì)菌屬，在添加1和50 mg/L的SMX系統(tǒng)內(nèi)發(fā)生了變化，羅河桿菌屬(Rhodanobacter)、硫單胞菌屬(Thiomonas)成為新的優(yōu)勢(shì)菌屬。溫慧洋[50]在研究中發(fā)現(xiàn)，A硫單胞菌屬相對(duì)豐度的升高可能會(huì)導(dǎo)致SMX中S=O雙鍵發(fā)生斷裂，進(jìn)而提高抗生素的去除效率。

2.5 微生物群落代謝功能預(yù)測(cè)

通過(guò)PICRUSt對(duì)抗生素脅迫下植物根際微生物群落level2水平代謝功能進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果如圖6所示。由圖6可知，當(dāng)SMX濃度為1 mg/L時(shí)，唐菖蒲、風(fēng)車(chē)草微生物代謝功能基因豐度大于SMX濃度為50 mg/L時(shí)。微生物細(xì)菌的生物降解和代謝功能基因隨著SMX濃度升高而降低。Zhang等[51]研究發(fā)現(xiàn)，抗生素濃度會(huì)顯著影響植物根系中參與無(wú)機(jī)離子、碳水化合物的轉(zhuǎn)運(yùn)及核苷酸和氨基酸的轉(zhuǎn)化、代謝等功能基因的豐度。微生物群落代謝功能變化是復(fù)雜的，結(jié)合本研究結(jié)果可知，不同濃度的抗生素對(duì)于微生物群落代謝功能的影響不同，磺胺甲惡唑?qū)ξ⑸锎x功能變化的影響，是否有利于提高某些微生物的生存能力有待進(jìn)一步研究。

圖 6 微生物群落代謝功能基因豐度Fig.6 Metabolic gene abundance in microbial community

3 結(jié)論

（1）5種人工濕地植物中，唐菖蒲和風(fēng)車(chē)草對(duì)1～100 mg/L SMX的去除率較高，平均去除率分別為27.45%～45.32%、35.87%～61.48%。二者根系發(fā)達(dá)，具有較強(qiáng)的耐污能力和較高的地上部分生物量，能夠很好地適應(yīng)和耐受抗生素環(huán)境，生物代謝活性高。

（2）在SMX脅迫下，當(dāng)SMX濃度高于30 mg/L時(shí)，唐菖蒲和風(fēng)車(chē)草的根系活力顯著下降，且SMX濃度越大，根系活力受抑制程度越強(qiáng)。隨著SMX濃度的升高，促進(jìn)植物體內(nèi)ROS的產(chǎn)生，抑制植物抗氧化酶系統(tǒng)。低溫脅迫下，植物體內(nèi)ROS含量逐漸升高，植物抗氧化酶活性逐漸降低，植物抗氧化酶系統(tǒng)受到抑制。

（3）唐菖蒲和風(fēng)車(chē)草根際微生物群落組成在門(mén)水平上變化較明顯，SMX濃度升高時(shí)，變形菌門(mén)、厚壁菌門(mén)成為優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，二者可能對(duì)SMX降解起著重要作用；在屬水平上，伯克霍爾德氏菌屬和硫單胞菌屬的富集可能對(duì)SMX的降解起到關(guān)鍵作用。對(duì)微生物群落代謝功能進(jìn)行預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，不同濃度抗生素對(duì)微生物群落代謝功能的影響不同，SMX對(duì)微生物代謝功能變化的影響是否有利于提高某些微生物的生存能力，尚有待進(jìn)一步研究。