胡攀偉，李火明，解海博，陳靜，萬怡婷，楊紅

1.上海中醫(yī)藥大學附屬市中醫(yī)醫(yī)院，上海 200071；2.上海市松江區(qū)方塔中醫(yī)醫(yī)院，上海 201611

子宮內膜異位癥（endometriosis，EMs）是一種雌激素依賴性子宮內膜炎性疾病。其特征是位于子宮內膜的功能性腺體、基質、組織等移位到宮腔外，主要臨床表現(xiàn)為痛經(jīng)、異常子宮出血、不孕癥等，嚴重影響患者生活質量。EMs在婦科疾病中發(fā)病率較高，影響全球超過10%的婦女，目前認為，經(jīng)血逆流可能是其發(fā)病原因，異位子宮內膜通過黏附、侵襲、血管生成等作用種植于宮腔外。西醫(yī)治療EMs主要采用抗雌激素療法，但常誘發(fā)月經(jīng)不調、不孕、免疫系統(tǒng)紊亂等不良反應。

根據(jù)其臨床表現(xiàn)，EMs可屬中醫(yī)學血瘀證范疇。益氣活血方是上海市名中醫(yī)齊聰教授防治EMs復發(fā)的經(jīng)驗方，通過多年臨床觀察與總結，齊聰教授認為，正氣不足、痰瘀互結是EMs復發(fā)的關鍵。課題組前期研究表明，益氣活血方能治療EMs術后復發(fā)，同時明顯改善痛經(jīng)、神疲乏力、非經(jīng)期腹痛、月經(jīng)失調等癥狀。本研究通過觀察益氣活血方對EMs大鼠內膜增殖、黏附、侵襲能力的影響，探討其可能的調控機制，為益氣活血方的深入研究提供基礎。

1 實驗材料

1.1 動物

健康SPF級雌性SD未孕大鼠60只，6～7周齡，體質量（200±20）g，購于北京斯貝福生物技術有限公司，動物許可證SCXK（京）2019-0010。飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學SPF級實驗動物中心，溫度20～24℃，相對濕度50%～60%，晝夜節(jié)律12 h，自由攝食飲水。

1.2 藥物及制備

益氣活血方（黃芪18 g，黨參30 g，麩炒白術9 g，水蛭9 g，三棱15 g，莪術15 g，夏枯草18 g，牡蠣30 g，九香蟲12 g，川牛膝18 g，炙甘草6 g），免煎顆粒購自江陰天江藥業(yè)有限公司。取適量免煎顆粒，加純水配制成濃度分別為0.63、1.25、2.5 g/mL藥液。孕三烯酮膠囊，北京紫竹藥業(yè)公司，2.5 mg/片，批號53190506。取1粒孕三烯酮膠囊內容物，加50 mL純水溶解，配制成0.05 g/mL藥液。苯甲酸雌二醇注射液，四川金科藥業(yè)公司，批號20200402，1 mg/mL。

1.3 主要試劑與儀器

氯仿，國藥化學試劑有限公司，貨號10006818；Trizol，美 國ThermoFisher公 司，貨 號15596026；Prime ScriptMaster Mix，日本Takara公司，貨號RR036A；AceQ qPCR SYBR Green Master Mix，南京諾唯贊生物科技有限公司，貨號Q131-02；上皮細胞鈣黏蛋白（E-cadherin）抗體、基質金屬蛋白酶（MMP）2抗體、MMP9抗體、金屬蛋白酶組織抑制因子1（TIMP1）抗體、Ki-67抗體、增殖細胞核抗原（PCNA）抗體，英國Abcam，貨號分別為ab76319、ab76003、ab92536、ab216432、ab156956、ab92552。HMIAS-2000全自動醫(yī)學彩色圖像分析系統(tǒng)，武漢千屏影像技術有限責任公司；小型垂直電泳儀，美國Bio-Rad；ABI ViiA7實時熒光定量PCR儀，美國ThermoFisher公司；UV-2450紫外光度儀，日本Shimadzu；5424R高速冷凍離心機，德國艾本德公司。

2 實驗方法

2.1 分組與造模

大鼠適應性飼養(yǎng)1周后，按隨機數(shù)字表法將60只大鼠隨機分為空白組、模型組、孕三烯酮組和益氣活血方低、中、高劑量組，每組10只。參照文獻[7-8]造模并加以改進，手術前2日肌肉注射苯甲酸雌二醇0.1 mg/kg，對大鼠陰道涂片進行觀察，選擇動情周期大鼠進行造模。2%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉，將大鼠固定于手術臺上，腹部剪毛后碘伏消毒，無菌條件下于尿道口上方約1 cm處開腹，切口約2 cm，進入腹腔后找到左側子宮和卵巢，在距離卵巢1 cm處結扎子宮兩端，剪取中間約2 cm子宮組織，縱向剖開，剝離子宮內膜，將剝離的子宮內膜縫合于腹膜壁層，術畢關腹。空白組僅剪取子宮組織，不進行縫合。術后連續(xù)3 d皮下注射慶大霉素2000 U預防感染。造模后第3周再次剖腹檢查，見移植的子宮內膜體積增大、呈透明結節(jié)狀或囊狀，內有液體積聚，表面有結締組織覆蓋及血管形成，并與大網(wǎng)膜、腸管、腹壁廣泛黏連，取少許內膜組織行病理檢測，鏡下可見子宮內膜腺體或上皮、間質細胞，提示EMs造模成功，同時測量并記錄異位病灶組織長、寬、高。

2.2 干預及取材

造模成功后開始給藥，根據(jù)成人與大鼠體表面積換算給藥量。益氣活血方低、中、高劑量組每日分別予0.63、1.25、2.5 g/mL益氣活血方藥液灌胃，給藥體積10 mL/kg；孕三烯酮組予孕三烯酮藥液0.26 mg/kg灌胃，每周2次，每次1 mL，其余時間點予生理鹽水10 mL/kg灌胃；空白組和模型組予等體積生理鹽水灌胃。連續(xù)4周。

給藥結束后，皮下注射2%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉大鼠，開腹，用眼科剪剪取異位子宮內膜組織及空白組大鼠右側子宮內膜，取部分內膜組織立即放入10%中性福爾馬林中固定，剩余內膜組織迅速放入液氮中速凍，置于-80℃冰箱保存。

2.3 異位子宮內膜體積計算

根據(jù)測量的異位子宮內膜組織長、寬、高，計算大鼠干預前后異位病灶體積（0.5×長×寬×高）。

2.4 免疫組化檢測

將固定于福爾馬林的子宮內膜組織按常規(guī)方法石蠟包埋、切片（厚度6 μm），65℃烤片20 min，進行脫蠟、復水、抗原修復操作，用10%山羊血清室溫封閉1 h，分別滴加Ki-67、PCNA一抗（均為1∶200），4℃孵育過夜，第2日孵育酶標二抗，滴加DAB顯色劑顯色，蘇木精復染細胞核，酒精脫水后中性樹膠封片。圖像分析系統(tǒng)進行分析，陽性表達呈棕黑色顆粒，計算增殖指數(shù)。增殖指數(shù)（%）=陽性細胞數(shù)÷總細胞數(shù)×100%。

2.5 蛋白免疫印跡檢測

取10 mg異位子宮內膜組織加入RIPA裂解液，機械研磨后，4℃、14000 r/min離心30 min，取上清液，BCA法進行蛋白定量，加入5×loading buffer制備蛋白樣品，依次經(jīng)電泳、轉膜、封閉后，加入E-cadherin、TIMP-1、MMP2、MMP9一 抗（均 為1∶1000），4℃孵育過夜，滴加二抗，室溫孵育1 h，ECL顯色液曝光，掃描圖像后用Image J 1.8.0計算各條帶光密度。

2.6 熒光定量PCR檢測

子宮內膜組織樣本放于冰上滴加Trizol和氯仿，4℃、14000 r/min離心30 min，取上清液，加入異丙醇和無水乙醇后14000 r/min離心20 min，棄上清液，沉淀用DEPC水溶解，配制反應體系，反轉錄成cDNA，進行熒光定量PCR。采用2法計算基因相對表達量。引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。引物序列見表1。

表1 各基因PCR引物序列

3 統(tǒng)計學方法

4 結果

4.1 益氣活血方對模型大鼠異位子宮內膜體積的影響

干預前，各造模大鼠異位子宮內膜體積較空白組顯著增加（＜0.01）；干預后，與空白組比較，模型組大鼠異位子宮內膜體積顯著增加（＜0.01）；與模型組比較，益氣活血方高劑量組和孕三烯酮組大鼠異位子宮內膜體積顯著減少（＜0.05）；與益氣活血方低劑量組比較，孕三烯酮組大鼠異位子宮內膜體積顯著減少（＜0.05）。結果見表2。

表2 各組大鼠異位子宮內膜體積比較（±s，mm3）

4.2 益氣活血方對模型大鼠異位子宮內膜組織Ki-67和增殖細胞核抗原表達的影響

Ki-67主要表達于腺上皮和腺體的細胞核及細胞間質中，PCNA主要表達于正常子宮內膜腺上皮及腺體胞漿中，胞核少量表達。見圖1、圖2。

圖1 各組大鼠異位子宮內膜組織Ki-67表達（免疫組化染色，×200）

圖2 各組大鼠異位子宮內膜組織PCNA表達（免疫組化染色，×200）

與空白組比較，模型組大鼠異位子宮內膜組織Ki-67和PCNA增殖指數(shù)顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，益氣活血方中、高劑量組和孕三烯酮組大鼠異位子宮內膜組織Ki-67增殖指數(shù)顯著降低（＜0.01），益氣活血方低、中、高劑量組和孕三烯酮組大鼠異位子宮內膜組織PCNA增殖指數(shù)顯著降低（＜0.01）；與孕三烯酮組比較，益氣活血方低、中劑量組大鼠異位子宮內膜組織Ki-67和PCNA增殖指數(shù)顯著升高（＜0.01）。見圖3。

圖3 各組大鼠異位子宮內膜組織Ki-67和PCNA增殖指數(shù)比較（±s，每組10只）

4.3 益氣活血方對模型大鼠異位子宮內膜組織黏附、侵襲相關蛋白表達的影響

與模型組比較，益氣活血方高劑量組和孕三烯酮組大鼠異位子宮內膜組織E-cadherin和TIMP1蛋白表達顯著升高（＜0.05，＜0.01），益氣活血方中、高劑量組和孕三烯酮組大鼠異位子宮內膜組織MMP2和MMP9蛋白表達顯著降低（＜0.01）；與孕三烯酮組比較，益氣活血方低、中、高劑量組E-cadherin和TIMP1蛋白表達顯著降低（＜0.01），益氣活血方低劑量組MMP2和MMP9蛋白表達顯著升高（＜0.01）。結果見圖4、表3。

圖4 各組大鼠異位子宮內膜組織E-cadherin、MMP2、TIMP1、MMP9蛋白免疫印跡

表3 各組大鼠異位子宮內膜組織E-cadherin、TIMP1、MMP2、MMP9蛋白表達比較（xˉ±s，每組10只）

4.4 益氣活血方對模型大鼠異位子宮內膜組織黏附、侵襲相關基因表達的影響

與空白組比較，模型組大鼠異位子宮內膜組織E-cadherin和TIMP1基因表達顯著降低（＜0.01），MMP2和MMP9基因表達顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，益氣活血方中、高劑量組和孕三烯酮組大鼠異位子宮內膜組織E-cadherin和TIMP1基因表達顯著升高（＜0.01），MMP2和MMP9基因表達顯著降低（＜0.01）；與孕三烯酮組比較，益氣活血方低、中劑量組E-cadherin和TIMP1基因表達顯著降低（＜0.01），MMP2和MMP9基因表達顯著升高（＜0.05，＜0.01）。見圖5。

圖5 各組大鼠異位子宮內膜組織E-cadherin、TIMP1、MMP2、MMP9基因表達比較（±s，每組10只）

5 討論

EMs是一種慢性良性炎性疾病，但其具有類似腫瘤侵襲性強、復發(fā)性高的特點，治療以手術為主，但易復發(fā)，需長期孕激素干預，且價格昂貴、不良反應多，不能長時間連續(xù)應用，導致患者依從性低，臨床上迫切需要替代療法，改善患者生活質量。

活血化瘀類中藥在改善EMs方面具有顯著效果，能夠發(fā)揮改善炎性內環(huán)境、誘導異位內膜細胞凋亡、抑制血管生成等作用。益氣活血方以黨參、黃芪通陽補氣為君；麩炒白術健脾，三棱、莪術、水蛭活血化瘀，共為臣；川牛膝引經(jīng)通脈，夏枯草、牡蠣軟堅散結，九香蟲理氣止痛，共為佐；炙甘草調和諸藥，為使；全方攻補兼施。本研究通過建立EMs大鼠模型，發(fā)現(xiàn)高劑量益氣活血方能明顯縮小異位子宮內膜體積，提示益氣活血方能有效改善EMs。子宮內膜異位增殖是引起EMs的病理基礎，Ki-67與PCNA是調控細胞增殖的關鍵蛋白，其表達升高提示細胞分裂增多，增殖活性升高。本研究模型組大鼠異位子宮內膜組織Ki-67和PCNA增殖指數(shù)顯著升高，表明細胞分裂旺盛，增殖進程加快，而益氣活血方高劑量組與孕三烯酮組Ki-67和PCNA增殖指數(shù)顯著降低，提示益氣活血方能夠發(fā)揮與孕三烯酮激素相似的抑制異位內膜增殖作用。E-cadherin是一種細胞表面的跨膜糖蛋白，參與維持細胞形態(tài)，具有調節(jié)免疫、炎癥等作用。研究表明，E-cadherin在EMs中低表達，從而增加EMs基質細胞黏附能力，誘發(fā)內膜間質細胞增殖。對比模型組，益氣活血方高劑量組和孕三烯酮組E-cadherin基因和蛋白表達均顯著升高，提示益氣活血方能明顯降低異位子宮內膜黏附、侵襲能力。TIMP1是MMPs的內源性抑制劑，正常情況下TIMPs與MMPs處于動態(tài)平衡，共同調節(jié)細胞外基質的合成與降解。在EMs模型中，MMP2與MMP9基因和蛋白呈高表達，TIMP1呈低表達，從而使基底膜破壞，細胞外基質發(fā)生降解，異位內膜得以侵襲和遷移。益氣活血方干預后，能明顯逆轉EMs下TIMP1和MMP2/9基因及蛋白表達，抑制細胞外基質降解，從而抑制異位病灶侵襲。另外，益氣活血方高劑量組在抑制異位內膜形成、增殖、遷移中與孕三烯酮組作用相當，提示益氣活血方有望替代激素防治EMs。

綜上所述，益氣活血方能通過抑制異位子宮內膜增殖、侵襲、黏附，縮小異位病灶體積，改善大鼠EMs。今后本課題組將繼續(xù)深入探索益氣活血方調控細胞侵襲和黏附作用的具體機制，為益氣活血方治療EMs提供依據(jù)。