王亞楠，袁莉，汪莉，徐志遠(yuǎn)，阮華，程向東，董昌武

1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽 合肥 230000；2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，浙江 杭州 310022；3.杭州市余杭區(qū)中醫(yī)院，浙江 杭州 310022

慢性胃炎（chronic gastritis，CG）是由多種因素引起的黏膜炎癥性疾病，臨床表現(xiàn)以上腹部疼痛、胃脘部脹滿、反酸嘈雜為主，且易反復(fù)發(fā)作，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。CG屬中醫(yī)學(xué)“胃脘痛”“痞滿”“泛酸”等范疇。胃炎的發(fā)展是一個(gè)多步驟、多因素的過(guò)程，可分為淺表性胃炎、萎縮性胃炎、腸化生和異型增生。研究表明，胃炎的發(fā)展會(huì)增加患胃癌的風(fēng)險(xiǎn)。目前，臨床主要通過(guò)胃鏡和病理組織學(xué)檢查進(jìn)行胃炎診斷，中醫(yī)通過(guò)望舌可以了解機(jī)體內(nèi)在氣血盛衰與陰陽(yáng)虛實(shí)，《臨癥驗(yàn)舌法》所謂“凡內(nèi)外雜癥，無(wú)一不呈其形，著其色于舌”，故在胃炎防治中可通過(guò)觀察舌象進(jìn)行疾病的監(jiān)測(cè)和控制。

舌苔微生物是口腔菌群的重要組成部分，舌苔菌群的變化可以為疾病的診斷和治療提供幫助。本研究采用橫斷面研究方法，通過(guò)中醫(yī)舌診AI開(kāi)放平臺(tái)系統(tǒng)對(duì)167例CG患者的舌象進(jìn)行分析，同時(shí)采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)樣本中的16S rDNA基因進(jìn)行測(cè)序分析，以研究舌苔微生物群。

1 資料與方法

1.1 病例來(lái)源

選取2021年1－9月杭州市余杭區(qū)中醫(yī)院消化內(nèi)科經(jīng)電子內(nèi)鏡和病理組織學(xué)檢查確診的慢性萎縮性胃炎（CAG）患者86例、慢性淺表性胃炎（CSG）患者81例，同時(shí)收集其舌象圖片、舌苔樣本及病歷資料。本研究經(jīng)中國(guó)科學(xué)院大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（IRB-2019-56）。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

參照《中國(guó)慢性胃炎共識(shí)意見(jiàn)（2017年，上海）》，CG的內(nèi)鏡診斷系指肉眼或特殊成像方法所見(jiàn)的黏膜炎性變化，需與病理學(xué)檢查結(jié)果結(jié)合做出最終判斷。CSG患者內(nèi)鏡結(jié)果顯示斑點(diǎn)和條狀紅斑，黏膜粗糙不均勻，出血點(diǎn)，糜爛和膽汁反流。CAG患者內(nèi)鏡結(jié)果顯示胃黏膜以白色為主，褶皺變平，黏膜血管暴露，存在黏膜結(jié)節(jié)，同時(shí)，病理活檢顯示固有腺體萎縮。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn)

①年齡40～80歲，性別不限；②無(wú)明顯口腔疾??；③3個(gè)月內(nèi)未使用過(guò)影響舌面顏色的藥物；④新診斷且未經(jīng)治療；⑤有完整的舌面圖像（入組時(shí)舌象收集完成）；⑥患者均對(duì)本研究知情，并簽署知情同意書(shū)。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn)

①無(wú)法耐受胃鏡檢查；②合并胃癌、胃出血等腸道疾病；③合并嚴(yán)重臟器疾病及精神類疾病，語(yǔ)言障礙不能溝通；④哺乳期、孕期婦女；⑤不會(huì)伸舌或伸舌困難者；⑥D(zhuǎn)NA提取量不足，無(wú)法進(jìn)行測(cè)序工作。

1.5 舌象采集與分析

1.5.1 采集時(shí)間與方法

于清晨患者未進(jìn)食狀態(tài)下采集舌象。拍攝時(shí)囑患者放松自然地伸出舌頭，保持舌面展平、舌體放松、舌尖朝下的狀態(tài)。

1.5.2 設(shè)備和軟件

采用配備高清攝像頭的移動(dòng)智能手機(jī)，支持自然光源拍攝。采用安徽中醫(yī)藥大學(xué)與合肥云診信息科技有限公司聯(lián)合研發(fā)的中醫(yī)舌診AI開(kāi)放平臺(tái)系統(tǒng)，通過(guò)捕捉舌象，自動(dòng)提取特征，以輔助中醫(yī)診斷。系統(tǒng)的價(jià)值取決于其校準(zhǔn)亮度和顏色的能力，以補(bǔ)償來(lái)自光源和成像硬件的強(qiáng)度和色溫的變化。舌體區(qū)域圖像被自動(dòng)分割以獲得相關(guān)的舌體特征。系統(tǒng)提取中醫(yī)舌診的主要特征，進(jìn)一步生成有關(guān)長(zhǎng)度、面積、濕度和舌部特征數(shù)量的詳細(xì)信息。結(jié)合人工判斷，形成最終分類，提取5類舌象。①舌色：淡紅舌、紅舌、絳舌；②苔色：白色、黃色；③苔的厚?。汉瘛⒈?、剝落；④苔的腐膩：腐、膩、正常；⑤舌質(zhì)潤(rùn)燥：即唾液面積占舌體總面積的比例（燥或潤(rùn)）。

1.6 舌苔菌群分布

1.6.1 主要試劑與儀器

Pusion Hot start flex 2X Master Mix，上海儀濤生物儀器有限公司（M0536L）；DL2000 DNA Maker，Takara（3427A）；Stool DNA Kit（200），OMEGA bio-tek（D4015-02）；AMPure XT beads，Beckman（A63880）；Gene colour，北京 金博益（GBY-1）；Qubit dsDNA HS Assay Kit（500次），Invitrogen，Life technologies（Q32854）；生工50×TAE Buffer，上海 生 工（B548101-500）；Biowest Agarose G-10，BIOWEST（111860）。

常溫離心機(jī)（Eppendorf Centrifuge 5424），旋渦震蕩儀（華利達(dá)，WH-861 Vortex Shaker），三溫三控恒溫水浴鍋（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司，DK-8D），PCR儀（杭州朗基科學(xué)儀器有限公司，A200基因擴(kuò)增儀），電泳儀（Tanon天能，EPS300），凝膠成像儀（Tanon-2500），超低溫冷凍儲(chǔ)存箱（中科美菱低溫科技有限責(zé)任公司，DW-HL388）。

1.6.2 樣本采集

隨機(jī)收集CAG、CSG各30例舌苔樣本，取樣前漱口，使用一次性無(wú)菌拭子刮取患者舌面3～5次，將其置于1.5 mL舌苔樣本收集小管（含保存液）中，12000 r/min離心5 min，去除上清液，置于超低溫冷凍儲(chǔ)存箱中備用。

1.6.3 DNA抽取與PCR擴(kuò)增

對(duì)樣本舌苔進(jìn)行微生物組總DNA提取，并通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA提取質(zhì)量，同時(shí)采用紫外分光光度計(jì)對(duì)DNA進(jìn)行定量。利用細(xì)菌16S rDNA基因V3～V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列：341F（5"-CCTACGGGNGGCWGCAG-3"）805R（5"-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3"），PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳確證，PCR產(chǎn)物由AMPure XT beads（Beckman Coulter Genomics，Danvers，MA，USA）純化，Qubit（Invitrogen，USA）定量。擴(kuò)增子池用于測(cè)序，擴(kuò)增子文庫(kù)的大小和數(shù)量分別在Agilent2100生物分析儀（Agilent，美國(guó)）和Illumina（Kapa Biosciences，Woburn，MA，美國(guó)）的文庫(kù)定量試劑盒上進(jìn)行評(píng)估，樣品在Illumina NovaSeq平臺(tái)上進(jìn)行測(cè)序。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 2組一般資料比較

CAG組、CSG組性別、吸煙、飲酒比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05），具有可比性。見(jiàn)表1。

表1 CAG組和CSG組一般資料比較

2.2 2組舌象比較

舌色方面，CAG患者以紅舌為主，CSG患者以淡紅舌為主；苔色方面，CAG患者以黃苔為主，CSG患者白苔為主；苔的厚薄方面，CAG患者厚苔居多，CSG患者薄苔較多；苔的腐膩方面，CAG患者以膩苔為主，CSG患者以正常為主；舌質(zhì)潤(rùn)燥方面，2組均以潤(rùn)為主，CAG較CSG患者燥舌增加。2組舌色、苔色、苔的厚薄及腐膩、舌質(zhì)潤(rùn)燥差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.01）。見(jiàn)表2。

表2 CAG組和CSG組舌象比較［例（%）］

2.3 2組舌苔高通量測(cè)序數(shù)據(jù)比較

對(duì)原始下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行雙端拼接、質(zhì)量控制、嵌合體過(guò)濾后，進(jìn)行高質(zhì)量數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，見(jiàn)表3。2組在有效片段數(shù)（=0.124）、片段長(zhǎng)度（=0.525）、Q20%（=0.220）、Q30%（=0.160）、GC%（=0.695）等方面比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表3 舌苔高通量測(cè)序2組比較（xˉ±s，n=30）

2.4 2組舌苔菌群Alpha多樣性比較

Alpha多樣性是指一個(gè)特定環(huán)境或生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)的多樣性，主要反映物種豐富度和均勻度及測(cè)序深度。Alpha多 樣 性 主 要 通 過(guò)Chao1、Observed species、Goods_coverage、Shannon、Simpson等指數(shù)反映豐富度和均勻性。Chao1、Observed_species指數(shù)主要反映樣本的物種豐富度信息；Goods_coverage反映樣本的低豐度f(wàn)eature覆蓋情況；Simpson/Shannon主要綜合體現(xiàn)物種的豐富度（Richness）和均勻度（Eveness）。由圖1可知，CAG與CSG舌苔微生物Alpha多樣性指數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05），說(shuō)明2組舌苔微生物群落差異顯著，CAG組的菌群多樣性明顯高于CSG組。

圖1 CAG組和CSG組舌苔菌群多樣性比較

2.5 2組舌苔菌群組成比較

Venn分析可知，2組共有菌群1213種，其中CAG組特有菌群1880種，CSG組特有菌群1264種。根據(jù)物種豐度表和物種注釋表，選取豐度最高的30個(gè)物種分類，將每個(gè)分組的相對(duì)豐度以堆疊柱狀圖形式展現(xiàn)，從而比較樣品豐度。結(jié)果顯示，在門(mén)水平，菌群分布以擬桿菌門(mén)、變形桿菌門(mén)、厚壁菌門(mén)、梭桿菌門(mén)為主，其中CAG組梭桿菌門(mén)的分布高于CSG組，擬桿菌門(mén)、變形桿菌門(mén)的分布低于CSG組，見(jiàn)圖2a；在屬水平，菌群分布以奈瑟菌屬、普雷沃氏菌屬_7、嗜血桿菌屬、卟啉單胞菌屬為主，其中CAG組奈瑟菌屬分布低于CSG組，卟啉單胞菌屬分布高于CSG組，見(jiàn)圖2b。

圖2 CAG組與CSG組舌苔菌群平均相對(duì)豐度

2.6 2組舌苔菌群顯著性差異分析

根據(jù)樣品物種豐度表，采用Mann-Whitney檢驗(yàn)（適用于有生物學(xué)重復(fù)2組樣品差異比較）進(jìn)行物種差異檢驗(yàn)。在門(mén)水平影響分組的2種菌是梭桿菌門(mén)、Candidatus_Saccharibacteria（見(jiàn)圖3a），在屬水平影響分組的18種菌是鏈桿菌屬、普雷沃氏菌屬ceae_UCG-001、Ruminococcus_gnavus_group、、等（見(jiàn)圖3b）。

圖3 CAG組與CSG組舌苔菌群顯著性差異分析

2.7 2組舌苔菌群LEfSe差異分析

LEfSe（LDA effect size）分析主要目的是比較不同組間在豐度上有顯著差異的物種，能夠更加直觀展現(xiàn)組間所有層級(jí)的差異物種。圖4顯示，2組門(mén)水平的梭桿菌門(mén)、屬水平的有顯著差異，且在CAG組中的豐度更高。

圖4 CAG組與CSG組舌苔菌群LEfSe差異分析

2.8 舌苔菌群相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)

相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖（SparCC）是通過(guò)計(jì)算屬水平豐度top30的微生物豐度，獲得兩兩優(yōu)勢(shì)菌群間的相關(guān)性及顯著性（值），再用相關(guān)性繪制網(wǎng)絡(luò)圖。由圖5可見(jiàn)，普雷沃氏菌屬_7與普雷沃氏菌屬、韋榮氏球菌屬呈正相關(guān)，與卟啉單胞菌屬、嗜血桿菌屬呈負(fù)相關(guān)，嗜血桿菌屬與卟啉單胞菌屬、奈瑟菌屬呈正相關(guān)。與其他菌的數(shù)目關(guān)聯(lián)最多的細(xì)菌是普雷沃氏菌屬_7、嗜血桿菌屬。

圖5 CAG組與CSG組屬水平豐度top30的舌苔菌群相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)

3 討論

舌象可反映機(jī)體內(nèi)在氣血盛衰與陰陽(yáng)虛實(shí)，近年來(lái)舌診研究在客觀化、標(biāo)準(zhǔn)化方面取得一定進(jìn)步。目前大多數(shù)學(xué)者認(rèn)同正常胃黏膜-CSG-CAG-癌前病變-胃癌的發(fā)展模式，認(rèn)為CSG病情程度較CAG輕。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，正常人多表現(xiàn)為淡紅舌、薄白苔，病情越發(fā)展舌象變化越明顯。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)CAG患者舌象以紅舌、黃苔、厚苔、膩苔為主，CSG患者以淡紅舌、白苔、薄苔為主?！秱噼b》有“夫紅舌者，伏熱內(nèi)蓄于心胃，自里而達(dá)于表也”。CAG患者舌色以紅為主，認(rèn)為內(nèi)有熱象。西醫(yī)學(xué)認(rèn)為舌色發(fā)紅多見(jiàn)于感染發(fā)熱患者或慢性消耗性患者?！侗嫔嘀改稀酚小包S苔主里……全舌黃苔者，臟腑俱熱”。研究發(fā)現(xiàn)，苔色受細(xì)胞生長(zhǎng)分化和溶解退化間動(dòng)態(tài)平衡影響。研究發(fā)現(xiàn)，舌苔隨細(xì)胞代謝速率改變產(chǎn)生敏感變化，體現(xiàn)在舌苔厚薄與細(xì)胞生長(zhǎng)分化和溶解退化的動(dòng)態(tài)改變?！稖?zé)峤?jīng)緯》有“舌苔厚而有根，濁邪瘀結(jié)”。以上均表明中醫(yī)舌診可為疾病提供潛在的篩查和早期診斷方法，欲獲得更科學(xué)的結(jié)論仍需調(diào)查更大樣本量及更精確的生物組學(xué)證據(jù)。

解剖學(xué)認(rèn)為，舌與消化系統(tǒng)密切相關(guān)。脫落上皮、唾液、食物碎屑、透出的白細(xì)胞等共同組成舌苔，飲食習(xí)慣、生活方式和微生態(tài)環(huán)境等多種因素影響舌苔變化。1984年，Marshall等發(fā)現(xiàn)胃幽門(mén)螺桿菌在CG中發(fā)揮重要作用，表明細(xì)菌是導(dǎo)致胃炎的因素。但既往研究發(fā)現(xiàn)，約25%的CG患者沒(méi)有感染幽門(mén)螺桿菌，表明其他能夠引起炎癥的細(xì)菌參與了該過(guò)程。此后，眾多研究者證實(shí)了除幽門(mén)螺桿菌以外的細(xì)菌在胃病中的作用?，F(xiàn)代研究表明，16S rDNA基因的高通量測(cè)序在鑒定口腔微生物群中的綜合細(xì)菌方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，目前已有研究者利用該技術(shù)調(diào)查了口腔細(xì)菌群落與胃炎發(fā)展的潛在關(guān)系。本研究對(duì)CAG組和CSG組舌苔微生物菌群進(jìn)行檢測(cè)和分析，以探討特定圖像產(chǎn)生的深層原因，發(fā)現(xiàn)2組樣本中盡管存在大量相同物種，但其微生物組成、多樣性和功能存在一定差異。

本研究與既往研究結(jié)果一致，認(rèn)為擬桿菌門(mén)、變形桿菌門(mén)、厚壁菌門(mén)、梭桿菌門(mén)是鑒定出的4個(gè)最具優(yōu)勢(shì)的門(mén)。在屬水平上，奈瑟菌屬、普雷沃氏菌屬_7是最豐富的屬。充分說(shuō)明這些菌群在CG人群的舌苔微生物中占據(jù)重要地位，是構(gòu)成口腔中舌苔微生物群落結(jié)構(gòu)的最基礎(chǔ)成分。此外，門(mén)水平上，CAG組梭桿菌門(mén)的分布高于CSG組，梭桿菌門(mén)是口腔微生物群的常見(jiàn)成員。有研究發(fā)現(xiàn)梭桿菌屬m能夠引起炎癥，更有學(xué)者發(fā)現(xiàn)梭桿菌屬m可能與結(jié)直腸癌有關(guān)。擬桿菌門(mén)屬于口腔正常菌群，而擬桿菌門(mén)在CAG組的分布低于CSG組，證明梭桿菌屬m、擬桿菌門(mén)可能與胃炎的病變程度有關(guān)。屬水平上，CAG組卟啉單胞菌屬分布高于CSG組。卟啉單胞菌屬已被證明具有致癌潛力，可抑制細(xì)胞凋亡，激活細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞入侵，誘導(dǎo)慢性炎癥，并直接產(chǎn)生致癌物。奈瑟菌屬分布低于CSG組，本結(jié)果與既往研究不一致，考慮舌苔菌群的組成和與疾病癥狀有關(guān)，如CAG患者癥狀表現(xiàn)以吐酸、噯氣為主，而CSG患者癥狀不明顯，這些癥狀表現(xiàn)都會(huì)影響舌苔菌群變化。LEfSe差異分析發(fā)現(xiàn)，梭桿菌門(mén)在2組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且在CAG組的豐度更高，表明CAG患者舌苔菌群結(jié)構(gòu)更加豐富且存在較多優(yōu)勢(shì)菌群，口腔菌群失調(diào)程度加重。這些菌屬的改變提示CG的發(fā)展可能與炎性因子有關(guān)，由于菌群改變，導(dǎo)致代謝物甚至一系列全身系統(tǒng)變化。雖然目前研究缺乏關(guān)于特定細(xì)菌種類在CG發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的確切致炎機(jī)制，但在CG患者中觀察到的微生物區(qū)系變化豐富了對(duì)口腔細(xì)菌與CG相關(guān)性的認(rèn)識(shí)。

門(mén)、屬水平的特定微生物可能為舌診研究指明方向，但仍需更多研究確認(rèn)特定微生物與舌質(zhì)和舌苔圖像特征間的關(guān)系?；蚩赏ㄟ^(guò)觀察舌象、調(diào)整舌苔菌群的方式對(duì)胃腸道進(jìn)行干預(yù)和調(diào)控，從而干預(yù)CG疾病的發(fā)展進(jìn)程。此外，如何將中醫(yī)舌診與開(kāi)發(fā)新的生物標(biāo)志物相結(jié)合，用以預(yù)測(cè)疾病的轉(zhuǎn)歸、進(jìn)行辨證論治也是需要關(guān)注的問(wèn)題。