劉孜琦，聶妍琦，傅旖靈，陸夢(mèng)，郁潔

湖南中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410036

中風(fēng)是全球范圍內(nèi)第二大致死原因，也是導(dǎo)致殘疾的主要因素，其發(fā)病率逐年上升，其中大部分為缺血性中風(fēng)。缺血性中風(fēng)病理特點(diǎn)是局部腦組織血流量受阻形成梗塞區(qū)，恢復(fù)缺血腦組織血液供應(yīng)是缺血性中風(fēng)治療的主要措施。目前西醫(yī)主要采用溶栓治療，但血液再灌注后可導(dǎo)致腦損傷進(jìn)一步加重，即腦缺血再灌注損傷（cerebral ischemia-reperfusion injury，CIRI）。研究表明，CIRI早期以炎癥反應(yīng)為主，CIRI誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡和神經(jīng)系統(tǒng)損傷與NLRP3激活密切相關(guān)，抑制NLRP3介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡能發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。課題組前期研究顯示，電針可改善缺血再灌損傷模型大鼠神經(jīng)功能，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。本研究通過(guò)大腦中動(dòng)脈栓塞（MCAO）大鼠模型，進(jìn)一步探討電針是否通過(guò)抑制NLRP3炎癥小體介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，為明確電針治療缺血性中風(fēng)的作用機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

9～10周齡健康SPF級(jí)雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量（230±30）g，湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（湘）2019-0004。分籠飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，溫度24～26℃，相對(duì)濕度50%～70%，12 h光/暗循環(huán)，自由攝食飲水。使用許可證號(hào)SCXK（湘）2019-0009。實(shí)驗(yàn)過(guò)程嚴(yán)格按照《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》進(jìn)行。

1.2 藥物及試劑

依達(dá)拉奉注射液，1.5 mg/mL，貨號(hào)H20080056，安徽國(guó)藥集團(tuán)國(guó)瑞藥業(yè)有限公司。4%多聚甲醛，貨號(hào)BL539A，北京白鯊易科技有限公司；戊巴比妥鈉，貨號(hào)P3761，上海Sigma-Aldrich；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒，貨號(hào)PC0020，北京Solarbio；SYBR FAST qPCR Master Mix，貨 號(hào)KM4101，上 海KAPA Biosystems；蛋白Marker，貨號(hào)P12103，深圳Helix；化學(xué)發(fā)光試劑，貨號(hào)WBKLS0500，上海Millipore；PVDF膜，貨號(hào)IPVH00010，上海Millipore；吐溫-20，貨號(hào)T8220-100，北京Solarbio；RIPA組織細(xì)胞快速裂解液，貨號(hào)R0010，北京Solarbio；NLRP3、半胱氨酸蛋白酶-1（Caspase-1）、白細(xì)胞介素（IL）-1β、GAPDH、Goat anti-Rabbit IgG抗體，貨號(hào)分別為PAB37930、PAB44625、PAB39968、PAB36269、SAB43714，武漢Bioswamp；伊紅，貨號(hào)E8090，北京Solarbio；蘇木素，貨號(hào)G1004，武漢Servicebio；中性樹脂，貨號(hào)G8590，北京Solarbio。

1.3 主要儀器

一次性實(shí)驗(yàn)針灸針（0.30 mm×25 mm，蘇州醫(yī)療用品有限公司），栓線（型號(hào)2634-50A4，北京西濃有限公司），電針治療儀（型號(hào)SDZ-Ⅱ，蘇州醫(yī)療用品廠有限公司），正置顯微鏡（型號(hào)DM1000，上海徠卡顯微系統(tǒng)有限公司），恒溫烘箱（型號(hào)DHG-9023A，上海一恒科學(xué)儀器有限公司），石蠟切片機(jī)（型號(hào)RM2235，上海徠卡顯微系統(tǒng)有限公司），生物組織包埋機(jī)-冷凍機(jī)（型號(hào)TB-718L，湖北泰維科技），電泳儀（型號(hào)Mini Protean 3 Cell，上海Bio-Rad），酶標(biāo)儀（型號(hào)MK3，芬蘭雷勃），干式恒溫器（型號(hào)K30，杭州爽盛儀器），高速冷凍離心機(jī)（型號(hào)iCEN-24R，杭州奧盛），全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀（型號(hào)Tanon-5200，上海天能），PCR儀（型號(hào)GE48527，杭州柏恒），熒光定量PCR儀（型號(hào)CFX-Connect 96，上海Bio-Rad），超微量分光光度計(jì)（型號(hào)Nano-300，杭州奧盛）。

1.4 分組及造模

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，按隨機(jī)數(shù)字表法將60只大鼠分為空白組、模型組、電針組和依達(dá)拉奉組，每組15只。除空白組外，采用Longa改良線栓法制備MCAO模型，術(shù)前12 h禁食不禁水，1.5%戊巴比妥鈉腹腔注射（30 mg/kg）麻醉大鼠，仰臥位固定于鼠板，剃除頸部毛發(fā)，消毒皮膚，頸部正中切開皮膚，沿胸鎖乳突肌內(nèi)緣用止血鉗鈍性分離皮下筋膜、肌肉及腺體，充分暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈，用玻璃分針?lè)蛛x頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈及迷走神經(jīng)，分別在頸內(nèi)動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈掛線備用。結(jié)扎頸外動(dòng)脈近心端，用顯微動(dòng)脈夾暫時(shí)夾閉頸內(nèi)動(dòng)脈和頸總動(dòng)脈，在距頸總動(dòng)脈分叉3 mm處剪一“V”形小口，將栓線由“V”型小口插入頸總動(dòng)脈至頸內(nèi)動(dòng)脈，松開頸內(nèi)動(dòng)脈及頸總動(dòng)脈處顯微動(dòng)脈夾，繼續(xù)將栓線插入頸內(nèi)動(dòng)脈約（18.5±0.5）mm至微感阻力，將頸內(nèi)動(dòng)脈遠(yuǎn)心端處手術(shù)線結(jié)扎，用以固定栓線。逐層縫合傷口，碘伏消毒傷口及周圍皮膚，栓線另一端留l cm置于體外，術(shù)后腹腔注射青霉素鈉（20萬(wàn)U/只）預(yù)防感染。缺血90 min后撤去栓線實(shí)現(xiàn)再灌注?？瞻捉M只暴露頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈及迷走神經(jīng)，不插入栓線。

大鼠蘇醒后根據(jù)文獻(xiàn)[10]標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分：0分，無(wú)神經(jīng)缺損癥狀；1分，不能完全伸展左前肢；2分，走路時(shí)身體轉(zhuǎn)向偏癱側(cè)；3分，行走時(shí)身體向偏癱側(cè)傾倒；4分，不能自主行走，意識(shí)喪失。分別于蘇醒后0、24、48 h進(jìn)行評(píng)分，將首次評(píng)分為1～3分的大鼠納入實(shí)驗(yàn)。

1.5 干預(yù)

電針組參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》進(jìn)行腧穴定位，選取左側(cè)“內(nèi)關(guān)”“百會(huì)”，用0.30 mm×25 mm針灸針30°斜刺2 mm，正極接左側(cè)“內(nèi)關(guān)”，負(fù)極接“百會(huì)”，連接電針治療儀。刺激參數(shù)：疏波10 Hz、密波50 Hz，脈沖寬度0.5 ms，電流1 mA。電針組大鼠造模生命體征平穩(wěn)后（約2 h）進(jìn)行第1次電針，隨后每隔12 h電針1次，20 min/次，共5次。模型組和依達(dá)拉奉組在相同時(shí)段予固定操作20 min。依達(dá)拉奉組大鼠在造模蘇醒后即刻一次性腹腔注射依達(dá)拉奉注射液（3 mg/kg），模型組和電針組注射等量生理鹽水。

1.6 指標(biāo)檢測(cè)

1.6.1 HE染色

干預(yù)結(jié)束后，每組選取3只大鼠，戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，斷頭取腦，切取0.3 cm×0.3 cm大小腦組織，放入4%多聚甲醛中固定48 h，乙醇梯度脫水，浸蠟包埋，切片（厚度3 μm），每只大鼠選取3張切片，進(jìn)行HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察，Leica Application Suite圖象系統(tǒng)采集圖像，觀察大腦皮層梗死區(qū)病理改變。

1.6.2 TUNEL染色

將固定好的大鼠腦組織常規(guī)脫水浸蠟包埋，連續(xù)切片（2 μm），水浴展片及烤片，脫蠟處理后，不同濃度酒精水化，滴加Protein K工作液，37℃孵育15 min，加入50 μL TUNEL反應(yīng)混合液，濕盒避光37℃加蓋孵育60 min，PBS沖洗3次，加入50 μL POD-conjugated Anti-FITC工作液，濕盒37℃孵育30 min，PBS沖洗3次，加入50 μL DAB底物，室溫孵育10 min，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，封片。光學(xué)顯微鏡下觀察，以棕黃色顆粒為凋亡陽(yáng)性表達(dá)，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，使用Image Pro Plus 6.0軟件統(tǒng)計(jì)每個(gè)視野中凋亡陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及細(xì)胞總數(shù)，計(jì)算細(xì)胞凋亡率（凋亡陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)÷細(xì)胞總數(shù)×100%）。

1.6.3 Western blot檢測(cè)

剪取200 mg凍存腦組織，加入RIPA裂解液提取總蛋白，4℃、12000 r/min離心20 min，取上清液，BCA法測(cè)定蛋白濃度，樣品與5×上樣緩沖液混合，100℃加熱5 min變性；配制12%分離膠、5%濃縮膠進(jìn)行電泳，20 μg/孔上樣，濃縮膠80 V、40 min，分離膠120 V、50 min，當(dāng)溴酚藍(lán)到達(dá)分離膠底部時(shí)結(jié)束電泳；4℃、100 mA轉(zhuǎn)膜50 min；5%脫脂奶粉4℃封閉過(guò)夜；加入NLRP3、Caspase-1、IL-1β、GAPDH一抗（均為1∶1000），室溫孵育1 h；TBST洗膜15 min×3次，滴加HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG（1∶10000），室溫孵育1 h；TBST洗膜15 min×3次，滴加ECL化學(xué)發(fā)光液顯色曝光，將膜置于全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀中檢測(cè)，采用TANON GIS軟件讀取蛋白條帶灰度值。

1.6.4 RT-PCR檢測(cè)

取100 mg腦組織，加入1 mL Trizol研磨成勻漿，12000 r/min離心15 min，提取組織總RNA，按照說(shuō)明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，將cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增：95℃預(yù)變性3 min，95℃變性5 s，59℃退火10 s，72℃延伸25 s，共40個(gè)循環(huán)。采用CFX Manager 3.1軟件獲取Ct值，以GAPDH為 內(nèi) 參，2法 計(jì) 算NLRP3、Caspase-1、IL-1β mRNA相對(duì)表達(dá)量。PCR引物由武漢天一華煜基因科技有限公司合成，引物序列見(jiàn)表1。

表1 各基因PCR引物序列

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 電針對(duì)模型大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分的影響

造模后0 h，各組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分較空白組均顯著升高（＜0.01），提示造模成功；與模型組比較，電針組和依達(dá)拉奉組大鼠造模后24、48 h神經(jīng)功能缺損評(píng)分顯著降低（＜0.05，＜0.01）。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠造模后不同時(shí)點(diǎn)神經(jīng)功能缺損評(píng)分比較［M（Q1，Q3），分］

2.2 電針對(duì)模型大鼠大腦皮層病理變化的影響

HE染色結(jié)果顯示，空白組大鼠大腦皮層神經(jīng)元密集、排列規(guī)則，胞質(zhì)豐富，核仁明顯，未見(jiàn)病理?yè)p傷；模型組大鼠大腦皮層神經(jīng)元排列紊亂，染色質(zhì)皺縮，胞體膨大變形，部分可見(jiàn)細(xì)胞膜破裂，有空泡，周圍尼氏體消失，部分神經(jīng)細(xì)胞萎縮及壞死，有大量小膠質(zhì)細(xì)胞，微血管增多；電針組大鼠大腦皮層病變情況較模型組減輕，細(xì)胞排列較整齊，少量神經(jīng)細(xì)胞壞死，神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)有明顯改善，有少量小膠質(zhì)細(xì)胞；依達(dá)拉奉組大鼠大腦皮層病理?yè)p傷較模型組顯著減輕，神經(jīng)細(xì)胞排列整齊、結(jié)構(gòu)清晰，胞漿豐富。見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠大腦皮層形態(tài)（HE染色，×400）

2.3 電針對(duì)模型大鼠腦組織細(xì)胞凋亡的影響

TUNEL染色結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組大鼠腦組織細(xì)胞凋亡率顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，電針組和依達(dá)拉奉組大鼠腦組織細(xì)胞凋亡率顯著降低（＜0.01）。見(jiàn)表3、圖2。

圖2 各組大鼠腦組織凋亡陽(yáng)性表達(dá)（TUNEL染色，×200）

表3 各組大鼠腦組織細(xì)胞凋亡率比較（±s，%）

2.4 電針對(duì)模型大鼠腦組織NLRP3、半胱氨酸蛋白酶-1、白細(xì)胞介素-1β蛋白表達(dá)的影響

與空白組比較，模型組大鼠腦組織NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白表達(dá)顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，電針組和依達(dá)拉奉組大鼠腦組織NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白表達(dá)顯著降低（＜0.01），且依達(dá)拉奉組各指標(biāo)低于電針組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05，＜0.01）。見(jiàn)圖3、圖4。

圖3 各組大鼠腦組織NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白免疫印跡

圖4 各組大鼠腦組織NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白表達(dá)比較（±s，每組15只）

2.5 電針對(duì)模型大鼠腦組織NLRP3、半胱氨酸蛋白酶-1、白細(xì)胞介素-1β mRNA表達(dá)的影響

與空白組比較，模型組大鼠腦組織NLRP3、Caspase-1、IL-1β mRNA表達(dá)顯著升高（＜0.05，＜0.01）；與模型組比較，電針組和依達(dá)拉奉組大鼠腦組織NLRP3、Caspase-1、IL-1β mRNA表達(dá)顯著降低（＜0.05，＜0.01），且依達(dá)拉奉組各指標(biāo)低于電針組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05）。見(jiàn)圖5。

圖5 各組大鼠腦組織NLRP3、Caspase-1、IL-1β mRNA表達(dá)比較（±s，每組15只）

3 討論

缺血性中風(fēng)病因主要為風(fēng)、火、痰、瘀、虛，病機(jī)多屬本虛標(biāo)實(shí)。《醫(yī)林改錯(cuò)》有“無(wú)氣則不能動(dòng)，不能動(dòng)，名曰半身不遂，不遂者，不遂人用也”，將中風(fēng)表現(xiàn)的臨床癥狀歸于氣虛不達(dá)所致。現(xiàn)代研究表明，元?dú)馓潛p是缺血性腦卒中的主要原因，氣行則血行，氣為血之帥，因此氣虛則血虛，脈道失榮?！夺樉拇蟪伞酚小爸酗L(fēng)將至，病淺癥輕，時(shí)發(fā)時(shí)止，若有若無(wú)，其因不明，此時(shí)若施以針灸，投以重劑，恐傷氣血，又慮虛實(shí)之誡，誤釀痼疾”，強(qiáng)調(diào)中風(fēng)的病性為本虛標(biāo)實(shí)，以虛為主，忌投以重劑。

本實(shí)驗(yàn)參考前期研究選取“百會(huì)”“內(nèi)關(guān)”進(jìn)行電針干預(yù)，進(jìn)一步揭示電針對(duì)缺血再灌注損傷模型大鼠的保護(hù)機(jī)制。百會(huì)為諸陽(yáng)之會(huì)，督脈要穴，全身各部陽(yáng)氣皆匯集于此，《會(huì)元針灸學(xué)》有“百會(huì)者，五臟六腑奇經(jīng)三陽(yáng)百脈之所會(huì)”，刺激百會(huì)可調(diào)動(dòng)百脈之氣，補(bǔ)陽(yáng)調(diào)陰。研究發(fā)現(xiàn)，百會(huì)具有醒神開竅、益精調(diào)神作用。百會(huì)位于巔頂，百會(huì)之下則為腦，《本草綱目》“腦為元神之府”，而心主神志，心藏神，心腦同治也?！叭酥癫赜谀X，人之識(shí)神發(fā)于心”（《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》），故取手厥陰心包經(jīng)穴內(nèi)關(guān)相配，手厥陰心包經(jīng)起于胸中，出屬心包絡(luò)，下膈，歷絡(luò)三焦。內(nèi)關(guān)為八脈交會(huì)穴、絡(luò)穴之一，常用于治療心臟疾病及部分神志病證，具有寧心定志作用。且內(nèi)關(guān)與陰維脈相通，通過(guò)絡(luò)脈與三焦貫通，調(diào)理三焦氣機(jī)，運(yùn)行氣血，故針刺內(nèi)關(guān)可調(diào)心以醒腦。百會(huì)、內(nèi)關(guān)二穴相配，可達(dá)開竅醒神、活血祛風(fēng)之功。本研究中，電針干預(yù)后模型大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分顯著低于模型組，且與依達(dá)拉奉組無(wú)明顯差異。HE染色顯示，模型組大鼠大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞萎縮及壞死，神經(jīng)元核固縮及變形，電針組大鼠腦組織病理?yè)p傷明顯減輕，提示電針能降低大鼠腦組織損傷，改善神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

CIRI發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，炎癥反應(yīng)和細(xì)胞焦亡是其過(guò)程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，其中，炎癥反應(yīng)在CIRI早期發(fā)揮重要作用。NLRP3炎癥小體是腦血管疾病產(chǎn)生的最廣泛的復(fù)合小體之一，在大腦中大量表達(dá)，能夠識(shí)別缺血性中風(fēng)期間細(xì)胞損傷，并調(diào)節(jié)缺血再灌注損傷引起的炎癥反應(yīng)。NLRP3炎癥小體由NLRP3（3個(gè)結(jié)構(gòu)域及NLR寡聚化形成炎癥小體的核心結(jié)構(gòu)）、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（ASC）和半胱天冬酶-1前體（pro-Caspase-1）組成，可以增加促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生和分泌，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和細(xì)胞焦亡的程序性死亡。細(xì)胞焦亡作為具有炎癥性特點(diǎn)的細(xì)胞死亡形式，可介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的發(fā)生，加劇CIRI。細(xì)胞焦亡依賴于經(jīng)典的Caspase-1通路，細(xì)胞內(nèi)的模式識(shí)別受體作為感受器識(shí)別細(xì)胞外信號(hào)，通過(guò)接頭蛋白ASC與pro-Caspase-1結(jié)合，形成多蛋白復(fù)合物，使Caspase-1活化?；罨腃aspase-1一方面對(duì)IL-1β和IL-18的前體進(jìn)行切割，形成有活性的IL-1β和IL-18，并釋放到胞外，募集炎癥細(xì)胞，擴(kuò)大炎癥反應(yīng)；另一方面切割Gasdermin D，形成含有Gasdermin D氮端活性域的肽段，誘導(dǎo)細(xì)胞膜穿孔，細(xì)胞破裂，導(dǎo)致細(xì)胞焦亡。NLRP3是細(xì)胞焦亡的關(guān)鍵蛋白，可與ASC相互作用，招募pro-Caspase-1，通過(guò)上述Caspase-1經(jīng)典焦亡通路，將焦亡信號(hào)傳遞到下游焦亡蛋白，最終發(fā)生細(xì)胞焦亡。TUNEL染色觀察顯示，電針可抑制模型大鼠腦組織細(xì)胞凋亡，但由于TUNEL染色是細(xì)胞凋亡的主要評(píng)價(jià)方法，無(wú)法特異性評(píng)價(jià)焦亡情況，因此通過(guò)Western blot和PCR實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步檢測(cè)焦亡相關(guān)分子的表達(dá)。結(jié)果表明，模型組大鼠腦組織NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白和mRNA表達(dá)顯著升高，提示出現(xiàn)細(xì)胞焦亡；電針組大鼠腦組織NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白和mRNA表達(dá)顯著降低，推測(cè)電針可能通過(guò)抑制NLRP3炎癥小體阻止Caspase-1活化，減少促炎因子IL-1β的分泌，抑制細(xì)胞焦亡。

綜上，電針“百會(huì)”“內(nèi)關(guān)”對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠可發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，其機(jī)制可能與抑制NLRP3炎癥小體介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡，減輕CIRI有關(guān)。但電針對(duì)NLRP3炎癥小體的具體抑制途徑及對(duì)其他細(xì)胞焦亡通路的調(diào)節(jié)作用仍有待今后深入研究。