李峰，何立

西安建筑科技大學(xué)體育學(xué)院，西安 710055

隨著對(duì)大氣顆粒物的深入研究和人們健康意識(shí)的增強(qiáng)，關(guān)于細(xì)顆粒物(fine particular matter,PM2.5)對(duì)運(yùn)動(dòng)人體健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)的研究也日趨增多。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，作為一類(lèi)主要的污染物，PM2.5可以通過(guò)多種途徑進(jìn)入生物體內(nèi)，在體內(nèi)產(chǎn)生含氧自由基等活性氧物質(zhì)[1]，并通過(guò)多種信號(hào)通路及酶反應(yīng)引起氧化應(yīng)激，造成生物體內(nèi)的脂質(zhì)過(guò)氧化[2]、蛋白質(zhì)損傷和酶失活等[3]，引起機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激。尤其是在運(yùn)動(dòng)的狀態(tài)下，由于呼吸加深加快，會(huì)使機(jī)體吸入更多的PM2.5，并且隨著血液循環(huán)進(jìn)入到身體各組織中，誘導(dǎo)產(chǎn)生心肺功能障礙，造成機(jī)體的系統(tǒng)性損傷。目前，我國(guó)國(guó)內(nèi)從多器官水平上研究不同濃度PM2.5對(duì)運(yùn)動(dòng)狀態(tài)下機(jī)體氧化-抗氧化網(wǎng)絡(luò)的影響尚處在探索階段。因此，本研究通過(guò)收集體育場(chǎng)館內(nèi)PM2.5，研究其對(duì)運(yùn)動(dòng)狀態(tài)大鼠肺和心臟抗氧化系統(tǒng)的影響，以期為評(píng)價(jià)體育場(chǎng)館內(nèi)細(xì)顆粒物濃度和機(jī)體氧化損傷之間的關(guān)系提供理論依據(jù)，同時(shí)也為PM2.5暴露劑量-運(yùn)動(dòng)反應(yīng)之間的關(guān)系機(jī)制提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，研究結(jié)果亦可以為霧霾天氣下健身鍛煉者提供防護(hù)參考。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 PM2.5的采樣及懸液制備

利用TH-150C型顆粒物智能采樣器(武漢天虹)采集某校體育館內(nèi)PM2.5，采樣前清理采樣點(diǎn)周?chē)倪\(yùn)動(dòng)器械及其他物品，同時(shí)確定采樣點(diǎn)為非污染源。為了最大程度模擬PM2.5對(duì)運(yùn)動(dòng)機(jī)體的影響，將儀器放置在人體呼吸帶高度(1.5 m)，同時(shí)采用同心圓方式選取5個(gè)點(diǎn)，每2個(gè)采樣點(diǎn)之間相距5 m左右，使采樣儀器離墻>1 m、離門(mén)窗>3 m，空氣流量為1.13 m3·min-1。采樣時(shí)將已經(jīng)真空干燥、稱量質(zhì)量的濾膜放入采樣夾的濾網(wǎng)上，濾膜毛面朝進(jìn)氣方向，將濾膜壓緊至不漏氣。采樣結(jié)束后將濾膜真空干燥，根據(jù)采樣前、后濾膜質(zhì)量差和采樣體積得出顆粒物的質(zhì)量濃度。將收集了PM2.5的玻璃纖維濾膜裁剪為小塊后浸入去離子水中，經(jīng)超聲振蕩4次，每次30 min后用去離子水洗脫顆粒物，然后將濾液在4 ℃離心20 min(1 000 r·min-1，離心半徑59 mm)，真空干燥后稱量質(zhì)量，-20 ℃保存。為保證顆粒物實(shí)際毒性效果，實(shí)驗(yàn)并未對(duì)顆粒物進(jìn)行消毒滅菌處理，滴注前用0.9%生理鹽水配制成需要的濃度，超聲振蕩15 min使染毒懸液均勻，并滅菌備用。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物染毒劑量與染毒方式

運(yùn)動(dòng)大鼠采用非暴露式PM2.5氣管滴注染毒，滴注時(shí)保持室內(nèi)溫度在20～26 ℃之間，室內(nèi)相對(duì)濕度為44%～70%。滴注前先將染毒懸液預(yù)溫至37 ℃，在大鼠乙醚麻醉后，分別按低(7.5 mg·kg-1)、中(15 mg·kg-1)和高(30 mg·kg-1)3種劑量經(jīng)氣管注入PM2.5顆粒物懸液，對(duì)照組滴注同等容量的生理鹽水，實(shí)驗(yàn)大鼠染毒后進(jìn)行運(yùn)動(dòng)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與運(yùn)動(dòng)方案

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用32只7周齡健康雄性SPF級(jí)Wistar大鼠，體質(zhì)量180～220 g。動(dòng)物購(gòu)回后在溫度為20～26 ℃、濕度為44%～70%的常規(guī)飼養(yǎng)籠內(nèi)適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，自由進(jìn)食和飲水，照明隨同光照自然變化。所有動(dòng)物處置均依照《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》的相關(guān)要求進(jìn)行[4]。適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后將大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(control group,CG)、高劑量染毒組(high-dose group,30 mg·kg-1,HG)、中劑量染毒組(middle-dose group,15 mg·kg-1,MG)和低劑量染毒組(low-dose group,7.5 mg·kg-1,LG)4組，每組8只，根據(jù)大鼠體質(zhì)量/攝氧量回歸方程建立遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)模型，正式訓(xùn)練前將所有大鼠以10 m·min-1、5 min·d-1的方案先進(jìn)行2 d的適應(yīng)性訓(xùn)練，具體運(yùn)動(dòng)方案如表1所示。

表1 實(shí)驗(yàn)大鼠運(yùn)動(dòng)方案Table 1 Training program of experimental rats

1.4 肺泡灌洗液(BALF)和心臟組織勻漿的制備與指標(biāo)測(cè)試

1.4.1 BALF制備

運(yùn)動(dòng)結(jié)束后用乙醚麻醉處死大鼠，切開(kāi)頸部皮膚，暴露氣管，結(jié)扎左肺，在主氣管處剪一“V”形小切口，插人灌洗針頭，結(jié)扎固定。注射器抽取37 ℃生理鹽水緩慢注入肺內(nèi)，同時(shí)輕輕按摩胸壁，待右肺變得膨隆后緩慢抽出灌洗液。灌洗2次，第1次注入6 mL，第2次注入3 mL，混勻抽吸2次，至灌洗液總量為6 mL。然后以4 000 r·min-1、4 ℃下離心20 min，取上清液于-20 ℃保存待測(cè)。

1.4.2 心臟組織勻漿液制備

大鼠宰殺后即刻稱取適量心臟組織，加入0.9%的生理鹽水，按體質(zhì)量(g)∶體積(mL)=1∶9的比例加預(yù)冷的勻漿介質(zhì)(pH 7.4，0.01 mol·L-1Tris-HCl，0.0001 mol·L-1EDTA-2Na，0.01 mol·L-1蔗糖，0.8%的NaCl溶液)于燒杯中，用眼科小剪盡快剪碎組織塊，然后倒入研缽中按照順時(shí)針?lè)较蜻M(jìn)行研磨至糊狀。勻漿液通過(guò)二層紗布過(guò)濾后按試劑盒要求分別于低溫冷凍離心機(jī)4 000 r·min-1離心10 min，分離上清液，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆没蚶洳鼗?20 ℃冰箱冰凍備用，使用前按照試劑盒要求作相應(yīng)的稀釋。

1.4.3 指標(biāo)測(cè)試

采用5,5’-二硫代硝基苯甲酸(DTNB)比色法測(cè)定谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxide,GSH-Px)活性和丙二醛(malondialdehyde,MDA)、活性氧(reactive oxygen species,ROS)含量；采用羥胺氧化法測(cè)定總抗氧化酶(total superoxide dismutase,T-SOD)活性；過(guò)氧化氫酶(catalase,CAT)、谷胱甘肽(glutathione,GSH)采用分光光度方法測(cè)定。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果(Results)

2.1 不同劑量PM2.5暴露對(duì)運(yùn)動(dòng)大鼠BALF抗氧化酶活性的影響

如表2所示，和CG組相比，除CAT之外，LG組中GSH-Px、T-SOD活性和GSH含量均高于CG組，其中GSH-Px活性有極顯著性差異(P<0.01)；除GSH含量外，MG組、HG組GSH-Px、T-SOD和CAT活性呈劑量相關(guān)性下降，其中，GSH-Px、T-SOD活性與CG組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01)，而GSH含量雖呈劑量相關(guān)性下降，但仍高于CG組，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01)。

表2 PM2.5暴露對(duì)大鼠BALF抗氧化酶活性的影響(n=8)Table 2 Effects of PM2.5 exposure on antioxidant enzymes activity of BALF in rats (n=8)

2.2 PM2.5 暴露對(duì)運(yùn)動(dòng)大鼠心臟抗氧化酶活性的影響

如表3所示，和CG組相比，在3個(gè)劑量組中，隨著PM2.5劑量的增加T-SOD活性逐漸下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01)；而LG組GSH-Px活性與CG組相比略有上升，但MG組和HG組呈下降趨勢(shì)，且HG組與CG組相比有顯著性差異(P<0.05)。

表3 PM2.5暴露對(duì)運(yùn)動(dòng)大鼠心臟抗氧化酶活性影響(n=8)Table 3 Effects of PM2.5 exposure on antioxidant enzymes activity of heart in rats (n=8) (U·mL-1)

2.3 PM2.5 暴露對(duì)運(yùn)動(dòng)大鼠BALF自由基含量的影響

運(yùn)動(dòng)及不同濃度PM2.5染毒對(duì)大鼠BALF自由基含量的影響如表4所示，由表4可知，和CG組相比，在3個(gè)不同劑量的PM2.5暴露組中，BALF中自由基含量隨著PM2.5暴露劑量的增加呈劑量相關(guān)性上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表4 PM2.5對(duì)訓(xùn)練大鼠BALF中丙二醛(MDA)、活性氧(ROS)含量的影響(n=8)Table 4 The influence on malondialdehyde (MDA) and reactive oxygen species (ROS) content of BALF of training rats after PM2.5 exposure (n=8) (U·mL-1)

2.4 PM2.5暴露對(duì)運(yùn)動(dòng)大鼠心臟自由基含量的影響

由表5可知，和CG組相比，在3個(gè)不同劑量的PM2.5暴露組中，隨著PM2.5暴露劑量的增加，MDA和ROS含量也成劑量相關(guān)性上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表5 PM2.5對(duì)訓(xùn)練大鼠心臟MDA、ROS含量的影響(n=8)Table 5 The influence on (MDA) and (ROS) content of heart of training rats after PM2.5 exposure (n=8) (U·mL-1)

3 討論(Discussion)

3.1 PM2.5暴露對(duì)運(yùn)動(dòng)大鼠BALF抗氧化酶活性的影響

抗氧化系統(tǒng)作為內(nèi)穩(wěn)態(tài)平衡的調(diào)節(jié)因素之一，可以通過(guò)非酶類(lèi)物質(zhì)和酶類(lèi)如抗氧化酶構(gòu)成抗氧化防御的屏障，從而消解自由基對(duì)機(jī)體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的破壞。PM2.5的機(jī)械損傷和生物化學(xué)損傷，會(huì)加重呼吸系統(tǒng)的炎癥及氧化應(yīng)激反應(yīng)。因此，BALF中抗氧化酶活性的改變是衡量PM2.5致肺組織氧化應(yīng)激反應(yīng)重要參考指標(biāo)。心臟作為機(jī)體的動(dòng)力器官，在運(yùn)動(dòng)過(guò)程中易受到外界應(yīng)激，引起結(jié)構(gòu)與功能改變[5]。以往研究表明，吸入空氣污染物會(huì)影響心率變異性、血管張力和動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展[6]。

由本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，不同劑量的PM2.5暴露對(duì)運(yùn)動(dòng)大鼠BALF內(nèi)的GSH-Px、T-SOD、GSH和CAT產(chǎn)生不同的影響。其中和CG組相比，LG組中GSH-Px、T-SOD活性和GSH含量均出現(xiàn)上升趨勢(shì)，而CAT活性下降。而隨著PM2.5暴露劑量的增加，4個(gè)指標(biāo)均呈現(xiàn)劑量相關(guān)性下降。分析其原因可能是由于大鼠在運(yùn)動(dòng)過(guò)程中受到神經(jīng)和體液的調(diào)節(jié)，促進(jìn)抗氧化酶活性的暫時(shí)性升高，以對(duì)抗運(yùn)動(dòng)過(guò)程中產(chǎn)生的自由基及PM2.5暴露帶來(lái)的負(fù)面影響，但是由于低劑量的PM2.5暴露對(duì)GSH-Px和T-SOD的負(fù)面影響不足以破壞機(jī)體的抗氧化防御系統(tǒng)，因此在LG組中呈現(xiàn)出GSH-Px和T-SOD活性升高的現(xiàn)象。

由于不同抗氧化酶的底物特異性、親合性以及在細(xì)胞中的位置不同，而且機(jī)體內(nèi)決定抗氧化酶活性變化的一些因素很大程度上取決于不同的外界應(yīng)激源及干擾因素，所以LG組CAT的降低，可能是低濃度的PM2.5暴露作為一種觸發(fā)因素，使CAT在PM2.5的刺激下出現(xiàn)防御性下降；但是隨著PM2.5暴露劑量的增加，MG和HG組中各酶活性出現(xiàn)顯著性下降，主要機(jī)制可能是PM2.5中的重金屬有機(jī)成分可以誘導(dǎo)自由基的產(chǎn)生，或通過(guò)GSH、還原型輔酶Ⅱ(NADPH)的電子轉(zhuǎn)移產(chǎn)生自由基[7]。當(dāng)氧化應(yīng)激增強(qiáng)時(shí)，細(xì)胞內(nèi)ROS水平的升高導(dǎo)致溶酶體膜損傷，刺激肺組織與系統(tǒng)炎性因子和氧自由基的釋放，繼而促使氧化損傷[8]。染毒組GSH含量下降但仍高于CG組，推測(cè)隨著PM2.5劑量的增加，大鼠運(yùn)動(dòng)過(guò)程中H2O2生成增多，這些自由基與GSH中的—SH結(jié)合，大量消耗了組織中的—SH，加深了抗氧化酶的流失。染毒組GSH含量高于CG組，說(shuō)明PM2.5染毒和力竭運(yùn)動(dòng)中自由基的增加反過(guò)來(lái)促進(jìn)了氧化型GSH(GSSG)向還原型GSH的轉(zhuǎn)變，拮抗自由基的損傷。

3.2 PM2.5暴露對(duì)運(yùn)動(dòng)大鼠心臟抗氧化酶活性的影響

研究結(jié)果顯示，和CG組相比，LG組除GSH-Px外，心肌組織T-SOD和GSH在PM2.5染毒后下降，且T-SOD具有顯著性差異，在MG組和HG組中各酶活性下降。這說(shuō)明心肌組織在抵抗由于運(yùn)動(dòng)和PM2.5染毒帶來(lái)的氧化損傷中處于劣勢(shì)。推測(cè)主要機(jī)制是：(1)運(yùn)動(dòng)或者PM2.5染毒造成了包括心肌結(jié)構(gòu)改變、心肌間質(zhì)膠原改建和心臟生物化學(xué)及心臟功能改變等方面的變化，從而使心臟包括抗氧化在內(nèi)的一系列功能受損；(2)進(jìn)入呼吸系統(tǒng)的PM2.5可通過(guò)血液循環(huán)引起心臟的氧化應(yīng)激，削弱心臟的抗氧化功能，最終引發(fā)心血管系統(tǒng)損傷[9]；(3)PM2.5作用于心臟后，其本身所吸附的有害物質(zhì)會(huì)產(chǎn)生自由基，引起膜脂質(zhì)過(guò)氧化、蛋白質(zhì)氧化或水解，進(jìn)而引起其抗氧化能力的下降；(4)由于本實(shí)驗(yàn)大鼠的運(yùn)動(dòng)方案為一次性急性遞增負(fù)荷實(shí)驗(yàn)，因此大鼠在運(yùn)動(dòng)過(guò)程中的肺通氣量會(huì)在短時(shí)間的內(nèi)大幅度增加，同時(shí)中、高劑量的PM2.5由于攜帶更多的有害物質(zhì)，會(huì)通過(guò)肺部進(jìn)入血液循環(huán)，從而引起心臟的氧化應(yīng)激反應(yīng)[10]；有研究表明，PM2.5對(duì)大鼠心臟氧化損傷程度隨PM2.5濃度的增加而增加，說(shuō)明其抵抗自由基能力變?nèi)鮗11]；由于抗氧化酶活性的下降，誘導(dǎo)或抑制蛋白酶活性、引起心血管系統(tǒng)一系列病理和抗氧化能力的下降[12]。

3.3 PM2.5暴露對(duì)運(yùn)動(dòng)大鼠BALF和心臟ROS和MDA的影響

正常情況下，體內(nèi)存在抑制自由基反應(yīng)和清除自由基的抗氧化體系，從而維持體內(nèi)自由基代謝的動(dòng)態(tài)平衡[13]。但是當(dāng)由于外界的強(qiáng)應(yīng)激導(dǎo)致機(jī)體的內(nèi)穩(wěn)態(tài)發(fā)生紊亂時(shí)，可以造成機(jī)體自由基代謝的紊亂，使氧化與抗氧化失衡，造成對(duì)各組織系統(tǒng)的損傷[14]。本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，PM2.5暴露可以升高BALF及心肌MDA和ROS的含量，表明當(dāng)機(jī)體處于運(yùn)動(dòng)和PM2.5暴露應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，自由基的生成速度大于抗氧化系統(tǒng)的清除速度，造成ROS在體內(nèi)的累積，對(duì)組織和細(xì)胞產(chǎn)生危害。尤其是PM2.5刺激組織誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生的內(nèi)源性ROS可以作為第二信使，通過(guò)改變氧化還原狀態(tài)調(diào)節(jié)與細(xì)胞增殖、分化及凋亡相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中多種靶分子的活性，最終決定細(xì)胞的命運(yùn)[15]。在運(yùn)動(dòng)和PM2.5暴露組，各抗氧化酶活性總體呈下降趨勢(shì)，而組織中自由基的升高也對(duì)應(yīng)了抗氧化酶的降低。

氧自由基的增加可以通過(guò)分子機(jī)制誘導(dǎo)氧化酶發(fā)生適應(yīng)性變化，大強(qiáng)度訓(xùn)練時(shí)機(jī)體處于脈沖式的氧化應(yīng)激態(tài)中[16]，同時(shí)運(yùn)動(dòng)過(guò)程中酸性代謝產(chǎn)物的堆積也產(chǎn)生較多的自由基。在低、中、高劑量濃度的PM2.5暴露后，MDA和ROS均呈劑量相關(guān)性升高，因此結(jié)合抗氧化酶的結(jié)果推測(cè)，PM2.5所含的炭核、氮、硫、多環(huán)芳烴、內(nèi)毒素、細(xì)胞片段和過(guò)渡金屬等多種有害的化學(xué)成分，可以隨血液循環(huán)通過(guò)與各組織細(xì)胞接觸，并相互作用釋放出大量的ROS，穿過(guò)氣血屏障和血腦屏障，造成組織內(nèi)氧化與抗氧化系統(tǒng)的失衡。