徐小博， 王鑫堯， 郁偉杰， 苗一凡， 徐 博

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與草學(xué)學(xué)院， 吉林 長(zhǎng)春 130118)

茉莉酸類物質(zhì)(Jasmonates，JAs)包括茉莉酸(Jasmonate，JA)及其甲基化衍生物茉莉酸甲酯(Methyl jasmonate，MeJA)等[1]，均參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育促進(jìn)株體循環(huán)代謝，但不同JAs在其功能及用途方面具有差異性。茉莉酸甲基轉(zhuǎn)移酶(Jasmonate methyl transferase，JMT)是促進(jìn)JA轉(zhuǎn)化為MeJA反應(yīng)的關(guān)鍵酶[2]，2001年始Seo等韓籍科學(xué)家開始關(guān)注JMT對(duì)JAs分泌的促進(jìn)作用，并通過相關(guān)研究表明JMT的過表達(dá)能夠顯著提高馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)[3]、人參(PanaxginsengC. A. Meyer)[4]等高等植物中MeJA含量；Qi等在大花蕙蘭(CymbidiumhybridL.)花香物質(zhì)合成通路中也發(fā)現(xiàn)相似結(jié)果[5]。JMT作為JA與MeJA的轉(zhuǎn)化酶近年來才漸被關(guān)注，且JMT基因已成功在甘蔗(SaccharumofficinarumL.)[6]、茶樹(CamelliasinensisL.)[7]和紫蘇(PerillafrutescensL.)[8]中表達(dá)。

迄今為止，關(guān)于JMT基因的研究多從調(diào)控植物果實(shí)大小、植株形態(tài)及抗逆性等方面考慮[6-7,9]，與植物育性相關(guān)的研究暫未發(fā)現(xiàn)，且紫花苜蓿不育機(jī)理網(wǎng)絡(luò)還未構(gòu)建清晰，JAs在紫花苜蓿配子體發(fā)育過程中參與哪些過程還未明晰。實(shí)驗(yàn)室前期研究表明[10]，MsJMT在BSR育性混池中差異表達(dá)，那么驗(yàn)證該基因是否參與紫花苜蓿的不育機(jī)制則是本試驗(yàn)的基礎(chǔ)思路。

因此，試驗(yàn)通過克隆MsJMT基因全長(zhǎng)并進(jìn)行序列分析預(yù)測(cè)其功能，使用亞細(xì)胞定位、qPCR技術(shù)等明確其在細(xì)胞學(xué)層面和核酸層面的時(shí)空表達(dá)位置與表達(dá)量的變化，意在研究JA通路與MsJMT之間的關(guān)系和二者對(duì)紫花苜蓿(MedicagosativaL.)不育系的影響，為探究紫花苜蓿的不育機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)選取的紫花苜蓿不育系MSJN-1A與保持系MSJN-1B植物材料由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)提供，于2019年6月采集自吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院牧草育種實(shí)驗(yàn)基地內(nèi)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1紫花苜?？俁NA及cDNA的獲取 使用Plant RNA Mini Kit(OMEGA)進(jìn)行試驗(yàn)[11]，以RNA為模板使用ReverTra Ace qPCR RT Kit(TOYOBO)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，產(chǎn)物保存于-20℃保存。

1.2.2MsJMT基因的獲取 實(shí)驗(yàn)室于2019年7月構(gòu)建紫花苜蓿不育系BSA混池(規(guī)模：30+30+2)并委托百邁克生物科技有限公司完成了三代轉(zhuǎn)錄組測(cè)序工作，結(jié)果分析可知c115887.graph_c0基因片段預(yù)測(cè)功能為調(diào)控茉莉酸O-甲基轉(zhuǎn)移酶合成[10,12-13]。通過DNAMAN Version 9軟件進(jìn)行序列拼接并于NCBI Blast同源比對(duì)后得到MsJMT基因預(yù)測(cè)全長(zhǎng)序列。以紫花苜蓿cDNA為模板，設(shè)計(jì)引物MsJMT-25(表1)并擴(kuò)增MsJMT基因全長(zhǎng)[14]。后選用Mighty TA-cloning Reagent Set for PrimeSTAR(TAKARA)連接至pMD20-T vector。使用M13引物進(jìn)行PCR檢測(cè)，上樣電泳確認(rèn)條帶，將陽性子送至生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。菌液以1∶1 000濃度振蕩培養(yǎng)并抽提質(zhì)粒。命名為pMD20T-MsJMT。質(zhì)粒提取使用Plasmid Mini Kit Ⅰ(OMEGA)[15]。

表1 引物列表Table 1 Primer list

1.2.3MsJMT基因序列分析 采用表2中分析工具對(duì)MsJMT基因序列進(jìn)行分析

表2 基因序列分析工具Table 2 Gene sequence analysis tools

1.2.4亞細(xì)胞定位 以克隆載體為模板，5′端3′端分別添加BamHI，PstI酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物MsJMT-pHB(表1)，配制反應(yīng)體系。PCR膠回收后37℃雙酶切30 min，確認(rèn)酶切充分后將膠回收產(chǎn)物連接至亞細(xì)胞定位載體(pHB-YFP)進(jìn)行大腸桿菌轉(zhuǎn)化。電泳后根據(jù)片段位置挑選陽性子送測(cè)，確認(rèn)序列一致后擴(kuò)大培養(yǎng)并抽提質(zhì)粒。命名為Phb-YFP-MsJMT。將轉(zhuǎn)化入質(zhì)粒pHB-YFP空載、pHB-YFP-MsJMT的農(nóng)桿菌擴(kuò)繁并重懸菌體，調(diào)菌液OD600到0.6～0.8室溫靜置1 h；選取6～8周大的本室煙草，將菌液注射進(jìn)煙草葉片中黑暗培養(yǎng)過夜，后正常培養(yǎng)3天，進(jìn)行激光共聚焦觀察熒光。

1.2.5qPCR 以縱長(zhǎng)為參數(shù)，提取不育系、保持系Ⅰ～Ⅳ時(shí)期花苞總RNA(Ⅰ：≤0.2 cm；Ⅱ：0.2～0.4 cm；Ⅲ：0.4～0.6；Ⅳ：0.6～0.8 cm)，每時(shí)期3個(gè)重復(fù)，根莖葉同時(shí)進(jìn)行取樣。定量后反轉(zhuǎn)錄；設(shè)計(jì)擴(kuò)增片段為101 bp的MsJMT-qPCR引物(表1)，以紫花苜蓿Actin2為內(nèi)參[16]，配置qPCR反應(yīng)體系，每組均設(shè)復(fù)孔、空白孔，短暫離心后上機(jī)；所得結(jié)果采用2-△△CT法[17]計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。

1.2.6茉莉酸含量測(cè)定 采用Plant Jasmonic acid(JA)ELISA Kit(上海酶聯(lián)生物)進(jìn)行測(cè)定[18]。

1.2.7外源MeJA噴施方案 初花期紫花苜蓿不育系若干株，選取其中具有頂端開放1～5朵花花序的枝條，在離花序約15 cm處剪斷，插入瓶中帶回室內(nèi)水培。MeJA+0.2%DMSO+0.1%TWEEN-20用蒸餾水稀釋至0.5 mmol·L-1,1 mmol·L-1,2 mmol·L-1。將以MeJA處理的實(shí)驗(yàn)組命名為A(0.5 mmol·L-1)、B(1 mmol·L-1)和C(2 mmol·L-1),對(duì)照組命名為CK，CK組除不加MeJA外與其余試劑配比相同，每組兩枝，含花序8～10個(gè)，9∶00,16∶00各1次進(jìn)行噴施處理，噴施程度以花托完全濕潤(rùn)為基準(zhǔn)，5 d后取Ⅲ時(shí)期花蕾進(jìn)行切片觀察[19]。

1.2.8切片方法 采用HE染色法進(jìn)行染色并切片[20]。

1.2.9數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)的分析和計(jì)算采用Excel 2016和SPSS 25.0軟件進(jìn)行處理。

2.1 擴(kuò)增目的基因全長(zhǎng)

以cDNA為模板擴(kuò)增MsJMT基因全長(zhǎng)，高保真酶產(chǎn)物如圖1所示。MsJMT基因全長(zhǎng)為1 047 bp，電泳圖條帶清晰，位置正確，可以純化后用于后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 MsJMT基因全長(zhǎng)擴(kuò)增電泳圖Fig.1 Electrophoretic map of full-length MsJMT amplification注：M為D2000 DNA Marker,1～3為MsJMT全長(zhǎng)片段Note:M is D2000 DNA Marker,1～3 are full-length fragments of MsJMT

2.2 MsJMT基因全長(zhǎng)序列

測(cè)序結(jié)果經(jīng)分析后得到MsJMT基因全長(zhǎng)序列1 047 bp(圖2)。

圖2 MsJMT基因全長(zhǎng)序列Fig.2 Full length sequence of MsJMT

2.3 理化性質(zhì)分析

利用NCBI中的ORF Finder程序進(jìn)行分析，如圖3A所示，MsJMT潛在的編碼框?yàn)?0個(gè)，MsJMT完整開放閱讀框位于核苷酸序列的1到1 047 bp之間，全長(zhǎng)為1 047 bp，共編碼348個(gè)氨基酸。使用ProtParam工具對(duì)MsJMT基因編碼蛋白的物理和化學(xué)參數(shù)進(jìn)行計(jì)算，MsJMT蛋白包括348個(gè)氨基酸，其中含量最高的氨基酸是谷氨酸Glu(33個(gè)，9.5%)、亮氨酸Leu(32個(gè)，9.2%)、纈氨酸Val(26個(gè)，7.5%)，根據(jù)Guruprasad等[21]提供的權(quán)重值計(jì)算出MsJMT蛋白不穩(wěn)定系數(shù)為41.63，為不穩(wěn)定蛋白。采用Prabi在線軟件對(duì)蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，分析結(jié)果如圖3B所示?？芍鞍踪|(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)都由α-螺旋(Alpha helix)、延伸鏈(Extended strand)和無規(guī)則卷曲(Random coil)組成，MsJMT所占比例分別是37.93%，24.14%，37.93%。利用Expasy軟件的SMART程序預(yù)測(cè)MsJMT編碼的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)保守結(jié)構(gòu)域?yàn)閳D3C，發(fā)現(xiàn)位于16～346之間含有一個(gè)Methyltransf_7結(jié)構(gòu)域，表明該蛋白GO功能為甲基轉(zhuǎn)移酶活性。參考二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)于Swiss-model服務(wù)器得出蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)模型(圖3D)。

圖3 MsJMT基因ORF(A)、蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)(B)、蛋白結(jié)構(gòu)域(C)和蛋白三維結(jié)構(gòu)(D)預(yù)測(cè)圖Fig.3 ORF finder(A),secondary protein structure(B),protein domain(C) and protein three-dimensional structural model(D) of MsJMT gene

2.4 亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)

運(yùn)用TargetP 2.0服務(wù)器預(yù)測(cè)MsJMT編碼蛋白的亞細(xì)胞位置，返回的結(jié)果如圖4A所示。MsJMT基因編碼的蛋白Ctp值與Tltp值均為0，僅Mtp值為0.000 8，排除了在細(xì)胞外分泌的可能。預(yù)測(cè)該蛋白主要是存在于細(xì)胞質(zhì)的非分泌型蛋白，主要在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮生物學(xué)作用。運(yùn)用Cell-PLoc 2.0服務(wù)器預(yù)測(cè),結(jié)果表明該蛋白為核質(zhì)分泌蛋白(圖4B)。

2.5 BLAST比對(duì)、同源性分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的非冗余蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)(Nr)中下載與MsJMT高度同源的6條蛋白序列進(jìn)行同源比對(duì)。所選取的序列和相似度結(jié)果為：蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula，XP_003612068.1)相似度達(dá)100%;相思豆(Abrusprecatorius，XP_027362137.1)相似度100%;野大豆(Glycinesoja，XP_028197088.1)相似度100%;密花豆(Spatholobussuberectus，TKY55844.1)相似度100%;大豆(Glycinemax，NP_001237122.1)相似度100%;野大豆(Glycinesoja，RZC23540.1)相似度99%(圖4C)。利用Clustal Omega軟件分析MsJMT與其他物種同源蛋白的進(jìn)化關(guān)系，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，如圖4D。MsJMT與蒺藜苜蓿分子距離最近，其次與相思豆、野大豆、密花豆、大豆等植物的分子距離相對(duì)較近，證實(shí)MsJMT基因編碼蛋白序列與這6條蛋白序列具有極高的序列相似度。

圖4 TargetP 2.0(A),Cell-PLoc 2.0(B)服務(wù)器對(duì)MsJMT基因編碼蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)及其編碼氨基酸序列同源比對(duì) (C)和系統(tǒng)發(fā)育樹分析圖(D)Fig.4 The subcellular localization prediction from TargetP 2.0(A) and Cell-PLoc 2.0(B) server,the homology comparison of coding amino acid sequence(C)and the phylogenetic tree(D)of MsJMT gene

2.6 亞細(xì)胞定位結(jié)果

如圖5所示，激光共聚焦顯微鏡下發(fā)光部位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)。說明MsJMT在煙草葉片細(xì)胞中的瞬時(shí)表達(dá)位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，和亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果一致。

圖5 MsJMT亞細(xì)胞定位結(jié)果Fig.5 MsJMT subcellular localization

2.7 qPCR相對(duì)定量結(jié)果

將紫花苜蓿Actin2基因作為內(nèi)參基因，保持系作為參照因子(Calibrator)，計(jì)算出2-△△CT值。經(jīng)T檢驗(yàn)分析后得到，對(duì)比保持系，不育系花苞的MsJMT表達(dá)量在4個(gè)時(shí)期均顯著上升(P<0.05)，且在Ⅲ時(shí)期表現(xiàn)為極顯著(P<0.05)；在植株根莖葉部分不育系與保持系表達(dá)量差異不顯著。

圖6 MsJMT在不育系各時(shí)期的相對(duì)表達(dá)量Fig.6 The relative expression of MsJMT in male sterile lines at different stages注：不同字母表示在不同處理下差異顯著(P<0.05)，“*”表示在不同處理下差異顯著(0.01≤P<0.05)，“* *”表示在不同處理下差異極顯著(0.001≤P<0.01)，下同Note:Different letters indicate significant difference under different treatments at the 0.05 level,“*” indicates significant difference under different treatments (0.01≤P<0.05),“* *” indicates a very significant difference under different treatments (0.001≤P<0.01), the same as below

2.8 不同發(fā)育時(shí)期花苞內(nèi)茉莉酸含量變化

以標(biāo)準(zhǔn)物濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線得到：y≈0.000 5x+0.112 6，且R2>0.95具有可參照性。

由標(biāo)準(zhǔn)曲線得到Ⅰ～Ⅳ時(shí)期不育系保持系的花苞JA含量，結(jié)果可得，不育系JA含量在全時(shí)期內(nèi)無顯著波動(dòng)且低于保持系，保持系的JA含量在Ⅱ,Ⅲ時(shí)期均顯著升高，且在Ⅲ時(shí)期時(shí)達(dá)到最高，為同時(shí)期不育系的1.54倍。

圖7 紫花苜蓿不育系保持系各時(shí)期花苞內(nèi)JA含量Fig.7 The content of jasmonic acid in the flower buds of the sterile lines of alfalfa was maintained

2.9 外源MeJA噴施后不育系花藥形態(tài)特征

如圖8所示，處理后，CK組花藥無開裂現(xiàn)象；A組花藥雖開裂但其形態(tài)不自然，可見花藥壁回縮；B組花藥裂口較大，藥室形態(tài)飽滿，開裂完全;C組噴施后出現(xiàn)花苞掉落現(xiàn)象，觀察頂部Ⅰ時(shí)期花藥形態(tài)可見4藥室與藥隔均萎縮。

圖8 不同濃度MeJA溶液噴施不育系藥切片F(xiàn)ig.8 Sterile line Ⅲ period sections spray on different concentrations of MeJA solution注：CK,A,B組為Ⅲ時(shí)期，C組因噴施后具花苞脫落現(xiàn)象故?、駮r(shí)期(×80)Note:Group CK,A and B were stage Ⅲ,and group C was stage Ⅰ because of the phenomenon of flower bud shedding after spraying(×80)

3 討論

由基因序列分析可知，MsJMT基因全長(zhǎng)1 047 bp，具有Methyltransf＿7保守結(jié)構(gòu)域。陳麗蘭等[6]認(rèn)為包含此保守結(jié)構(gòu)域的ScJMT基因?qū)儆赟ABATH甲基轉(zhuǎn)移酶家族，且在進(jìn)化樹分析下發(fā)現(xiàn)JMT基因在植物界基因序列差異性較大，尤其在單雙子葉間親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，但功能性相對(duì)保守，因此具有家族共性，適合于模式植物研究。由本試驗(yàn)結(jié)果可知，不育系苜蓿在花苞Ⅲ時(shí)期MsJMT表達(dá)量最高，且在Ⅰ～Ⅳ時(shí)期內(nèi)，不育系花苞的表達(dá)量均高于保持系，此結(jié)果與棉花(Gossypiumspp.)細(xì)胞質(zhì)雄性不育系得到的結(jié)論相同[22]，可以推斷由MsJMT調(diào)控的JMT蛋白在花苞處作用，在特定時(shí)期通過調(diào)控JA與MeJA的轉(zhuǎn)化效率從而控制育性器官內(nèi)的激素水平，達(dá)到影響植株育性的目的。JMT作用于亞麻酸通路下的茉莉酸內(nèi)外源轉(zhuǎn)化，催化JA甲基化形成MeJA，因此JMT主要作用于細(xì)胞內(nèi)部，與亞細(xì)胞定位結(jié)果相吻合。在水稻(OryzasativaL.)中，過表達(dá)JMT基因會(huì)降低穗長(zhǎng)、種子質(zhì)量和結(jié)實(shí)率[23-24]；相同情況在擬南芥(ArabidopsisthalianaL.)中也有所表現(xiàn)[25]，這暗示了JMT或具有影響植物育性的功能，根據(jù)qPCR結(jié)果可得，MsJMT在不育系花苞相對(duì)表達(dá)量較高，與此推論契合。

對(duì)于MeJA來說，作為JMT催化的反應(yīng)產(chǎn)物，其為一種外源植物間介導(dǎo)激素，可作為植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑使用，適量的噴施可促進(jìn)花藥開裂[26]。本試驗(yàn)表明，CK組不育系藥室裂口閉合；A，B組經(jīng)MeJA處理使本應(yīng)閉合的花藥裂口張開(圖8)。可見適量濃度的MeJA雖無法促進(jìn)小孢子的正常發(fā)育，但可誘導(dǎo)花藥開裂。而紫花苜蓿不育系的表型特征即為花藥不開裂、花粉育性差，因此MeJA在一定程度上具有改善育性功能的作用。

本試驗(yàn)中，MsJMT在紫花苜蓿不育系內(nèi)表達(dá)對(duì)比保持系各時(shí)期呈下調(diào)趨勢(shì)，且花苞內(nèi)MsJMT的表達(dá)量與JA含量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，此結(jié)果與實(shí)驗(yàn)室之前對(duì)紫花苜蓿進(jìn)行BSR篩選在轉(zhuǎn)錄組層面得到的結(jié)果一致，因此可推斷MsJMT的過表達(dá)應(yīng)當(dāng)為導(dǎo)致紫花苜蓿雄性不育原因的其中之一。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)成功克隆了MsJMT基因全長(zhǎng)。結(jié)果表明MsJMT的表達(dá)在不育組與可育組間具有差異。利用外源MeJA噴施證實(shí)該激素對(duì)花藥開裂具促進(jìn)作用，且最適濃度為1 mmol·L-1。以上表明MsJMT可能通過影響JA通路參與植株育性表達(dá)，后續(xù)轉(zhuǎn)化驗(yàn)證工作有待進(jìn)行，下一步可針對(duì)該通路進(jìn)行育性候選基因挖掘。