楊驍 張曉龍（西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院科研中心實(shí)驗(yàn)室，西安 710004）

中性粒細(xì)胞是固有免疫系統(tǒng)中抵抗病原入侵的第一道防線，能夠及時(shí)且有效地清除入侵細(xì)菌，同時(shí)也可誘發(fā)炎癥反應(yīng)進(jìn)而引起組織損傷［1-2］。學(xué)術(shù)界傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，中性粒細(xì)胞是一類性質(zhì)單一、終末分化、生命周期較短且增殖能力受限的細(xì)胞群體［3］。但越來越多的證據(jù)表明，中性粒細(xì)胞具有一定的異質(zhì)性［4-6］。如腫瘤微環(huán)境中的中性粒細(xì)胞具有一定的功能異質(zhì)性，一方面中性粒細(xì)胞可通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、免疫逃逸及腫瘤組織血管生成加速腫瘤的發(fā)生與發(fā)展；同時(shí)，中性粒細(xì)胞亦可促進(jìn)T細(xì)胞抗腫瘤效應(yīng)，通過產(chǎn)生殺傷腫瘤相關(guān)細(xì)胞因子以抑制腫瘤生長(zhǎng)［7-9］。然而，中性粒細(xì)胞是否具有一定的組織特異性，其功能是否受組織微環(huán)境調(diào)控，仍有待闡明。本研究通過檢索ImmGEN數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得了骨髓中性粒細(xì)胞與脾臟中性粒細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組表達(dá)相關(guān)數(shù)據(jù)［10-11］。本研究首先分析了骨髓與脾臟中性粒細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子的基礎(chǔ)表達(dá)水平；隨后開展了相關(guān)功能學(xué)實(shí)驗(yàn)，探討骨髓與脾臟中性粒細(xì)胞的炎癥因子表達(dá)能力、LPS刺激后炎癥反應(yīng)能力、LPS刺激后自發(fā)凋亡水平、吞噬細(xì)菌能力等幾個(gè)方面可能存在的細(xì)胞功能學(xué)差異。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí) 驗(yàn) 動(dòng) 物9只SPF級(jí)C67BL/6J小 鼠，6～8周齡，體質(zhì)量21～23 g，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司［SCXK（京）2016-0006］。本研究所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)依據(jù)優(yōu)化、減少、替代的3R原則設(shè)計(jì)，經(jīng)過西安交通大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，動(dòng)物福利倫理批件號(hào)：XJTULAC2018-2225。

1.1.2主要試劑與儀器小鼠Ly6G-PE-Cy7、CD11b-APC流式抗體（1∶200，Biolegend，美國(guó)）；RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清（Gibco，美國(guó)）；RNA提取試劑Trizol（Invitrogen，美國(guó)）；cDNA合成試劑盒（Thermo，美國(guó)）；SYBR Green熒光定量盒（TaKaRa，日本）；引物序列合成（北京六合華大基因科技股份有限公司）；Annexin V-PI凋亡檢測(cè)試劑盒（Sigma，美國(guó)）；FITC染料（上海翌圣生物科技有限公司）；大腸埃希菌（Escherichia coli，E.coli）DH5α（北京全式金生物有限公司）；流式細(xì)胞儀為ARIAⅡ（BD，美國(guó)）；Nanodrop微量分光光度計(jì)（Thermo，美國(guó)）。

1.2方法

1.2.1流式分選小鼠骨髓與脾臟中性粒細(xì)胞取3只C67BL/6J小鼠，脫頸處死，采用75%乙醇浸泡消毒后，于超凈臺(tái)內(nèi)解剖小鼠，剝離肌肉組織，取出四肢股骨、后肢脛骨和髂骨，PBS-EDTA緩沖液反復(fù)灌洗出骨髓細(xì)胞；同時(shí)，解剖取出小鼠脾臟組織，研磨后獲得脾臟細(xì)胞。將收集的骨髓細(xì)胞用200目尼龍膜過濾后計(jì)數(shù)，1 650 r/min、4℃條件下離心10 min，重懸后取2×108個(gè)骨髓細(xì)胞和5×108個(gè)脾臟細(xì)胞，分別加入20 μl的Ly6G-PE-Cy7抗體和CD11b-APC抗體，避光冰上孵育30 min后，離心去上清，將細(xì)胞加入10 ml流式緩沖液重懸，過200目無菌濾網(wǎng)后上機(jī)進(jìn)行流式細(xì)胞分選；分別選取1×106個(gè)骨髓細(xì)胞和脾臟細(xì)胞，分別加入1 μl的Ly6G-PE-Cy7抗體和CD11b-APC抗體，行上述流式抗體染色步驟，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)中性粒細(xì)胞比例，具體步驟參考文獻(xiàn)［12-13］。通過流式分選，獲得了2×107個(gè)Ly6G+CD11b+骨髓或脾臟中性粒細(xì)胞，均分為3部分，分別用于LPS作用后炎癥因子表達(dá)實(shí)驗(yàn)、LPS作用后中性粒細(xì)胞自發(fā)凋亡實(shí)驗(yàn)及中性粒細(xì)胞吞噬細(xì)菌實(shí)驗(yàn)，所有實(shí)驗(yàn)均至少開展3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2LPS刺激骨髓和脾臟中性粒細(xì)胞將收集的中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)，接種于12孔板，以5×105個(gè)/孔，實(shí)驗(yàn)共分為4組，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，分組為骨髓中性粒細(xì)胞對(duì)照組（空白培養(yǎng)基）、骨髓中性粒細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組（LPS刺激）、脾臟中性粒細(xì)胞對(duì)照組（空白培養(yǎng)基）、脾臟中性粒細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組（LPS刺激），LPS濃度為100 ng/ml，作用6 h，收集細(xì)胞提取RNA，qRT-PCR檢測(cè)炎癥因子表達(dá)；同時(shí)，重復(fù)以上實(shí)驗(yàn)步驟，將實(shí)驗(yàn)分為兩組，分別為骨髓實(shí)驗(yàn)組和脾臟實(shí)驗(yàn)組，LPS作用時(shí)長(zhǎng)調(diào)整為12 h，收集細(xì)胞行Annexin V和PI雙染，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)中性粒細(xì)胞的自發(fā)凋亡。

1.2.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)收集處理后的中性粒細(xì)胞提取總RNA，采用Nanodrop微量分光光度計(jì)測(cè)定提取RNA的含量與質(zhì)量（OD值1.8～2.0），取1 μg左右的RNA，利用cDNA合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用SYBR Green檢測(cè)目的基因mRNA表達(dá)水平，按照說明書將反應(yīng)體系設(shè)置為20 μl，擴(kuò)增程序設(shè)為：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性15 s，60℃復(fù)性及延伸1 min，40個(gè)循環(huán)；每個(gè)樣品均設(shè)置3個(gè)技術(shù)重復(fù)。采用2-ΔΔCt相對(duì)定量法進(jìn)行目的基因相對(duì)表達(dá)量分析，以加入空白培養(yǎng)基的骨髓中性粒細(xì)胞基因的表達(dá)設(shè)置為參照（RQ=1），具體步驟參照文獻(xiàn)［14-15］。本研究涉及的引物信息見表1。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物信息Tab.1 Primers for qRT-PCR detection

1.2.4中性粒細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn) 參照試劑盒說明書，收集中性粒細(xì)胞于15 ml離心管，1 000 r/min離心10 min；用預(yù)冷的PBS洗滌2次，1 000 r/min離心10 min；用100 μl的Binding Buffer重懸，加入2 μl Annexin V-APC抗體，混勻，避光，冰上孵育15 min；加入250 μl的Binding Buffer重懸，轉(zhuǎn)至流式管，上機(jī)前加入1 μl PI溶液（50 μg/ml），2 min后，迅速上機(jī)檢測(cè)。其中，Annexin V+PI-的細(xì)胞群為早期凋亡細(xì)胞群，Annexin V+PI+的細(xì)胞群為晚期凋亡細(xì)胞群。

1.2.5中性粒細(xì)胞吞噬E.coli實(shí)驗(yàn)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的E.coli，PBS洗滌2次；用PBS（pH=7.2）配成濃度為0.5×109個(gè)/ml的懸液，加入二甲基亞砜（DMSO）配成的FITC溶液儲(chǔ)存液（10 mg/ml），實(shí)驗(yàn)時(shí)將菌液中的FITC調(diào)整至工作濃度（5 μg/ml）；然后于37℃放置1.5 h，取出離心，棄上清，PBS洗滌2次；1%多聚甲醛固定30 min，PBS洗滌2次，配成濃度為1×109個(gè)/ml的懸液，避光保存于4℃?zhèn)溆?。?.2.1獲得的小鼠骨髓與脾臟中性粒細(xì)胞，濃度調(diào)整至5×106個(gè)/ml，取100 μl加入至1.5 ml離心管，加入10 μl FITC標(biāo)記后 的E.coli工 作液，混勻后 置于37℃水浴鍋孵育15 min后，迅速取出置于冰上10 min，將實(shí)驗(yàn)樣本移入流式管，使用預(yù)冷的PBS洗滌1遍，1%多聚甲醛固定后，行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用FlowJo軟件對(duì)流式數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，使用GraphPad Prism 6.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用±s表示，采用Levene法行方差齊性檢驗(yàn)，組間比較采用非配對(duì)t檢驗(yàn)或Mann-Whitney檢驗(yàn)，以P＜0.05差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1骨髓與脾臟中性粒細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)的比較經(jīng)檢索ImmGen數(shù)據(jù)庫(kù)中小鼠Ly6G+CD11b+骨髓與脾臟中性粒細(xì)胞RNAseq測(cè)序數(shù)據(jù)，獲得了骨髓和脾臟中性粒細(xì)胞表達(dá)中性粒細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子的差異。以表達(dá)倍數(shù)＞2為高表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)現(xiàn)骨髓中性粒細(xì)胞高表達(dá)的CC型趨化因子為CCL5，高表達(dá)的CXC型趨化因子為CXCL12、CXCL13，高表達(dá)的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子為IL-12A，高表達(dá)的促血管生成或促纖維化細(xì)胞因子為FGF2，高表達(dá)的其他細(xì)胞因子為Activin A，共占統(tǒng)計(jì)中性粒細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子的11.36%（5/44）。而在脾臟中性粒細(xì)胞高表達(dá)的CC型趨化因子有CCL2、CCL3、CCL4，高表達(dá)的CXC型趨化因子為CXCL1、CXCL2、CXCL4、CXCL9，高表達(dá)的促炎細(xì)胞因子為IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-18，高表達(dá)的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子為IL-10、IL-12β、IL-21，高表達(dá)的集落刺激因子為CSF1，高表達(dá)的抗炎細(xì)胞因子為TGFB1，高表達(dá)的TNF超級(jí)組成員為TNF、TNFSF13B，高表達(dá)的促血管生成或促纖維化細(xì)胞因子為TGFA，高表達(dá)的其他細(xì)胞因子為MDK，占統(tǒng)計(jì)中性粒細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子的45.45%（20/44）。以上結(jié)果表明，骨髓與脾臟中性粒細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子的基礎(chǔ)表達(dá)水平具有一定的差異，具體結(jié)果見附表1（www.immune99.com）。

2.2流式細(xì)胞術(shù)分選小鼠骨髓與脾臟中性粒細(xì)胞流式結(jié)果表明，Ly6G+CD11b+骨髓中性粒細(xì)胞占骨髓白細(xì)胞總數(shù)的（30.33±1.01）%，共分選獲得2×107個(gè)骨髓中性粒細(xì)胞；Ly6G+CD11b+骨髓中性粒細(xì)胞占脾臟總細(xì)胞數(shù)的（3.63±0.14）%，共分選獲得2×107個(gè)脾臟中性粒細(xì)胞，見圖1。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)分選Ly6G+CD11b+骨髓和脾臟中性粒細(xì)胞Fig.1 Sorting Ly6G+CD11b+neutrophils from bone marrow and spleen by flow cytometry

2.3LPS誘導(dǎo)骨髓和脾臟中性粒細(xì)胞炎癥相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)結(jié)果顯示：LPS作用后骨髓中性粒細(xì)胞IL-1β表達(dá)（2.37±0.25）較對(duì)照組（1.03±0.06）提高2.3倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。IL-6表達(dá)（4.28±0.51）較對(duì)照組（1.05±0.09）提高4.08倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。TNF表達(dá)（5.50±0.36）較對(duì)照組（1.08±0.06）升高約5.09倍，具有顯著性差異（P＜0.05）。同時(shí)，LPS作用后脾臟中性粒細(xì)胞L1B表達(dá)（6.21±0.59）較對(duì)照組（22.80±5.80）提高3.67倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。IL-6表達(dá)（13.64±0.83）較對(duì)照組（21.22±1.27）提高1.56倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。TNF表達(dá)（2.89±0.36）較對(duì)照組（0.85±0.05）提高約3.4倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。以上結(jié)果表明，在LPS作用下，骨髓中性粒細(xì)胞和脾臟中性粒細(xì)胞均具有較強(qiáng)的炎癥反應(yīng)能力；考慮到脾臟中性粒細(xì)胞IL-1β和IL-6等炎癥因子的基礎(chǔ)表達(dá)量明顯高于骨髓中性粒細(xì)胞（圖2），脾臟中性粒細(xì)胞的分泌炎癥因子的能力要強(qiáng)于脾臟中性粒細(xì)胞。

圖2 炎癥相關(guān)因子IL-1β、IL-6和TNF的mRNA表達(dá)水平Fig.2 mRNA expression levels of inflammatory factors IL-1β，IL-6 and TNF

2.4LPS對(duì)骨髓和脾臟中性粒細(xì)胞自發(fā)性凋亡的影響 結(jié)果顯示：LPS作用12 h后，骨髓中性粒細(xì)胞晚期凋亡細(xì)胞比例［（7.65±0.99）%］與脾臟中性粒細(xì)胞晚期凋亡比例［（8.53±0.81）%］差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；同時(shí)骨髓中性粒細(xì)胞早期凋亡細(xì)胞比例［（53.93±2.30）%］與脾臟中性粒細(xì)胞早期凋亡比例［（55.78±1.71）%］差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以上結(jié)果表明，LPS作用后骨髓中性粒細(xì)胞與脾臟中性粒細(xì)胞自發(fā)凋亡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖3。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)骨髓和脾臟中性粒細(xì)胞凋亡Fig.3 Apoptosis of bone marrow and splenic neutrophils by flow cytometry

2.5骨髓與脾臟中性粒細(xì)胞吞噬細(xì)菌能力比較結(jié)果顯示：骨髓中性粒細(xì)胞吞噬率為［（78.94±1.36）%］，顯著高于脾臟中性粒細(xì)胞［（42.28±1.34）%，P＜0.05］。結(jié)果表明，骨髓中性粒細(xì)胞吞噬細(xì)菌的能力顯著高于脾臟中性粒細(xì)胞，見圖4。

圖4 骨髓和脾臟中性粒細(xì)胞吞噬大腸埃希菌的流式分析圖Fig.4 Flow cytometre analysis of E.coli phagocytosis by neutrophils from bone marrow and spleen

3 討論

機(jī)體免疫系統(tǒng)中的吞噬細(xì)胞主要由單核/巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞兩大類構(gòu)成［16-17］。其中，巨噬細(xì)胞不僅具有較強(qiáng)的吞噬功能，還是一類抗原遞呈細(xì)胞，參與機(jī)體的固有免疫和特異性免疫的觸發(fā)與調(diào)節(jié)［18-19］。而中性粒細(xì)胞主要參與針對(duì)入侵細(xì)菌的吞噬過程，相較于巨噬細(xì)胞，中性粒細(xì)胞參與的免疫反應(yīng)速度快、強(qiáng)度高，往往繼發(fā)性導(dǎo)致炎癥損傷［20-21］。目前學(xué)術(shù)界對(duì)巨噬細(xì)胞的異質(zhì)性進(jìn)行了較為完善的闡述，按其功能表型、駐留器官、發(fā)育來源可劃分為不同的異質(zhì)性細(xì)胞亞群。如根據(jù)其促炎/抑炎免疫反應(yīng)的功能表型，可劃分為M1型巨噬細(xì)胞（經(jīng)典活化型）和M2型巨噬細(xì)胞（選擇活化性）［22］。根據(jù)其駐留器官，可劃分為肝臟組織中的庫(kù)佛細(xì)胞、皮膚組織中朗格的漢斯細(xì)胞、腦組織中的小膠質(zhì)細(xì)胞、肺臟組織中的肺泡巨噬細(xì)胞、骨組織中的破骨細(xì)胞等［23］。根據(jù)其分化發(fā)育來源，可分為胎肝造血干細(xì)胞來源、胚胎造血干細(xì)胞來源、成體骨髓造血干細(xì)胞來源的巨噬細(xì)胞［24］。隨著目前巨噬細(xì)胞異質(zhì)性研究的不斷深入，研究技術(shù)手段的不斷更新，學(xué)術(shù)界對(duì)巨噬細(xì)胞在各類疾病中的復(fù)雜調(diào)控機(jī)制進(jìn)行更為清晰地闡明。然而目前國(guó)內(nèi)對(duì)中性粒細(xì)胞異質(zhì)性的研究還較少，通過設(shè)置“中性粒細(xì)胞”“異質(zhì)性”為檢索詞，發(fā)現(xiàn)知網(wǎng)中僅有一篇綜述對(duì)腫瘤相關(guān)中性粒細(xì)胞的功能異質(zhì)性進(jìn)行了總結(jié)［25］。因此，在功能學(xué)層面對(duì)不同組織來源的中性粒細(xì)胞的異質(zhì)性進(jìn)行闡述，將有助于對(duì)中性粒細(xì)胞的免疫調(diào)控機(jī)理進(jìn)行更為深刻的理解，為基于中性粒細(xì)胞的免疫干預(yù)調(diào)控提供更為精準(zhǔn)的理論指導(dǎo)。

本研究首先比較了ImmGEN數(shù)據(jù)庫(kù)中骨髓與脾臟中性粒細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)脾臟中性粒細(xì)胞高表達(dá)的細(xì)胞因子占到統(tǒng)計(jì)指標(biāo)總數(shù)的45.45%，遠(yuǎn)高于骨髓中性粒細(xì)胞高表達(dá)細(xì)胞因子數(shù)量（11.36%）；同時(shí)，二者對(duì)LPS的刺激均能夠做出較強(qiáng)的免疫應(yīng)答，考慮到脾臟中性粒細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子的基線表達(dá)水平較高，表明脾臟中性粒細(xì)胞參與免疫反應(yīng)釋放炎癥因子的能力更強(qiáng)。推測(cè)該功能差異可能與其所處骨髓或脾臟微環(huán)境調(diào)控相關(guān)，而其具體機(jī)制還需要更進(jìn)一步深入研究。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，骨髓和脾臟中性粒細(xì)胞在LPS作用后，其自發(fā)凋亡水平無明顯差異，表明其在較短生命周期特征這一方面，并未表現(xiàn)出異質(zhì)性。然而，在吞噬功能方面，骨髓中性粒細(xì)胞吞噬功能顯著高于脾臟，其可能存在的機(jī)制亦需后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步闡明。

骨髓是人體的造血器官，同時(shí)也是包括人類在內(nèi)所有哺乳動(dòng)物免疫系統(tǒng)發(fā)生的重要場(chǎng)所。骨髓微環(huán)境內(nèi)定居著大量造血干細(xì)胞、造血祖細(xì)胞、不同發(fā)育階段的各種免疫細(xì)胞與各類基質(zhì)細(xì)胞，通過細(xì)胞-細(xì)胞間接觸和分泌細(xì)胞因子調(diào)控骨髓微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)與骨髓微環(huán)境中細(xì)胞的功能［26］。脾臟是人和動(dòng)物體內(nèi)外周環(huán)境最大的免疫器官，盡管成年小鼠脾臟具備一定的造血功能，但成年人類脾臟的造血功能已逐漸消退，只有當(dāng)機(jī)體嚴(yán)重貧血和某些病理狀態(tài)時(shí)，才恢復(fù)其造血功能［27］。因此在機(jī)體穩(wěn)態(tài)環(huán)境下，脾臟主要具有機(jī)體免疫細(xì)胞儲(chǔ)存、直接參與免疫反應(yīng)等功能。綜上，推測(cè)骨髓與脾臟中免疫細(xì)胞的異質(zhì)性，可能與其所處的骨組織與脾臟組織微環(huán)境的構(gòu)成、功能、穩(wěn)態(tài)維持策略、免疫反應(yīng)調(diào)控機(jī)制等密切相關(guān)；同時(shí)，骨髓與脾臟中免疫細(xì)胞可能在發(fā)育成熟度上亦存在一定差異。

綜上，相較于脾臟中性粒細(xì)胞，骨髓中性粒細(xì)胞具有更強(qiáng)的吞噬能力；在釋放炎癥細(xì)胞因子的免疫反應(yīng)中，相較于骨髓中性粒細(xì)胞，脾臟中性粒細(xì)胞能釋放更多的炎癥細(xì)胞因子。二者在吞噬能力和炎癥因子釋放能力兩方面展現(xiàn)出一定的異質(zhì)性。然而，針對(duì)中性粒細(xì)胞生命周期較短這一特征，骨髓中性粒細(xì)胞與脾臟中性粒細(xì)胞并未展現(xiàn)出差異性。本研究初步研究了骨髓中性粒細(xì)胞與脾臟中性粒細(xì)胞功能學(xué)水平的異質(zhì)性，對(duì)未來基于中性粒細(xì)胞異質(zhì)性的免疫疾病機(jī)制研究物奠定了理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。