龐天鴻，蔣建新，張鋒倫，馬世宏，陳殿松，朱莉偉*

（1.北京林業(yè)大學(xué)材料科學(xué)與技術(shù)學(xué)院國(guó)家林業(yè)和草原局木本香料（華東）工程研究中心，北京 100083；2.南京野生植物綜合利用研究所，江蘇 南京 211111；3.廣州德谷個(gè)人護(hù)理用品有限公司，廣東 廣州 510880）

在我國(guó)，皂莢（Gleditsia sinensisLam.）的種植區(qū)域非常廣泛，約占總面積的50%，大多數(shù)分布于黃河以南的地區(qū)［1］。皂莢中含有豐富的皂素，是一種天然的表面活性劑。皂素的提取工藝主要包括有機(jī)溶劑提取和水提取，或者兩者以一定的比例混合以獲得不同極性的溶劑進(jìn)行提?。?-3］。三萜皂素是皂莢中的主要活性物質(zhì)，由于其良好的生物活性，如抗炎、抗菌和抗氧化等多種功能，在過去的幾年里一直被學(xué)者深入研究［4-5］。隨著石油資源的不斷消耗和環(huán)境問題的日趨嚴(yán)重，合成表面活性劑的生產(chǎn)成本越來越昂貴。大量合成表面活性劑的使用對(duì)環(huán)境造成了嚴(yán)重的污染，對(duì)人體健康也產(chǎn)生了不可忽視的負(fù)面影響。因此，表面活性劑必須朝著天然、綠色和可再生的方向發(fā)展［6］，而皂莢皂素正是一種具有巨大潛力的生物表面活性劑。目前對(duì)于不同溶劑提取粗皂素中所含成分的差異研究較少，因此本研究以皂莢果皮為原料，選用水、80%乙醇、無水乙醇三種溶劑分別提取三次，分析測(cè)定粗皂素得率和粗皂素中的化學(xué)成分，并對(duì)其表面活性進(jìn)行了比較研究。

1 材料與方法

1.1 原料、試劑和儀器

皂莢果皮，干燥、粉粹、過60目篩，存放于自封袋中備用。無水乙醇、鹽酸、硼酸、濃硫酸、氫氧化鈉、硫酸鉀、硫酸銅、沒食子酸、福林酚、碳酸鈉、碳酸鈣，均為分析純?cè)噭灰译婧图姿釣樯V純；纖維二糖、葡萄糖、木糖、鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖為標(biāo)準(zhǔn)品（Sigma公司）；綠原酸、槲皮素、兒茶素、根皮苷、根皮素、表兒茶素為標(biāo)準(zhǔn)品（Macklin公司）。

R203型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海申生科技有限公司）；ALPHA-T型紅外光譜儀（德國(guó)Bruker公司）；SCIWNTZ-18N型冷凍干燥機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；SKO-08S2型紅外智能消化爐（上海沛歐分析儀器有限公司）；SKD-100型自動(dòng)凱氏定氮儀（上海沛歐分析儀器有限公司）；2151型羅氏泡沫儀；Agilent 1260型高效液相色譜（美國(guó)Agilent公司）；UV-6100A型紫外可見分光光度計(jì)（上海比朗儀器有限公司）；YSQ-LS型全自動(dòng)滅菌鍋（上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司）；BZY-101型自動(dòng)表面張力儀（上海方瑞有限公司）等。

1.2 原料水分的測(cè)定

采用GB5009.3—2016《食品中水分的測(cè)定》［7］測(cè)定皂莢果皮水分含量為（7.49±0.07）%。

1.3 粗皂素的提取

分別選用三種試劑（水，80%乙醇，無水乙醇）提取三次，提取條件如表1所示。水提取液采用冷凍干燥，80%乙醇和無水乙醇提取液經(jīng)旋蒸濃縮后真空干燥。所有粗皂素提取物干燥后，裝入自封袋，放入干燥器中保存?zhèn)溆谩４衷硭氐寐矢鶕?jù)下式進(jìn)行計(jì)算：

表1 不同次數(shù)提取皂素的條件Tab.1 Conditions for extraction of saponin in different times

式中：Y-粗皂素得率，%；m1-粗皂素質(zhì)量，g；m2-原料質(zhì)量，g。

1.4 化學(xué)成分測(cè)定

1.4.1 蛋白質(zhì)

根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB5009.5—2016《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》［8］，采用凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)含量。蛋白質(zhì)含量根據(jù)下式進(jìn)行計(jì)算：

式中：Y-蛋白質(zhì)含量，%；V1-試液消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定液的體積，mL；V2-試液空白消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定液的體積，mL；c-鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液濃度，mol/L；m1-粗皂素質(zhì)量，g；F-氮換算為蛋白質(zhì)的系數(shù)，本試樣為6.25。

1.4.2 黃酮

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)仁果類水果中類黃酮的測(cè)定（NY/T2741—2015），采用高效液相色譜法（High performance liquid chromatogroply，HPLC）測(cè)定粗皂素中黃酮的含量，綠原酸、槲皮素、兒茶素、根皮苷、根皮素、表兒茶素為6種標(biāo)準(zhǔn)品。

HPLC分析條件為：色譜柱為C18-PLUS柱（4.6 mm×250 mm），流動(dòng)相A為0.1%甲酸，流動(dòng)相B為0.1%甲酸：乙腈（50：50，v/v），洗脫梯度為：0～45 min，23%～50%B；45～65 min，50%～80%B；65～68 min，80%～100%B；68～73 min，100%B；73～76 min，100～23%B；76～80 min，23%B。流速為1 mL/min，柱溫為40℃，進(jìn)樣量為10μL，檢測(cè)器為DAD，檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm（原花青素）、330 nm（酚酸）、360 nm（黃酮醇及其糖苷）。

1.4.3 總多酚

根據(jù)植物提取物及其制品中總多酚含量的測(cè)定（T/AHFIA005—2018），采用福林酚分光光度法測(cè)定粗皂素中總多酚的含量。

分別移取9.4 mg/L沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL于10 mL容量瓶中，加入1 mL福林酚試劑，搖勻，加入2.5 mL 15%碳酸鈉溶液，加水定容搖勻，放入40℃水浴鍋中恒溫60 min，冷卻至室溫。配 制 成 濃 度 為0.94、1.88、2.82、3.76、4.70、5.64 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在778 nm測(cè)量其吸光度值。以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，回歸方程為：Y=0.01358X-0.013（R2=0.996）。吸取1.0 mL待測(cè)液于10 mL容量瓶中，按相同方法測(cè)定其吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測(cè)液中總多酚的濃度。

1.4.4 皂素組成

采用稀酸水解法，準(zhǔn)確稱量0.300 0 g粗皂素加入86.73 mL 4%的硫酸溶液，121°C水解1 h，冷卻至室溫，中和，采用高效液相色譜法測(cè)定水解后粗皂素中單糖的含量C單糖，對(duì)剩余固體殘?jiān)M(jìn)行干燥得出皂苷元含量C皂苷元。另外再取粗皂素配成水溶液，采用高效液相色譜法測(cè)定粗皂素中游離糖的含量C游離糖，將粗皂素中的游離糖統(tǒng)稱為游離碳水化合物。

HPLC分析條件為：HPX-87P柱（300 mm×7.8 mm），流動(dòng)相為水，流速為0.6 mL/min，柱溫為75℃，進(jìn)樣量為5μL，檢測(cè)器為ELSD。

1.5 表面張力的測(cè)定

稱取0.2 g粗皂素，采用去離子水溶解，定容于50 mL容量瓶中，得到4 g/L的溶液并逐級(jí)稀釋至2、1、0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25 g/L。將不同濃度梯度的粗皂素溶液，放入30℃水浴鍋中恒溫30 min，測(cè)量其表面張力，取三次的平均值。以表面張力作為縱坐標(biāo)，濃度的對(duì)數(shù)lgC作為橫坐標(biāo)，繪制表面張力折線圖，根據(jù)其拐點(diǎn)得出相對(duì)應(yīng)的臨界膠束濃度（Critical micelle concentration，CMC）。

1.6 泡沫高度的測(cè)定

根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T13173—2021《表面活性劑 洗滌劑試驗(yàn)方法》［9］，采用Ross-Miles法測(cè)定泡沫高度。

1.7 紅外光譜

分別將不同溶劑第一次提取粗皂素與溴化鉀以1：100比例混和均勻，研磨后壓制成片。采用傅立葉變換紅外光譜儀，在400～400 0 cm-1區(qū)間掃描。

2 結(jié)果與討論

2.1 粗皂素得率

由表2可知，不同溶劑三次提取粗皂素得率隨著提取次數(shù)逐漸降低，總得率依次為水＞80%乙醇＞無水乙醇，水提粗皂素總得率達(dá)到（51.45±1.26）%，而且第一次提取后粗皂素得率均可以達(dá)到總得率的84%以上，經(jīng)過兩次提取后粗皂素得率均超過總得率的95%，因此以第一次和第二次提取的皂素作為組成和性質(zhì)分析的對(duì)象。根據(jù)原料利用和能量消耗兩方面考慮，提取兩次較為合適。水和80%乙醇提取粗皂素得率高于無水乙醇，其原因?yàn)樗?0%乙醇為強(qiáng)極性萃取溶劑，根據(jù)相似相溶的原理將皂莢果皮中極性物質(zhì)更多的提取出來。對(duì)于粗皂素的提取，水是可以接觸到的“最綠色的溶劑”，它廉價(jià)易得、無毒、不易燃、對(duì)環(huán)境友好，單純從粗皂素得率來看，水優(yōu)于有機(jī)溶劑［10-11］。

表2 不同提取次數(shù)和不同溶劑提取粗皂素的得率Tab.2 The yield of crude saponin extracted with different extraction times and different solvents

2.2 粗皂素化學(xué)組成

2.2.1 蛋白質(zhì)、黃酮、總多酚和游離碳水化合物

從表3中可以看出，水提取粗皂素中所含的蛋白質(zhì)含量最高，80%乙醇和無水乙醇提取粗皂素中蛋白質(zhì)含量依次降低。蛋白質(zhì)分為水溶性蛋白和醇溶性蛋白，表明皂莢果皮中含的蛋白質(zhì)大部分為水溶性蛋白，小部分為醇溶性蛋白。隨著提取次數(shù)的增多，蛋白質(zhì)的含量大幅度降低，含量均低于1%，說明蛋白質(zhì)被大部分提取出來。在提取過程中，含有皂素的提取液會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)產(chǎn)生增溶作用，使其易于溶解［12-13］。

表3 不同提取次數(shù)和不同溶劑提取粗皂素中的蛋白質(zhì)、總多酚和游離碳水化合物含量Tab.3 The contents of protein，total polyphenols and free carbohydraten in crude saponin were extracted with different extraction times and solvents

高效液相色譜測(cè)定不同溶劑提取粗皂素中黃酮類化合物與6種黃酮標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)比結(jié)果發(fā)現(xiàn)：三種溶劑提取粗皂素不含綠原酸、根皮苷和根皮素；水和80%乙醇提取粗皂素中含有槲皮素，而無水乙醇提取粗皂素不含槲皮素；三種溶劑提取粗皂素中都含有表兒茶素。由于所測(cè)黃酮類化合物含量極低，沒有進(jìn)一步進(jìn)行準(zhǔn)確定量。

從表3中可知，不同溶劑提取粗皂素中總多酚含量依次為80%乙醇≈水＞無水乙醇，且總多酚含量隨著提取次數(shù)增加而增加。多酚類化合物的極性介于水和無水乙醇之間，一般采用無水乙醇、甲醇等有機(jī)溶劑進(jìn)行提取，由于有機(jī)溶劑的極性較小，通常加入水來調(diào)節(jié)極性以獲得更高的得率［14］。因此，80%乙醇提取的粗皂素總多酚含量是無水乙醇提取的2倍左右，多酚類化合物具有與蛋白質(zhì)、多糖、酶和金屬離子反應(yīng)的活性，并具有抗氧化和抑菌的特性［15-17］。如圖1所示，無水乙醇提取粗皂素呈黃色，顏色最淺；水提取粗皂素呈黃褐色；80%乙醇提取粗皂素顏色較深，呈現(xiàn)黑褐色。盡管多酚類化合物在皂素中的含量不高，但會(huì)對(duì)皂素的顏色造成影響，而且單寧等多酚類化合物易被多酚氧化酶和空氣氧化成醌類化合物，使皂素顏色加深［18-19］。因此，多酚類化合物和色素類物質(zhì)的脫除對(duì)皂素的純化和脫色具有重要意義。

圖1 不同溶劑提取的粗皂素照片F(xiàn)ig.1 Photos of crude saponin extracted by different solvents

如表3所示，三種溶劑提取粗皂素中的游離碳水化合物含量比較接近，由8.5%左右的纖維二糖和4%～6%葡萄糖組成，因?yàn)槔w維二糖和葡萄糖極性較大，且小分子糖的溶解度較高。在粗皂素的提取過程中，含有皂素的提取液有利于纖維二糖和葡萄糖的增溶，溶解度進(jìn)一步提升。第二次提取粗皂素中葡萄糖含量較第一次有所提高，纖維二糖含量基本保持一致，表明皂莢果皮中含有大量的游離碳水化合物。

將不同溶劑提取粗皂素中蛋白質(zhì)、總多酚和游離碳水化合物含量相加對(duì)比可得，水提取和80%乙醇提取粗皂素總含量在18%～20%之間，無水乙醇提取粗皂素總含量為16%左右，說明無水乙醇提取粗皂素中所含雜質(zhì)最少。

2.2.2 皂素組成

皂素是由一種疏水性三萜或甾體苷元（皂苷元），通過醚或酯糖苷鍵連接到一個(gè)或多個(gè)親水性糖部分［20］。皂素的水解是將皂素轉(zhuǎn)化為皂苷元的過程，這取決于水解方法和條件，酸水解是水解皂素的首選方法［21］。皂樹（Quillaja）皂素主要由三萜雙糖苷組成，其糖鏈由葡萄糖、半乳糖、木糖、鼠李糖、阿拉伯糖和葡萄糖醛酸組成，位于三萜苷元的C-3和C-28位［12］。如表4所示，三種溶劑提取粗皂素中的單糖都是由葡萄糖、木糖、鼠李糖和阿拉伯糖組成，木糖占主要，其次是葡萄糖，種類與皂樹皂素相似。4種單糖的質(zhì)量濃度大小為：木糖＞葡萄糖＞鼠李糖＞阿拉伯糖，摩爾比約為2.54：1.31：1.21：1.00，皂素上連接糖的種類和數(shù)量需進(jìn)一步通過單體分離并進(jìn)行核磁共振和質(zhì)譜綜合分析。不同溶劑第一次提取粗皂素中木糖含量為11%～14%，木糖含量大小依次為無水乙醇＞80%乙醇＞水，其他三種單糖含量基本一致。不同溶劑第二次提取粗皂素中不含有鼠李糖，且其他單糖含量有所下降，其原因可能為提取出來的多酚類物質(zhì)會(huì)提供一種酸性環(huán)境以及長(zhǎng)時(shí)間的高溫浸提，促進(jìn)了糖苷鍵的斷裂。皂苷元含量逐漸增加，表明粗皂素純度逐漸上升。

表4 不同提取次數(shù)和不同溶劑提取粗皂素中的皂素組成Tab.4 The saponin composition of crude saponin was extracted with different extraction times and different solvents

本文將粗皂素進(jìn)行酸水解之后的糖類減去粗皂素的游離糖類，與皂苷元含量相加得出的皂素含量。粗皂素得率與皂素含量相乘可以得出皂素提取率，發(fā)現(xiàn)三種溶劑的皂素第一次提取率比較接近，約為22.5%。由此得出這三種溶劑對(duì)皂素的溶出效果接近，而對(duì)于雜質(zhì)的溶出有差別，不同溶劑提取粗皂素中皂素含量依次為無水乙醇＞80%乙醇＞水，無水乙醇提取粗皂素中皂素含量最高為（58.57±1.55）%。

2.3 表面張力

如圖2所示，不同溶劑提取粗皂素的CMC在0.5～1 g/L之間，其達(dá)到CMC的表面張力的大小為無水乙醇＜80%乙醇＜水，無水乙醇提取粗皂素最低表面張力為33.0 mN/m，具有更好降低水溶液表面張力的能力。水作為極性溶劑，可以溶解水溶性的一些物質(zhì)如無機(jī)鹽等，無機(jī)鹽類物質(zhì)會(huì)使表面張力升高。乙醇溶解度界于極性與非極性溶劑之間，既能溶解極性的一些物質(zhì)如皂素、多酚等，又能溶解非極性的一些物質(zhì)如樹脂、揮發(fā)油等，少量脂肪也可被溶出。皂素水溶液中含有油脂類化合物，會(huì)對(duì)其界面性質(zhì)產(chǎn)生影響，油脂類物質(zhì)會(huì)在皂素分子之間的滲透，進(jìn)而降低其表面張力［22］。無水乙醇提取粗皂素具有良好的降低水溶液表面張力的能力，其原因可能是其純度高，能夠在界面形成更均勻致密的表面膜，又與一些油脂類化合物形成了混合吸附層，對(duì)其表面活性產(chǎn)生了促進(jìn)作用。

圖2 提取次數(shù)和不同溶劑對(duì)粗皂素水溶液表面張力影響Fig.2 Effect of extraction times and different solvents on surface tension of crude saponin aqueous solution

2.4 泡沫高度

不同溶劑第一次提取粗皂素的泡沫高度見表5。從實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，水提取粗皂素起泡性優(yōu)異，水提取粗皂素水溶液（2.5 g/L）的泡沫高度達(dá)到43 mm，而80%乙醇和無水乙醇提取粗皂素水溶液的泡沫高度分別為15 mm和10 mm，三種溶劑中水提取粗皂素的發(fā)泡能力是最好的，但泡沫穩(wěn)定性不佳。粗皂素中的蛋白質(zhì)、糖類等可能對(duì)發(fā)泡能力有一定的影響。發(fā)泡能力和泡沫穩(wěn)定性是泡沫最重要的性質(zhì)，在達(dá)到CMC之前，表面粘彈性對(duì)泡沫穩(wěn)定性有很大的改善作用，達(dá)到CMC后，膠束性能主要影響泡沫的壽命［23-25］。皂素與一些陰離子表面活性劑進(jìn)行復(fù)配，可以同時(shí)增強(qiáng)表面粘彈性和膠束性能來增強(qiáng)泡沫穩(wěn)定性，還可以對(duì)皂素進(jìn)行改性，改變其膠束的界面性質(zhì)，從而提高泡沫性能。

表5 不同溶劑第一次提取粗皂素的泡沫高度Tab.5 Foam height of crude saponin first extracted by different solvents

2.5 紅外光譜

不同溶劑第一次提取粗皂素的紅外光譜如圖3所示，其中3 414 cm-1為皂苷元和糖鏈上羥基（O-H）的伸縮振動(dòng)吸收峰；2 927 cm-1為亞甲基上烷基（CH）的伸縮振動(dòng)吸收峰；2 861 cm-1為羧基（C-H）的伸縮振動(dòng)吸收峰；1 721 cm-1為羧基（H-C=O）的伸縮振動(dòng)峰，1 614 cm-1為α，β位上不飽和羰基（O-C=O）的伸縮振動(dòng)峰，1 255 cm-1為羧基（C-OH）的伸縮振動(dòng)峰，1 062 cm-1為碳水化合物（C-OH）的伸縮振動(dòng)峰，不同溶劑第一次提取粗皂素與文獻(xiàn)中皂素的伸縮振動(dòng)峰相一致［26-28］。從圖3中可以看出隨著乙醇濃度的增加，1 721 cm-1和2 861 cm-1兩個(gè)皂苷元的特征峰峰的吸收強(qiáng)度增強(qiáng)，表明皂素含量增加，與表4中的皂素含量相一致［29-30］。

圖3 不同溶劑第一次提取粗皂素的紅外光譜Fig.3 FTIR spectrum of extracting crude saponin with different solvents for the first time

3 討論

不同溶劑提取粗皂素得率隨著提取次數(shù)逐漸降低，經(jīng)過兩次提取后粗皂素得率可以達(dá)到總得率的95%以上。無水乙醇第一次提取得到的粗皂素純度最高為（58.57±1.55）%。從粗皂素的純度、表面張力以及工業(yè)化生產(chǎn)的綜合角度來看，采用無水乙醇為溶劑進(jìn)行兩次提取是比較理想的提取工藝。

對(duì)不同溶劑提取粗皂素進(jìn)行酸水解和高效液相色譜分析表明，皂莢皂素上的糖基主要由葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和鼠李糖組成，4種單糖的質(zhì)量濃度大小為：木糖＞葡萄糖＞鼠李糖＞阿拉伯糖，摩爾比約為2.54：1.31：1.21：1.00。

粗皂素雜質(zhì)主要由蛋白質(zhì)、總多酚和游離碳水化合物組成，水和80%乙醇提取粗皂素雜質(zhì)含量在18%～20%之間，無水乙醇提取粗皂素雜質(zhì)含量為16%左右，說明無水乙醇提取粗皂素中所含雜質(zhì)最少。不同溶劑提取粗皂素水溶液的CMC為0.5～1 g/L，其到達(dá)CMC的表面張力大小為無水乙醇＜80%乙醇＜水，無水乙醇提取粗皂素表面張力最低為33.0 mN/m，具有更好降低水溶液表面張力的能力。