李金瑞，黃 晨

(東華大學(xué)，上海 201620)

交通意外、創(chuàng)傷或者腫瘤組織的切除及其他一些創(chuàng)傷疾病，均易導(dǎo)致周圍神經(jīng)缺損[1]。與中樞神經(jīng)系統(tǒng)相比，周圍神經(jīng)系統(tǒng)受傷部位周圍的微環(huán)境更加有利于軸突延伸生長并穿越缺損區(qū)域?qū)崿F(xiàn)再生功能[2]，這一重要特點(diǎn)給周圍神經(jīng)再生帶來了希望。自體移植是周圍神經(jīng)缺損治療的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但這種手術(shù)方式除供區(qū)發(fā)病率升高外還存在其他問題，如會(huì)造成新的神經(jīng)損傷，可提供移植的神經(jīng)來源有限，大小不匹配等[3]。再者，這種治療方式的效果好壞參半，自體移植術(shù)后的恢復(fù)成功率在50%左右[4]。由此看來，周圍神經(jīng)損傷的臨床治療仍是一大難題。

近年來隨著組織工程學(xué)的快速發(fā)展，人造神經(jīng)導(dǎo)管尤其是生物可降解神經(jīng)導(dǎo)管，成為了周圍神經(jīng)損傷修復(fù)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。起初，臨床上多采用具有中空結(jié)構(gòu)的導(dǎo)管修復(fù)周圍神經(jīng)缺損，但中空導(dǎo)管比表面積小，管壁薄、易塌陷，不利于神經(jīng)纖維和雪旺細(xì)胞生長[5]。再者，天然的神經(jīng)組織是由若干根神經(jīng)纖維軸取向排列而成的[6]，若神經(jīng)導(dǎo)管設(shè)計(jì)為多通道結(jié)構(gòu)則有望定向引導(dǎo)神經(jīng)纖維生長，減少神經(jīng)錯(cuò)配。但現(xiàn)有的多通道神經(jīng)導(dǎo)管多為4通道、6通道結(jié)構(gòu)，這樣的神經(jīng)導(dǎo)管通道數(shù)少(≤6個(gè))，不具仿生結(jié)構(gòu)，因此有必要設(shè)計(jì)一種新型多通道神經(jīng)導(dǎo)管支架，最大程度模擬天然神經(jīng)結(jié)構(gòu)，以發(fā)揮更好的神經(jīng)修復(fù)效果。

目前神經(jīng)導(dǎo)管的制備方法主要有相分離、靜電紡絲、冷凍干燥、3D打印等。對(duì)于多通道神經(jīng)導(dǎo)管來說，冷凍干燥法是一種簡(jiǎn)單、高效的制備方法。所謂冷凍干燥法，其原理是將溶液冷凍成固體，后利用升華的方法去除溶劑，剩余的溶質(zhì)在模具的固定下直接成型。在該制備方法中，模具的設(shè)計(jì)是否具有可行性直接決定著多通道神經(jīng)導(dǎo)管能否制備成功。目前，多通道神經(jīng)導(dǎo)管模具的通道基材多采用剛性物質(zhì)(如鋼針)，但此種基材在去除時(shí)可能會(huì)損傷導(dǎo)管通道結(jié)構(gòu)，因此，尋找一種不損傷材料結(jié)構(gòu)的通道基材就成為了多通道神經(jīng)導(dǎo)管模具設(shè)計(jì)的新方向。

水溶性維綸是以石油乙烯或電石乙炔為原料制備而成，由于其分子結(jié)構(gòu)每個(gè)鏈上均有一個(gè)羥基，極易溶于水。由于水溶性維綸具有環(huán)保、無毒以及易溶于水等特點(diǎn)，因此在紡織領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，如細(xì)號(hào)棉麻紗的開發(fā)、非織造衛(wèi)生材料的加工等[7]，但是未有學(xué)者研究過其在多通道神經(jīng)導(dǎo)管模具上的應(yīng)用。

針對(duì)多通道神經(jīng)導(dǎo)管的通道數(shù)少、傳統(tǒng)剛性模具損傷神經(jīng)導(dǎo)管通道結(jié)構(gòu)的問題，本研究以紡織柔性材料(水溶性維綸紗線)為通道基材，自主設(shè)計(jì)了一種多通道神經(jīng)導(dǎo)管模具，并以生物相容性良好的聚己內(nèi)酯(PCL)與殼聚糖(CS)為原料，探究了該模具在制備神經(jīng)導(dǎo)管支架材料方面的應(yīng)用。

1 試驗(yàn)部分

1.1 試驗(yàn)原料及儀器

原料：水溶性維綸紗線(單紗細(xì)度32 tex，3股紗)，錦繡美紡織品；PCL(分子量，80000)，Sigma-Aldrich；CS(低粘度，脫乙酰度 >95%)，阿拉??；冰醋酸(>99.5%)，泰坦；去離子水，東華大學(xué)自制。

儀器：SHJ-6A型磁力攪拌水浴鍋，常州金壇良友儀器有限公司；FD-1A-50型冷凍干燥機(jī)，上海比朗儀器制造有限公司；DHG-9030型電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；DW-86L80型超低溫冰箱，浙江捷盛低溫設(shè)備有限公司。

1.2 神經(jīng)導(dǎo)管的制備

1.2.1 維綸紗線多通道神經(jīng)導(dǎo)管模具的設(shè)計(jì)

該多通道神經(jīng)導(dǎo)管模具由一個(gè)正方體框架、數(shù)根橡皮筋、可溶性維綸紗線以及一個(gè)中空的塑料管構(gòu)成，具體制作步驟如圖1所示：利用正方體框架與橡皮筋搭建通路；按照一定穿線規(guī)則將維綸紗線穿入橡皮筋通路，并保證維綸紗線之間無相互交錯(cuò)；將橡皮筋向中心收攏，使維綸紗線軸向平行、緊密排列；維綸紗線外套入空心管，多通道神經(jīng)導(dǎo)管模具即制作完成。

圖1 多通道神經(jīng)導(dǎo)管模具制作步驟

1.2.2 維綸紗線模具用于多通道神經(jīng)導(dǎo)管的制備

PCL/CS溶液的配制：以濃度90%的乙酸為溶劑，配制濃度為16 wt.%的PCL溶液，常溫下攪拌6 h至PCL完全溶解，后按照PCL∶CS=9∶1的質(zhì)量比向溶液中加入CS，再次攪拌6 h至溶液混合均勻，得到PCL/CS共混溶液。

導(dǎo)管成型：用5 mL針筒(配16 G針頭)吸取PCL/CS共混溶液注入維綸紗線多通道模具中，放入-80℃超低溫冰箱中冷凍過夜，再于冷凍干燥機(jī)(凍干參數(shù)：冷阱溫度-50℃，真空度10 Pa)中干燥12 h。

維綸紗線的溶解：將凍干后的神經(jīng)導(dǎo)管放入40℃恒溫水浴中以溶解通道基材(水溶性維綸紗線)，多次洗滌后烘干得到PCL/CS多通道神經(jīng)導(dǎo)管。

同樣的方法制備純PCL多通道神經(jīng)導(dǎo)管，探究維綸模具在制備純PCL多通道神經(jīng)導(dǎo)管的可行性，并將其作為PCL/CS多通道神經(jīng)導(dǎo)管性能測(cè)試的對(duì)照研究對(duì)象。

1.3 性能測(cè)試及表征

1.3.1 維綸紗線的基本性能測(cè)試

拉伸性能測(cè)試：參照標(biāo)準(zhǔn)ASTM D2256，采用YG026MB型多功能強(qiáng)力儀對(duì)紗線拉伸性能進(jìn)行測(cè)試。測(cè)試參數(shù)：隔距250 mm，拉伸速度250 mm/min。

溶解性能測(cè)試：裁剪維綸紗線5 cm，將其自然伸直放入20 ℃去離子水中，相機(jī)拍攝紗線溶解狀況，并記錄相應(yīng)時(shí)間。

1.3.2 導(dǎo)管的掃描電子顯微鏡觀測(cè)

制備的神經(jīng)導(dǎo)管經(jīng)噴金后，采用加速電壓設(shè)置為5 kV的SU8010型場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡觀測(cè)樣品橫截面及縱截面，分析不同神經(jīng)導(dǎo)管的通道結(jié)構(gòu)特征。

1.3.3 導(dǎo)管的紅外光譜分析

采用Nicolet 6700型傅里葉紅外光譜儀對(duì)樣品進(jìn)行紅外光譜分析，測(cè)試方法為全反射(ATR)，測(cè)試范圍500 cm-1～4000 cm-1，分辨率0.09 cm-1。

1.3.4 導(dǎo)管的X射線衍射分析

采用D/max-2550 PC 18KW轉(zhuǎn)靶X射線衍射儀獲得材料的特征峰及結(jié)晶度。測(cè)試條件為：X射線發(fā)生器的電壓40 kV，電流150 mA，測(cè)試角度2θ為5°～60°，掃描速度6°/min。

1.3.5 導(dǎo)管的水接觸角測(cè)試

用雙面膠將材料固定在玻璃片上，采用OCA15EC型接觸角測(cè)量儀測(cè)定材料親疏水特性(疏水材料采用液滴法測(cè)試，親水材料采用氣泡法測(cè)試)，每種樣品重復(fù)測(cè)量5次，取接觸角大小的平均值。

1.3.6 導(dǎo)管的力學(xué)性能測(cè)試

采用YGB026-500型醫(yī)用紡織品多功能強(qiáng)力儀測(cè)試神經(jīng)導(dǎo)管的拉伸性能，測(cè)試方法參照文獻(xiàn)[8]，拉伸速度10 mm/min，隔距20 mm，每個(gè)試樣在干態(tài)和濕態(tài)下各重復(fù)測(cè)試5次取平均值，根據(jù)樣品有效拉伸面積計(jì)算其應(yīng)力，繪制拉伸應(yīng)力-應(yīng)變曲線。導(dǎo)管彎曲性能測(cè)試方法如下：測(cè)試者給與導(dǎo)管一個(gè)彎曲的力，用數(shù)碼相機(jī)拍照，記錄各導(dǎo)管的彎曲狀態(tài)。

2 結(jié)果與討論

2.1 維綸紗線的基本性能

根據(jù)測(cè)試結(jié)果計(jì)算紗線的斷裂強(qiáng)力與斷裂伸長率，分別為26.96 N±1.69 N、28.69%±1.36%，可知該維綸紗線斷裂強(qiáng)力較大且斷裂伸長率適中，顯示出優(yōu)異的抗拉伸斷裂能力，可保證紗線在制備多通道神經(jīng)導(dǎo)管模具的過程中不會(huì)出現(xiàn)斷裂現(xiàn)象，滿足制備模具的基本力學(xué)要求。

圖2顯示了維綸紗線的溶解過程，根據(jù)拍攝的照片及記錄的時(shí)間可知，維綸紗線在20 ℃去離子水中即可快速溶解，這一重要性能為神經(jīng)導(dǎo)管多通道結(jié)構(gòu)的形成奠定了基礎(chǔ)。

圖2 維綸紗線在去離子水中快速溶解

2.2 神經(jīng)導(dǎo)管的形貌圖

基于水溶性維綸紗線模具制備的多通道神經(jīng)導(dǎo)管的形貌圖如圖3所示，兩種多通道神經(jīng)導(dǎo)管的外徑約為2 mm，內(nèi)部含有排列整齊的16個(gè)貫通孔道，每個(gè)通道的直徑為0.4 mm；從圖3可知，PCL/CS導(dǎo)管的通道形狀更為清晰、規(guī)整，純PCL導(dǎo)管形態(tài)則稍差，這是因?yàn)镻CL/CS混合材料具備更加優(yōu)良的抗擠壓變形能力。采用維綸紗線模具可成功制備出通道數(shù)多、通道形態(tài)良好的多通道神經(jīng)導(dǎo)管。

圖3 (a)PCL/CS神經(jīng)導(dǎo)管及

2.3 紅外光譜分析

由圖4a可知，試驗(yàn)制備的PCL多通道神經(jīng)導(dǎo)管與原料PCL的紅外光譜譜形相同，說明該制備方法不損傷原材料的結(jié)構(gòu)、可保有原材料的性質(zhì)。對(duì)比純PCL神經(jīng)導(dǎo)管與PCL/CS神經(jīng)導(dǎo)管的紅外光譜圖可知，PCL/CS神經(jīng)導(dǎo)管的紅外譜圖上出現(xiàn)了原料CS的特征峰[9]，其中3100 cm-1～3600 cm-1處的寬吸收帶為-OH、-NH2伸縮振動(dòng)締合峰；2863 cm-1處為C—H拉伸振動(dòng)峰；1652 cm-1處為酰胺Ⅰ帶的(C=O)伸縮振動(dòng)峰；1040 cm-1處是CS的β糖苷鍵特征吸收峰。說明PCL/CS神經(jīng)導(dǎo)管內(nèi)引入了CS特有的氨基、羥基等親水基團(tuán)，有望提高材料的親水性。此外，兩種多通道神經(jīng)導(dǎo)管的紅外光譜圖上均未出現(xiàn)除PCL、CS以外的特征峰，說明制備過程中未引入其他雜質(zhì)，維綸紗線可經(jīng)水洗被去除。

圖4 材料的(a)紅外光譜圖及(b)X射線衍射圖

2.4 X射線衍射分析

PCL在生物體內(nèi)降解時(shí)間較長，完全降解需2年以上，因此將降解性能優(yōu)異的CS與之共混，以期降低降解時(shí)間，避免支架材料降解過慢需二次手術(shù)取出的問題。由X射線衍射圖(圖4b)可知，純PCL顆粒與制備的PCL神經(jīng)導(dǎo)管在2θ=21°、23°處均有兩個(gè)峰形尖銳的特征衍射峰，為PCL的鏈段結(jié)晶峰[10]，這說明制備神經(jīng)導(dǎo)管過程中未破壞PCL的原有結(jié)構(gòu)。純CS顆粒在2θ=20°處有一個(gè)寬且彌散的特征衍射峰，說明CS的結(jié)晶度較低，而在PCL/CS神經(jīng)導(dǎo)管中，21°、23°處的衍射峰稍有變?nèi)酰f明CS與PCL的共混在一定程度上降低了PCL/CS神經(jīng)導(dǎo)管的結(jié)晶度，進(jìn)而提高導(dǎo)管的降解速率。材料的結(jié)晶度測(cè)試結(jié)果如表1所示，與XRD的結(jié)果一致，進(jìn)一步說明了CS的加入對(duì)PCL/CS神經(jīng)導(dǎo)管具有降低結(jié)晶度的作用。

表1 原料及神經(jīng)導(dǎo)管的結(jié)晶度

2.5 親水性能

通過測(cè)試接觸角的大小(CA)來評(píng)價(jià)材料的親水性，一般認(rèn)為，接觸角大于90°表現(xiàn)為疏水性，接觸角小于90°表現(xiàn)為親水性。由神經(jīng)導(dǎo)管的水接觸角測(cè)試結(jié)果可知，PCL神經(jīng)導(dǎo)管是疏水的，接觸角大小為124.0±3.6°(圖5a)，測(cè)試過程中接觸角大小保持不變；與之相對(duì)，PCL/CS神經(jīng)導(dǎo)管是親水的，在3 s內(nèi)接觸角從69.5°降低至0(圖5b)，即測(cè)試液滴可快速被材料吸收，采用氣泡法進(jìn)一步表征PCL/CS神經(jīng)導(dǎo)管的接觸角大小，為68.4°±2.3°。這些結(jié)果表明，在PCL中加入CS有助于提高PCL/CS神經(jīng)導(dǎo)管的親水性。

圖5 (a)PCL神經(jīng)導(dǎo)管及(b)PCL/CS神經(jīng)導(dǎo)管的接觸角測(cè)試

2.6 力學(xué)性能

不同神經(jīng)導(dǎo)管的干態(tài)應(yīng)力-應(yīng)變曲線如圖6a所示，PCL/CS多通道神經(jīng)導(dǎo)管的最大拉伸應(yīng)力為4.4 MPa，高于PCL多通道神經(jīng)導(dǎo)管(2.6 MPa)。這是因?yàn)镃S分子內(nèi)有強(qiáng)氫鍵作用，分子剛性大[11]，致使PCL/CS神經(jīng)導(dǎo)管的斷裂應(yīng)力和初始模量增大。從神經(jīng)導(dǎo)管的濕態(tài)應(yīng)力應(yīng)變曲線(圖6b)可以看出，各導(dǎo)管的濕態(tài)力學(xué)性能規(guī)律與干態(tài)保持一致，但濕態(tài)導(dǎo)管的斷裂應(yīng)力降低、斷裂應(yīng)變有所增大。這是因?yàn)椴牧辖?jīng)去離子水浸潤后，內(nèi)部孔隙被水分子填充，從而降低了材料分子間作用力和滑移阻力，進(jìn)而表現(xiàn)為拉伸時(shí)所需的應(yīng)力降低，同時(shí)材料拉伸斷裂前的滑移量也增加。圖6c顯示的是兩種多通道神經(jīng)導(dǎo)管的彎曲性能，由于其內(nèi)部多通道結(jié)構(gòu)的支撐，表現(xiàn)出良好的彎曲性能，柔韌性較好，能夠滿足神經(jīng)導(dǎo)管植入動(dòng)物體內(nèi)后的運(yùn)動(dòng)需求。

圖6 神經(jīng)導(dǎo)管的(a)干態(tài)應(yīng)力-應(yīng)變曲線、(b)濕態(tài)應(yīng)力-應(yīng)變曲線及(c)彎曲性能測(cè)試

3 結(jié)語

在本研究中，利用自主設(shè)計(jì)的維綸紗線模具，結(jié)合冷凍干燥法，成功制備了PCL/CS與PCL多通道神經(jīng)導(dǎo)管，通過一系列表征手段，得到了如下結(jié)論：

分析水溶性維綸紗線的基本性能，發(fā)現(xiàn)其具有良好的力學(xué)性能以及快速溶于水的能力，可將其作為通道基材，設(shè)計(jì)一種新型多通道神經(jīng)導(dǎo)管模具，該模具的優(yōu)點(diǎn)在于：在2 mm直徑內(nèi)可形成16個(gè)通道，通道數(shù)較多，且通道結(jié)構(gòu)完整、無損傷。

基于維綸紗線模具可成功制備PCL/CS及PCL多通道神經(jīng)導(dǎo)管，從神經(jīng)導(dǎo)管的形貌及紅外測(cè)試結(jié)果可知，水溶性維綸可在后續(xù)水洗過程中被去除，形成多通道結(jié)構(gòu)的同時(shí)不影響導(dǎo)管性質(zhì)。

導(dǎo)管的形態(tài)及其他理化性能結(jié)果表明，相較于PCL多通道神經(jīng)導(dǎo)管，PCL/CS多通道神經(jīng)導(dǎo)管具有更優(yōu)良的通道形態(tài)、親水性以及力學(xué)性能，有望應(yīng)用在周圍神經(jīng)缺損修復(fù)領(lǐng)域。