劉穎穎，盧艷波，楊小雁，馬忠瑪，毛銀，周勝虎，鄧禹*

1(江南大學(xué)，糧食發(fā)酵工藝及技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫，214122)2(山東省油脂油料精深加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東渤海實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司，山東 濱州，256500)

植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)廣泛存在于動(dòng)物、植物、人類體表和體內(nèi)，以及眾多發(fā)酵食品等自然和人工環(huán)境中。植物乳桿菌具有較強(qiáng)的糖代謝和產(chǎn)酸能力，擁有大量的碳水化合物水解酶和糖基轉(zhuǎn)移酶等酶系[1]，因此可以利用糖類等碳源產(chǎn)生大量乳酸、乙酸和雙乙酰等，這些代謝產(chǎn)物對(duì)病原體和致病菌具有顯著的抑制作用[2]。此外，植物乳桿菌利用氨基酸可以合成眾多的風(fēng)味化合物，主要依賴于氨基酸分解代謝途徑中氨基轉(zhuǎn)移酶和脫羧酶。植物乳桿菌因其豐富的益生代謝產(chǎn)物和酶系而常被廣泛應(yīng)用于食品發(fā)酵、動(dòng)物飼料、工業(yè)生產(chǎn)和醫(yī)療保健等領(lǐng)域。

自2001年第1株乳酸菌(Lactococcuslactissubsp.lactisIL1403)全基因組測(cè)序完成，乳酸菌基因組測(cè)序便進(jìn)入了新時(shí)代[3]。多種植物乳桿菌全基因組信息得到破譯并進(jìn)行了功能基因解析[1]。ZHANG等[4]使用全基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)等技術(shù)，從植物乳桿菌P-8中篩選出大量與葡萄糖代謝相關(guān)的差異表達(dá)蛋白，并預(yù)測(cè)了其特異性功能。結(jié)果表明菌株主要通過(guò)減少葡萄糖消耗和增加葡萄糖生成，從而積累或消耗氨基酸、改變細(xì)胞膜等多種生存機(jī)制來(lái)應(yīng)對(duì)葡萄糖饑餓反應(yīng)。目前全球范圍內(nèi)被廣泛用于研究的鼠李糖乳桿菌LGG、嗜酸乳桿菌NCFM和干酪乳桿菌代田株等都經(jīng)過(guò)了多種益生特性和基因組的研究[5-6]。然而，國(guó)內(nèi)目前對(duì)于植物乳桿菌資源的綜合開(kāi)發(fā)和利用大多還集中在發(fā)酵菌株的篩選及菌株自身發(fā)酵工藝優(yōu)化等領(lǐng)域，對(duì)于發(fā)酵菌種的功能特性與優(yōu)異模式菌株的關(guān)聯(lián)研究還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不足。因此，通過(guò)與模式菌株的基因序列比對(duì)和基因組結(jié)構(gòu)分析，更深入地了解植物乳桿菌生理特性和表型具有重要意義。

目前，植物乳桿菌WCFS1是測(cè)序較早、遺傳信息較全面的乳桿菌菌株，具有代謝多樣性，生長(zhǎng)速度快，糖攝取率高等特點(diǎn)，常被作為模式菌株進(jìn)行研究[7-8]。本團(tuán)隊(duì)前期篩選獲得了1株植物乳桿菌DY6，具有生長(zhǎng)速率快、產(chǎn)酸能力強(qiáng)、代謝產(chǎn)物豐富等特點(diǎn)，具有成為乳桿菌模式菌株的潛質(zhì)，但是缺少遺傳信息。因此，本研究首先對(duì)比了植物乳桿菌WCFS1和DY6的生理特性和益生功能，隨后通過(guò)基因組重測(cè)序和比較基因組技術(shù)，系統(tǒng)分析了植物乳桿菌WCFS1和DY6的遺傳差異，挖掘重要性狀相關(guān)的功能基因，對(duì)以植物乳桿菌DY6為模式菌株的系統(tǒng)生物學(xué)以及代謝工程研究和應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌株

植物乳桿菌DY6為實(shí)驗(yàn)室保藏，植物乳桿菌WCFS1購(gòu)自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院，大腸桿菌(ATCC25922)和沙門氏菌(ATCC14028)均購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏中心。

1.1.2 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20，胰蛋白胨10，牛肉膏8，酵母浸出粉4，磷酸氫二鉀2，檸檬酸三銨2，醋酸鈉5，七水硫酸鎂0.58，四水硫酸錳0.25，吐溫80 1 mL，pH 6.3～6.5。發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：碳源(分別選用蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖)20，胰蛋白胨10，牛肉膏8，酵母浸出粉4，磷酸氫二鉀2，檸檬酸三銨2，醋酸鈉5，七水硫酸鎂 0.58，四水硫酸錳0.25，吐溫80 1 mL，pH 6.3～6.5。所有培養(yǎng)基均經(jīng)過(guò)115 ℃、30 min滅菌后使用，其中固體培養(yǎng)基需額外添加2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的瓊脂粉后進(jìn)行滅菌。

1.1.3 儀器和試劑

UV-1800分光光度計(jì)，日本Shimadzu公司；CFX96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，美國(guó)Bio-Rad公司；1260Ⅱ高效液相色譜，美國(guó)安捷倫公司；Master-S15實(shí)驗(yàn)室純水系統(tǒng)，上海和泰儀器有限公司等。

葡萄糖、胰蛋白胨、牛肉膏、醋酸鈉、吐溫80、二甲苯、乙酸乙酯、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、氯化鈉、三氯乙酸、三乙胺、甲醇、乙腈、胃蛋白酶、豬膽鹽、胰蛋白酶等，國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司。

1.2 乳酸菌生理學(xué)特性測(cè)定

1.2.1 菌株培養(yǎng)和菌懸液制備

挑取單菌落接種在MRS液體培養(yǎng)基中，在37 ℃、250 r/min條件下培養(yǎng)12～16 h，獲得種子液。將種子液按照2%的接種量轉(zhuǎn)接到裝有50 mL液體培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中，在37 ℃、250 r/min條件下培養(yǎng)48 h。取上述24 h發(fā)酵液，在4 ℃、8 000 r/min條件下離心5 min，將菌體用無(wú)菌生理鹽水洗滌2次后重懸，調(diào)至OD600值為0.8～0.9，獲得菌懸液。本研究所有檢測(cè)均進(jìn)行了3次重復(fù)試驗(yàn)，誤差線代表3次實(shí)驗(yàn)的方差。

1.2.2 代謝產(chǎn)物檢測(cè)

發(fā)酵液在12 000 r/min離心10 min后取上清液與10%的三氯乙酸等體積稀釋，放置1 h后經(jīng)雙層濾紙過(guò)濾，濾液在15 000 r/min離心30 min后采用Agilent Technologies 1260 Infinity高效液相色譜測(cè)定代謝產(chǎn)物。檢測(cè)乳酸和乙酸等有機(jī)酸時(shí)色譜柱為BIO-RAD Aminex HPX-87H Column 300 mm×7.8 mm，0.6 mL/min的5 mmol/L H2SO4洗脫，柱溫為35 ℃，采用示差檢測(cè)器。檢測(cè)氨基酸時(shí)采用Agilent Hypersil ODS柱40 ℃梯度洗脫，流動(dòng)相A為27.6 mmol/L醋酸鈉-三乙胺-四氫呋喃(體積比為500∶0.11∶2.5)，流動(dòng)相B為80.9 mmol/L醋酸鈉-甲醇-乙腈(體積比為1∶2∶2)，流動(dòng)相pH為7.2。洗脫程序：0 min，8% B；17 min，50% B；20.1 min，100% B；24 min，0% B；紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)為338 nm，脯氨酸以262 nm檢測(cè)；氨基酸含量以1 nmol/μL的21種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品定量。

1.2.3 生理特性測(cè)定

植物乳桿菌的酸和膽鹽的耐受性測(cè)定參考王祎然等[9]的方法。將活化后的菌液按2%接種量分別接種于pH為2.0、2.5和3.0的MRS液體培養(yǎng)基中，對(duì)照組是pH為6.0的MRS培養(yǎng)基，37 ℃靜置培養(yǎng)4 h，取0 h和4 h樣進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)，計(jì)算不同酸性條件下的存活率(公式1)。將活化后的菌液按2%接種量分別接種于含0.1%、0.2%、0.4%、0.6%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))豬膽鹽的MRS液體培養(yǎng)基中，以不加豬膽鹽的MRS培養(yǎng)基為對(duì)照，37 ℃培養(yǎng)4 h，取0 h和4 h樣品進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)，計(jì)算不同豬膽鹽含量條件下的存活率(同公式1)。取1 mol/L 鹽酸溶液20 mL，用氫氧化鈉溶液將其pH調(diào)至3，加入胃蛋白酶使其終質(zhì)量濃度為1 g/100mL，0.22 μm微孔濾膜除菌制備模擬胃液[10]。500 mL水溶解6.8 g磷酸二氫鉀，用氫氧化鈉溶液調(diào)pH至6.8，加入10 g胰蛋白酶后定容至1 000 mL，0.22 μm 微孔濾膜除菌制備模擬腸液[10]。將0.5 mL菌懸液加至4.5 mL模擬胃液或腸液[9]中37 ℃孵育3 h，利用平板計(jì)數(shù)法分別測(cè)定0 h及3 h時(shí)的菌數(shù)，以菌株的存活率評(píng)估植物乳桿菌對(duì)模擬胃腸液的耐受能力，計(jì)算如公式(1)所示。植物乳桿菌的自聚集和共聚集能力測(cè)定參考COLLADO等[11]的方法。將1 mL菌懸液旋渦振蕩10 s后37 ℃孵育5 h，輕取200 μL上層懸液，測(cè)量OD600值(A2)，A1為初始菌懸液的吸光值，自聚集能力計(jì)算如公式(2)所示。將等體積的乳桿菌與大腸桿菌和沙門氏菌菌懸液分別混合，渦旋振蕩10 s后37 ℃孵育5 h，輕取200 μL上層懸液，測(cè)量OD600值(A5)，A3和A4分別為受試菌與致病菌菌懸液?jiǎn)为?dú)處理5 h的吸光值，共聚集能力計(jì)算如公式(3)所示。參照BURNS等[12]的方法，并稍作改動(dòng)，取2 mL菌懸液于3支5 mL離心管中，依次加入2 mL二甲苯和乙酸乙酯，渦旋振蕩2 min后在通風(fēng)廚中靜置30 min，水相的吸光值(A2)和初始菌懸液吸光值(A1)計(jì)算如公式(4)所示：

(1)

(2)

(3)

(4)

1.3 基因組DNA重測(cè)序

菌株在37 ℃、250 r/min培養(yǎng)12 h后，采用磁珠法進(jìn)行基因組DNA提取，用于基因組文庫(kù)構(gòu)建。對(duì)測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估后，使用BWA將樣本有效數(shù)據(jù)比對(duì)到參考基因組上，利用GATK的Haplotype Caller分析樣品和參考基因組之間的基因型差異，并使用SnpEff軟件根據(jù)參考基因組的注釋信息對(duì)突變進(jìn)行注釋和分析。

1.4 重要功能基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR(real time quantitative polymerase chain reaction，RT-PCR)驗(yàn)證

使用RNApure Bacteria Kit試劑盒提取mRNA，去除基因組DNA、反轉(zhuǎn)錄和qRT-PCR用到的試劑盒分別是HiFiScript gDNA Removal cDNA Synthesis Kit和UltraSYBR Mixture，購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司。以乳桿菌cDNA為模板，16S作為內(nèi)參基因，乙酸激酶(ack1)、丙酮酸羧化酶(pycA)、L-乳酸脫氫酶(ldhl2)、磷酸果糖激酶(fruK)、磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶(pta)、丙酮酸脫氫酶系E1(pdhA)和丙酮酸脫氫酶系E2(pdhC)為目標(biāo)基因，根據(jù)2-ΔΔct方法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量[13]。所有的引物由金唯智生物技術(shù)有限公司合成，引物序列見(jiàn)表1。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物

2 結(jié)果與分析

2.1 體外益生特性評(píng)價(jià)

植物乳桿菌為宿主提供有益效果的前提是通過(guò)胃的酸性環(huán)境和腸液中的高膽汁鹽環(huán)境，以活菌狀態(tài)達(dá)到腸道。研究表明菌株的耐酸和膽鹽的脅迫主要與谷氨酸脫羧酶系統(tǒng)、氨的產(chǎn)生和表層蛋白的影響等相關(guān)[14]。已有研究報(bào)道WCFS1具有較好的膽鹽耐受力，在體外模擬胃腸液中表現(xiàn)出較高的存活率，以及在健康志愿者體內(nèi)都顯示出較高的存活能力[15]。隨著pH的降低，WCFS1和DY6的存活率快速下降(圖1-a)，在不同酸性環(huán)境下兩株菌的存活率無(wú)顯著差異，說(shuō)明DY6與WCFS1的耐酸性相當(dāng)；在不同質(zhì)量濃度的豬膽鹽脅迫4 h后，DY6菌株存活率均略高于WCFS1，在0.6%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))豬膽鹽條件下依然能保持30%以上的存活率(圖1-b)。通過(guò)人工配制胃液及腸液模擬益生菌進(jìn)入人體后在腸胃中所處的消化環(huán)境，研究發(fā)現(xiàn)DY6在模擬胃液和腸液中的存活率均高于WCFS1，表明DY6對(duì)于耐受胃腸環(huán)境同樣具有較強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)地位。

胃的低pH環(huán)境和胃蛋白酶的共同作用也是抗菌的有效屏障，體內(nèi)乳酸菌通過(guò)與病原菌共聚，使其在密切相互作用中釋放出抗病原體的物質(zhì)，進(jìn)一步防止腸道病原體黏附和腸道定殖，通常與細(xì)胞表面黏附蛋白有關(guān)[16]。本研究發(fā)現(xiàn)DY6的自聚集能力是WCFS1的1.58倍(圖1-d)，DY6和WCFS1分別與大腸桿菌和沙門氏菌的共聚集能力略高于DY6(圖1-e)，表明DY6在抑制病原菌的生長(zhǎng)同樣具有優(yōu)勢(shì)。乳酸菌的疏水性與細(xì)胞表面黏附性存在正相關(guān)，本研究中采用二甲苯和乙酸乙酯檢測(cè)表面疏水性[14]。與二甲苯相比，兩株菌對(duì)乙酸乙酯的疏水性最佳(圖1-f)；與WCFS1相比，DY6的疏水性能較差，因此WCFS1可能具有更佳的腸道上皮細(xì)胞黏附能力。

2.2 DY6和WCFS1的發(fā)酵特性評(píng)價(jià)

2.2.1 DY6和WCFS1的發(fā)酵特性

植物乳桿菌在利用葡萄糖發(fā)酵過(guò)程中的關(guān)鍵作用是產(chǎn)生具有防腐作用的乳酸和乙酸等，這些有機(jī)酸的積累導(dǎo)致pH值急劇下降，是抵御病原體的主要機(jī)制[2]。WCFS1基因組編碼的糖酵解和磷酸酮酶途徑的全部酶都屬于潛在的高表達(dá)基因類型，并且丙酮酸的代謝能力更強(qiáng)，產(chǎn)生較多的其他代謝產(chǎn)物如乳酸、乙酸和甲酸等[17]。圖2-a和圖2-b表示DY6和WCFS1以葡萄糖為唯一碳源的生長(zhǎng)和代謝差異情況，整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中DY6的生長(zhǎng)性能優(yōu)于WCFS1，發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)OD600值相差25.27%。由于高數(shù)量和高活性的植物乳桿菌活菌是定植胃腸道發(fā)揮益生作用的前提，而DY6擁有優(yōu)異的生長(zhǎng)活性使菌株能夠更多的抵達(dá)腸道，進(jìn)而才能通過(guò)合成抗菌物質(zhì)和與其他菌群和宿主互作等方式維持腸道健康。植物乳桿菌產(chǎn)酸能力同樣是衡量菌株發(fā)酵活性的重要指標(biāo)，DY6的乳酸產(chǎn)量比WCFS1高17.5%，并且發(fā)酵過(guò)程中DY6的乳酸糖酸轉(zhuǎn)化率比WCFS1更高。其中在8～12 h時(shí)，DY6的糖酸轉(zhuǎn)化率超過(guò)100%，表明菌株可以利用其他化合物轉(zhuǎn)化為乳酸。乳酸產(chǎn)量明顯增加的直接效應(yīng)是周圍環(huán)境的pH值的降低，進(jìn)而能夠抑制病原菌生長(zhǎng)。DY6在以葡萄糖為碳源時(shí)的優(yōu)異產(chǎn)乳酸性能可能與乳酸脫氫酶調(diào)控的乳酸合成途徑有直接關(guān)系。此外，兩株菌產(chǎn)生少量乙酸可能是由于葡萄糖限制導(dǎo)致丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙酸，WCFS1發(fā)酵終點(diǎn)的代謝產(chǎn)物中乙酸的產(chǎn)量比DY6高了21.84%，推測(cè)是WCFS1的其余碳源主要流向乙酸，并導(dǎo)致乳酸的產(chǎn)量低于DY6，或者DY6代謝中產(chǎn)生的乙酸被機(jī)體消耗或合成其他物質(zhì)。植物乳桿菌發(fā)酵產(chǎn)生的其他有機(jī)酸除了降低pH的作用外，在改善心血管代謝性疾病、維持健康血壓等方面也具有積極作用。DY6代謝產(chǎn)物中還有少量的其他有機(jī)酸如蘋果酸、草酰乙酸和丁酸，分別比WCFS1高了5.95%、69.54%和19.31%，丙酸比WCFS1低了7.87%。總之，DY6從整體上表現(xiàn)出具有較強(qiáng)的生長(zhǎng)活性和產(chǎn)酸能力。然而，為最大限度的開(kāi)發(fā)和利用菌株，還需要從基因?qū)用鎸?duì)DY6的生長(zhǎng)和發(fā)酵代謝特性相關(guān)機(jī)制做深入的研究。

2.2.2 DY6和WCFS1的碳源利用研究

乳酸菌屬于化能異養(yǎng)型微生物，缺乏對(duì)許多有機(jī)化合物的合成能力，菌株能否在不同環(huán)境下進(jìn)行代謝活動(dòng)很大程度上取決于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的供給，因而不同碳源的培養(yǎng)基是影響菌株代謝的重要因素之一[18]。研究表明植物乳桿菌WCFS1可以有效代謝多種碳水化合物，并產(chǎn)生大量乳酸，在制備低糖酸奶等應(yīng)用中顯示出巨大潛力[8]。為研究植物乳桿菌DY6對(duì)不同碳源的利用情況，以蔗糖(圖2-c)、半乳糖(圖2-d)、果糖(圖2-e)和麥芽糖(圖2-f)作為唯一碳源分別培養(yǎng)DY6和WCFS1。發(fā)現(xiàn)表型差異最明顯的是果糖為碳源時(shí)，兩株菌的乳酸產(chǎn)量和OD600值分別相差3 387.22%和69.22%，表明DY6具有優(yōu)異的果糖代謝能力，能夠?yàn)榫甑纳L(zhǎng)提供能量。利用果糖為碳源時(shí)，除有機(jī)酸外還能產(chǎn)生其他高附加值產(chǎn)物，如甘露醇和山梨醇等。DY6在果糖代謝中碳源主要用于乳酸的生產(chǎn)，推測(cè)催化果糖磷酸化的果糖激酶對(duì)調(diào)控DY6的生長(zhǎng)和代謝起著重要作用。半乳糖代謝中兩株菌的乳酸產(chǎn)量和OD600值分別相差46.98%和1.41%，推測(cè)半乳糖進(jìn)入Leloir途徑后碳源主要用于乳酸的生產(chǎn)。麥芽糖和蔗糖代謝中DY6的乳酸產(chǎn)量和生長(zhǎng)情況略高于WCFS1。DY6代謝產(chǎn)物中乙酸、檸檬酸、蘋果酸等其他有機(jī)酸含量基本都低于WCFS1，推測(cè)DY6代謝中碳源主要用于菌株的生長(zhǎng)和乳酸的產(chǎn)生?；贒Y6在利用碳水化合物方面表現(xiàn)出更高的效率和更強(qiáng)的能力，表明菌株在富含果糖和半乳糖的碳水化合物的環(huán)境中的適應(yīng)能力更強(qiáng)。

2.2.3 DY6和WCFS1的氨基酸代謝差異

富含氨基酸的有機(jī)氮源具有調(diào)節(jié)胞內(nèi)pH、提供營(yíng)養(yǎng)成分的合成前體和產(chǎn)生代謝能量或氧化還原能力等多種作用，因此氨基酸的合成和分解直接影響菌體的耐酸性能、生長(zhǎng)代謝和發(fā)酵產(chǎn)品特定風(fēng)味的形成[19]。與WCFS1相比，DY6的精氨酸(1 036.03%)和天冬氨酸(488.83%)的需求量最為顯著(圖2-g)。精氨酸分解代謝途徑主要是精氨酸脫氨酶途徑(arginine deiminase pathway,ADI)，由精氨酸到鳥(niǎo)氨酸、氨氣和二氧化碳的轉(zhuǎn)化，同時(shí)產(chǎn)生ATP。當(dāng)產(chǎn)能營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)耗盡時(shí)，DY6大量消耗精氨酸生成的ATP可能用于延長(zhǎng)細(xì)胞的存活時(shí)間。此外，ADI途徑也是菌體進(jìn)行pH自我平衡的機(jī)制之一，代謝產(chǎn)生氨氣與胞質(zhì)氫離子結(jié)合生成銨根離子，從而使pH升高。推測(cè)大量消耗的精氨酸對(duì)菌株較好的耐酸性能有積極的促進(jìn)作用。天冬氨酸通過(guò)天冬氨酸脫羧酶等酶進(jìn)行催化產(chǎn)生乙偶姻、富馬酸等產(chǎn)物，形成的脫羧反應(yīng)作為能源來(lái)源和外邊酸性的pH保護(hù)系統(tǒng)。谷氨酸的脫羧反應(yīng)也是增強(qiáng)細(xì)胞耐酸性的途徑之一，谷氨酸代謝消耗氫離子產(chǎn)生γ-氨基丁酸，使pH得到提升。DY6消耗的谷氨酸(86.18%)顯著低于WCFS1，WCFS1能夠產(chǎn)生大量γ-氨基丁酸86.44%，同時(shí)也提高了菌株對(duì)酸的耐受性。此外，甲硫氨酸(72.16%)的需求量明顯低于WCFS1，可能影響甲基的供給和甲基化反應(yīng)。DY6的纈氨酸(80.52%)生產(chǎn)能力最強(qiáng)，有利于提高發(fā)酵中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)量。

a-發(fā)酵過(guò)程中的生長(zhǎng)和有機(jī)酸生產(chǎn)水平;b-單位干重乳酸產(chǎn)量;c～f-蔗糖、半乳糖、果糖、麥芽糖分別為唯一碳源時(shí)DY6和WCFS1的菌株差異;g-DY6和WCFS1氨基酸代謝情況差異

2.3 DY6全基因組重測(cè)序

2.3.1 變異位點(diǎn)檢測(cè)和注釋

結(jié)合植物乳桿菌DY6基因組重測(cè)序數(shù)據(jù)(表2)與參考基因組(NC_004567.2)之間比對(duì)的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌DY6樣品的差異基因的位點(diǎn)共20 368個(gè)，其中SNP 19 396個(gè)，INDEL 972個(gè)，注釋到的差異基因有4 331個(gè)，突變類型包括移碼框未改變的插入(84個(gè))、移碼突變(190個(gè))、終止密碼子丟失和拼接區(qū)變異(62個(gè))、錯(cuò)義突變(3 990個(gè))和起始密碼子丟失(5個(gè))，DY6中主要是發(fā)生錯(cuò)義突變。

表2 基因組重測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

2.3.2 KEGG通路變異基因富集分析

在KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中植物乳桿菌DY6共注釋到的基因數(shù)目為1 350個(gè)，變異基因數(shù)目為701個(gè)，注釋的通路為27個(gè)，包括細(xì)胞過(guò)程、環(huán)境信息處理、遺傳信息處理、新陳代謝和機(jī)體系統(tǒng)五個(gè)方面(圖3-a)。在新陳代謝方面占比超過(guò)一半，注釋的13個(gè)通路主要包括碳水化合物代謝、氨基酸代謝和維生素代謝等。其中碳水化合物代謝途徑注釋的基因數(shù)目最多，主要包括丙酮酸代謝、果糖和甘露糖代謝、淀粉和蔗糖代謝、半乳糖代謝、磷酸戊糖代謝等，在基因水平上顯示出菌株利用碳源進(jìn)行能量代謝和轉(zhuǎn)化中間產(chǎn)物的潛力。此外在氨基酸代謝途徑中注釋到82個(gè)基因，包含蛋氨酸、天冬氨酸和精氨酸等代謝途徑。

2.3.3 丙酮酸代謝途徑解析

乳酸菌的整個(gè)代謝過(guò)程主要是從糖中快速并且最大限度地生產(chǎn)乳酸等其他代謝產(chǎn)物的關(guān)鍵控制點(diǎn)在糖酵解中的丙酮酸代謝。本研究注釋到DY6中丙酮酸相關(guān)代謝途徑的大量基因(圖3-b)，fruK作為糖酵解途徑的限速變構(gòu)調(diào)控酶，其酶活的高低可根據(jù)細(xì)胞對(duì)能量的需要進(jìn)行調(diào)節(jié)，從而控制糖酵解代謝流和生長(zhǎng)速率。DY6的生長(zhǎng)活性顯著高于WCFS1，推測(cè)DY6代謝中fruK可能存在正突變，加快葡萄糖碳源流向糖酵解途徑，滿足細(xì)胞生長(zhǎng)所需的能量和物質(zhì)。此外，DY6代謝中丙酮酸通過(guò)Idhl2產(chǎn)生的乳酸含量明顯優(yōu)于WCFS1，通過(guò)pta和ack1催化產(chǎn)生的乙酸低于WCFS1，由于其余有機(jī)酸含量顯著低于乳酸和乙酸，推測(cè)ldhl2可能存在正突變，使丙酮酸代謝流向乳酸代謝增多。丙酮酸通過(guò)pycA轉(zhuǎn)化為草酰乙酸后，磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(pck)催化草酰乙酸生成磷酸烯醇式丙酮酸和二氧化碳，磷酸烯醇式丙酮酸水平的增加可以加強(qiáng)糖酵解的阻滯，降低葡萄糖攝取率，pycA和pck的基因變化是否對(duì)菌株的影響還需要進(jìn)一步試驗(yàn)證明。丙酮酸脫氫酶系催化丙酮酸到乙酰輔酶A是糖的有氧氧化和氧化磷酸化的連接結(jié)點(diǎn)，在能量代謝中起著重要的作用，催化該反應(yīng)的pdhC中插入一段序列為L(zhǎng)ysAlaGluThrProAlaAla，以及pdhA中存在一個(gè)差異基因，但這些差異基因的變化是否導(dǎo)致了生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)物的變化則還需要進(jìn)一步試驗(yàn)證明。

2.3.4 碳水化合物代謝途徑解析

碳水化合物代謝能力是細(xì)菌培養(yǎng)和選擇的重要指標(biāo)，乳酸菌利用多種碳水化合物的能力是居住在胃腸道或能夠居住在各種生態(tài)位的生物體的一個(gè)重要屬性[20]。乳酸菌利用磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(phosphotransferase system,PTS)將單糖和雙糖轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)代謝，WCFS1中編碼25個(gè)完整的PTS酶Ⅱ復(fù)合物(EⅡ)和幾個(gè)不完整的復(fù)合物，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)在其他微生物基因組中發(fā)現(xiàn)的PTS數(shù)量[17]。DY6中注釋到26個(gè)PTS轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的EⅡ共發(fā)生93個(gè)突變位點(diǎn)。豐富的PTS轉(zhuǎn)運(yùn)載體對(duì)植物乳桿菌DY6的碳源利用極為重要，這可能也是DY6具有優(yōu)越的產(chǎn)酸和耗糖性能的重要原因。推測(cè)PTS中存在正向突變，使其具有較強(qiáng)的碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)能力，提高菌株在復(fù)雜環(huán)境中碳水化合物的利用率。DY6在果糖、蔗糖、麥芽糖和半乳糖代謝途徑中注釋的基因如圖3-b所示。果糖激酶屬于一種磷酸轉(zhuǎn)移酶，催化果糖形成果糖-6-磷酸后進(jìn)入糖酵解途徑。由于果糖可以繞開(kāi)糖酵解入口的己糖激酶和磷酸果糖激酶的限速酶，進(jìn)而不受其他多種因素的嚴(yán)密調(diào)節(jié)，可以迅速進(jìn)入代謝途徑，并且與葡萄糖氧化放出的能量相同[21]。結(jié)合DY6在果糖代謝中表型差異最為顯著，推測(cè)果糖激酶(sacK1、sacK2)、果糖特異性EIIABC(fruA)和EIIBC(PTS31BC)組分可能發(fā)生正突變，加快碳源流向乳酸的合成。乳糖經(jīng)β-半乳糖苷酶(lacA)的作用下被水解為葡萄糖和半乳糖，隨后這兩種單糖分別進(jìn)入糖酵解途徑和Leloir途徑。乳糖的不徹底分解造成的半乳糖積累，半乳糖的存也會(huì)影響發(fā)酵乳制品的品質(zhì)和烘培制品的風(fēng)味[22]。DY6中注釋到D-半乳糖進(jìn)入Leloir途徑后，經(jīng)醛糖1-表異構(gòu)酶(galM)等酶催化生成UDP-葡萄糖后轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸烟?1-磷酸進(jìn)入糖酵解途徑中。DY6利用半乳糖具有較好的產(chǎn)乳酸性能，推測(cè)可能存在正突變加快半乳糖水解。蔗糖-6-磷酸水解酶(scrB)和α-葡萄糖苷酶(Ip_0193)分別水解蔗糖和麥芽糖為單糖，結(jié)合菌株表型代謝中的差異，推測(cè)scrB和Ip_0193可能存在正向突變，加快碳源代謝。

2.3.5 氨基酸代謝途徑解析

不同乳酸菌菌株由于其代謝路徑不完全相同，對(duì)其生長(zhǎng)所需要的必需和非必需氨基酸的數(shù)量和類型也就不同，而氨基酸的合成分解又直接影響菌體的生長(zhǎng)代謝。甲硫氨酸是生命體所必需氨基酸中唯一的含硫氨基酸，為肌酸等轉(zhuǎn)甲基化反應(yīng)、DNA等甲基化提供甲基及抗氧化防御[23]。甲硫氨酸和半胱氨酸的合成和代謝中注釋的差異基因有蛋氨酸腺苷轉(zhuǎn)移酶(metK)和S-腺苷同型半胱氨酸核苷酸酶(mtn)等酶(圖3-b)。在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中催化同型半胱氨酸合成甲硫氨酸所編碼的酶表達(dá)量具有明顯的上調(diào)，與甲硫氨酸生物合成相關(guān)的酶對(duì)菌株生長(zhǎng)具有顯著影響[24]。結(jié)合甲硫氨酸消耗量較少推測(cè)可能是metK或mtn發(fā)生負(fù)突變?cè)斐杉琢虬彼岽x途徑抑制。谷氨酸脫羧酶(gadB)對(duì)L-谷氨酸具有專一性，在磷酸吡哆醛作為其輔酶因子的條件下，催化L-谷氨酸進(jìn)行不可逆的α-脫羧反應(yīng)合成γ-氨基丁酸。結(jié)合DY6的γ-氨基丁酸產(chǎn)生量低于WCFS1，推測(cè)gadB可能發(fā)生負(fù)突變，影響γ-氨基丁酸的合成，從而對(duì)菌株的耐酸性能產(chǎn)生影響。谷氨酸是其他氨基酸合成的關(guān)鍵中間體，在谷氨酸脫氫酶(gdh)催化下產(chǎn)生檸檬酸循環(huán)的中間代謝產(chǎn)物α-酮戊二酸和氨氣，并釋放能量。L-谷氨酸和谷氨酰胺代謝途徑中注釋到在氨甲酰磷酸合成酶(carB)和鳥(niǎo)氨酸氨基甲酰轉(zhuǎn)移酶(argF)等酶的催化下合成瓜氨酸。L-瓜氨酸和L-天冬氨酸共同反應(yīng)得到L-精氨琥珀酸，隨后在精氨琥珀酸裂解酶(argH)催化下生成延胡索酸和精氨酸，后者繼續(xù)反應(yīng)生成鳥(niǎo)氨酸參與反應(yīng)。DY6的精氨酸大量消耗推測(cè)可能是argF發(fā)生正突變，造成精氨酸迅速被代謝。

a-KEGG通路變異基因功能注釋;b-果糖、蔗糖、麥芽糖、半乳糖和氨基酸代謝途徑;c-qRT-PCR測(cè)定丙酮酸代謝相關(guān)基因表達(dá)水平

2.4 對(duì)丙酮酸代謝相關(guān)突變基因的qRT-PCR驗(yàn)證

為了在基因轉(zhuǎn)錄水平上解釋其發(fā)酵差異，選取產(chǎn)有機(jī)酸關(guān)聯(lián)緊密的丙酮酸代謝途徑(圖3-b)，對(duì)該過(guò)程中注釋的7個(gè)關(guān)鍵酶(pdhC、ack1、Idhl2、pta、fruK、pdhA和pycA)的基因表達(dá)量進(jìn)行測(cè)定。以WCFS1的基因表達(dá)量為1作為標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)現(xiàn)pdhC基因相對(duì)表達(dá)量最高，是WCFS1的20倍。此外ack1、Idhl2、pta、fruK、pdhA和pycA的表達(dá)水平依次是WCFS1的15、14、7、6、3、2倍(圖3-c)。ack1和Idhl2的基因表達(dá)情況與表型中乙酸和乳酸產(chǎn)量差異變化相一致，pdhC基因相對(duì)表達(dá)最為顯著，推測(cè)可能是該序列中插入一段LysAlaGluThrProAlaAla，與其結(jié)構(gòu)和催化活性相關(guān)，進(jìn)而影響丙酮酸向乙酰輔酶A的轉(zhuǎn)化。

3 結(jié)論

植物乳桿菌是一種具有良好生理特性及益生功能的細(xì)菌，被廣泛應(yīng)用于食品、動(dòng)物飼料、工業(yè)生產(chǎn)和醫(yī)療保健等領(lǐng)域。但早期的研究主要集中在單一菌株的表型特征，如碳水化合物、生長(zhǎng)溫度和pH等方面的生長(zhǎng)特性研究，以及多菌株的分類學(xué)、系統(tǒng)發(fā)育研究和食品安全性評(píng)估等方面，缺少與優(yōu)秀模式菌株的表型關(guān)聯(lián)分析。通過(guò)分析同種不同來(lái)源的菌株的性狀差異，在基因水平上進(jìn)一步揭示植物乳桿菌的菌種特性、生理功能和代謝機(jī)制。本研究經(jīng)過(guò)體外益生特性試驗(yàn)表明DY6擁有與WCFS1同樣較強(qiáng)的耐酸、耐膽鹽和與致病菌的共聚集性能，表明DY6可作為潛在的益生菌株進(jìn)行進(jìn)一步研究。此外，在富含葡萄糖、果糖和半乳糖的培養(yǎng)基中DY6的生長(zhǎng)和代謝情況顯著優(yōu)于WCFS1，產(chǎn)乳酸性能顯著優(yōu)于WCFS1。隨后發(fā)現(xiàn)，在DY6基因組中與丙酮酸代謝關(guān)聯(lián)的pdhC、ack1和Idhl2的基因表達(dá)量具有顯著優(yōu)勢(shì)，推測(cè)可能編碼了非常強(qiáng)的丙酮酸代謝能力，與其發(fā)酵過(guò)程產(chǎn)酸快、產(chǎn)酸強(qiáng)直接相關(guān)。本研究中依據(jù)基因組重測(cè)序獲取了大量差異基因，并全面關(guān)聯(lián)到與表型差異相關(guān)的代謝途徑的所有基因，為后續(xù)以植物乳桿菌為模式菌株進(jìn)行代謝機(jī)制研究提供了理論支撐。