王玉涵，王欣然，吉挺，陸超麗，吳殿軍，師豐豐，周金慧,4,5*

1(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所，北京，100093)2(揚(yáng)州大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州，225000)3(昭平縣農(nóng)村社會(huì)事業(yè)促進(jìn)站，廣西 賀州，546800)4(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部蜂產(chǎn)品質(zhì)量安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京，100093)5(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部蜂產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評估實(shí)驗(yàn)室，北京，100093)

蜂蜜是蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，與自身分泌物結(jié)合后，在巢脾內(nèi)轉(zhuǎn)化、脫水、貯存至成熟的天然甜物質(zhì)[1]。枇杷蜂蜜是蜜蜂采集枇杷花蜜釀造而成的。枇杷蜜粉充足且花期長，是重要的冬季蜜源。枇杷果實(shí)味甜、營養(yǎng)豐富，枇杷蜂蜜中營養(yǎng)成分和獨(dú)特風(fēng)味來源于枇杷蜜源。枇杷蜂蜜色白濃稠，具有獨(dú)特的杏仁香味，有潤肺止咳、調(diào)節(jié)胃腸道功能和增強(qiáng)免疫力等功效，是蜜中佳品[2]。

蜂蜜中主要成分是糖類物質(zhì)，低聚糖是蜂蜜中重要的營養(yǎng)功效成分，其中低聚異麥芽糖(異麥芽糖、黑曲霉二糖等)、低聚果糖(蔗果三糖等)、大豆低聚糖(蜜三糖等)以及龍膽低聚糖(龍膽二糖等)[3]，功能性低聚糖能促進(jìn)腸道中雙歧桿菌、乳酸桿菌的生長[4]，具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力[5]，促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)吸收、降低膽固醇和調(diào)節(jié)腸道滲透壓等功效[3]。蜂蜜的釀造過程是復(fù)雜的生物轉(zhuǎn)化過程，目前已有對蜂蜜成熟過程中水分、單糖、蔗糖及酶值等物質(zhì)變化規(guī)律的研究[6-7]，但尚未見對成熟過程中低聚糖變化的相關(guān)研究，因此開展枇杷蜂蜜成熟過程中低聚糖變化規(guī)律研究，可為枇杷蜂蜜成熟過程中成分和生物活性變化研究提供依據(jù)。

目前對糖類物質(zhì)的檢測方法主要包括GC[8]、GC-MS[9]、HPLC[10]、超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(ultra-performance liquid chromatography tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS)[11]、高效陰離子交換色譜法(high performance anion exchange chromatography，HPAEC)[12]，其中GC-MS因其靈敏度高、分離能力強(qiáng)，能準(zhǔn)確定性識別等優(yōu)勢，已被廣泛用于蜂產(chǎn)品中糖類物質(zhì)分析[9,13]。本研究建立了枇杷蜂蜜中低聚糖GC-MS檢測方法，分析枇杷蜂蜜成熟過程中低聚糖變化規(guī)律，為枇杷蜂蜜品質(zhì)評價(jià)提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枇杷蜂蜜樣品：采集于江蘇省蘇州市吳中區(qū)東山鎮(zhèn)，采集蜂種為中華蜜蜂(華中型)。在枇杷盛花期隨機(jī)選擇枇杷園內(nèi)的蜂場作為采樣點(diǎn)，樣品采集前清空巢脾，每日清晨進(jìn)行樣品采集，每日采集3個(gè)蜂箱的蜂蜜作為平行樣品，共計(jì)45個(gè)枇杷蜂蜜樣品。

枇杷花蜜樣品：直接吸取于處于盛花期的枇杷花上。枇杷蜂蜜和花蜜樣品于-20 ℃貯存直至分析。

依據(jù)SN/T 0852—2012《進(jìn)出口蜂蜜檢驗(yàn)規(guī)程》中規(guī)定的水分測定方法測定枇杷花蜜和蜂蜜中的水分含量(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，每個(gè)樣品平行測定3次。樣品采集信息及水分含量(質(zhì)量分?jǐn)?shù))見表1。

表1 枇杷花蜜和成熟過程中蜂蜜樣品信息表

試劑：吡啶、六甲基二硅胺烷、三氟乙酸酐(均為分析純)、松二糖(CAS：547-25-1，純度為98%)，上海阿拉丁試劑有限公司；鹽酸羥胺(分析純)，北京酷來搏科技有限公司；無水乙醇(分析純)，天津市大茂化學(xué)試劑廠；苯基-β-D-葡萄糖苷(CAS：1464-44-4，純度為98%)、黑曲霉二糖(CAS：497-48-3，純度為93%)北京百靈威科技有限公司；蔗糖(CAS：57-50-1，純度≥98%)、棉子糖(CAS：512-66-3，純度≥98%)、α，α-海藻糖(CAS：99-20-7，純度≥98%)、α，β-海藻糖(CAS：585-91-1，純度為98%)、β，β-海藻糖(CAS：499-23-0，純度為98%)、昆布二糖(CAS：34980-39-7，純度≥95%)、麥芽糖(CAS：69-79-4，純度≥98%)、異麥芽酮糖(CAS：13718-94-0，純度≥98%)、龍膽二糖(CAS：554-91-6，純度≥98%)、蜜二糖(CAS：585-99-9，純度為98%)、異麥芽糖(CAS：499-40-1，純度≥97%)、蜜三糖(CAS：512-69-6，純度≥98%)、蔗果三糖(CAS：470-69-9，純度≥98%)、吡喃葡糖基蔗糖(CAS：13101-54-7，純度≥97%)、松三糖(CAS：597-12-6，純度≥98%)，上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

QP 2010氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，日本島津公司；QL-866旋渦混勻器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；1-15PK離心機(jī)，Sigma有限公司；TUS-200P振蕩型恒溫金屬浴，上海一恒科技有限公司；Auto Vap S60樣品全自動(dòng)氮吹儀，美國ATR公司；BSA124S分析天平(感量0.000 1 g)，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司。

1.3 溶液配制

準(zhǔn)確稱取適量苯基-β-D-葡萄糖苷，用體積分?jǐn)?shù)80%乙醇水配制成0.025 mg/mL的內(nèi)標(biāo)工作溶液。準(zhǔn)確稱取棉子糖、α，α-海藻糖、α，β-海藻糖、β，β-海藻糖、蔗糖、昆布二糖、黑曲霉二糖、松二糖、麥芽糖、異麥芽酮糖、龍膽二糖、蜜二糖、異麥芽糖、蜜三糖、蔗果三糖、吡喃葡糖基蔗糖和松三糖標(biāo)準(zhǔn)品適量，用超純水配制成5～200 mg/mL的儲(chǔ)備液，于4 ℃下避光儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 樣品提取與衍生化處理

稱取0.25 g蜂蜜樣品溶解于25 mL 80%(體積分?jǐn)?shù))乙醇溶液中，渦旋混勻，于8 000 r/min，4 ℃離心10 min，吸取上清液1 mL，用80%(體積分?jǐn)?shù))乙醇水稀釋10倍(測定蔗糖含量時(shí)需稀釋50倍)，吸取稀釋液100 μL于1.5 mL離心管，于40 ℃氮吹至干，待衍生。參照RUIZ-MATUTE等[9]的方法，上述1.5 mL離心管中加入20 μL苯基-β-D-葡萄糖苷溶液(0.025 mg/mL)，渦旋混勻，加入350 μL鹽酸羥胺吡啶溶液(25 mg/mL)，渦旋混勻，75 ℃反應(yīng)30 min，隨后加入350 μL六甲基二硅胺烷和35 μL三氟乙酸酐，渦旋混勻，45 ℃反應(yīng)30 min，12 000 r/min，4 ℃離心10 min，取上清液至進(jìn)樣瓶內(nèi)，用于GC-MS分析。

1.5 分析條件

1.5.1 色譜條件

色譜柱：DB-5(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；載氣為氦氣，流量0.99 mL/min；進(jìn)樣口溫度300 ℃，不分流進(jìn)樣；升溫程序：初始溫度180 ℃，保持5 min，以10 ℃/min升溫至255 ℃，保持1 min，然后以15 ℃/min 升溫至265 ℃，保持1 min，然后以1 ℃/min升溫至270 ℃，然后以10 ℃/min升溫至300 ℃，然后以20 ℃/min升溫至320 ℃，保持10 min，進(jìn)樣量1 μL。

1.5.2 質(zhì)譜條件

電子電離源；離子源溫度230 ℃；電離能量70 eV；溶劑延遲10 min；掃描類型：選擇離子監(jiān)測模式(selected ion monitoring，SIM)。低聚糖衍生物對應(yīng)的保留時(shí)間、監(jiān)測特征離子參數(shù)見表2。

表2 低聚糖的保留時(shí)間、監(jiān)測離子

1.6 數(shù)據(jù)處理

枇杷蜂蜜和花蜜樣品中低聚糖含量均平行測定3次，數(shù)據(jù)結(jié)果均以“平均含量±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示。采用IBM SPSS Statistics 23數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 GC-MS儀器條件優(yōu)化

優(yōu)化升溫程序可實(shí)現(xiàn)多種低聚糖的色譜分離，17種低聚糖的衍生物總離子流色譜圖見圖1-a。但由于糖類物質(zhì)結(jié)構(gòu)類似，僅依靠色譜分離難以實(shí)現(xiàn)完全區(qū)分，因此需對質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，以實(shí)現(xiàn)同時(shí)對蜂蜜中多種低聚糖的準(zhǔn)確定性、定量分析。SIM模式下所獲目標(biāo)物色譜峰噪聲干擾小，響應(yīng)值高，目標(biāo)物檢測靈敏度高，因此采用SIM模式進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。糖類物質(zhì)經(jīng)質(zhì)譜分析后獲得的離子碎片相近，選擇單一離子難以對低聚糖進(jìn)行有效區(qū)分，因此選擇響應(yīng)值高且可以與其他物質(zhì)有效區(qū)分的離子作為特征定量離子，另選擇響應(yīng)值較高的其他碎片離子作為特征定性離子，3種特征定量離子提取色譜圖見圖1-b～圖1-d。

1-苯基-β-D-葡萄糖苷；2-棉子糖；3-蔗糖；4-α，α-海藻糖；5- α，β-海藻糖；6-β，β-海藻糖；7-昆布二糖；8- 黑曲霉二糖(特征色譜峰1)；9- 松二糖(特征色譜峰1)；10- 麥芽糖(特征色譜峰1)；11- 松二糖(特征色譜峰2)；12- 麥芽糖(特征色譜峰2)；13- 黑曲霉二糖(特征色譜峰2)；14- 異麥芽酮糖(特征色譜峰1)；15- 龍膽二糖(特征色譜峰1)；16- 異麥芽酮糖(特征色譜峰2)；17- 龍膽二糖(特征色譜峰2)；18- 蜜二糖(特征色譜峰1)；19- 異麥芽糖(特征色譜峰1)；20- 蜜二糖(特征色譜峰2)；21- 異麥芽糖(特征色譜峰2)；22-蜜三糖；23-蔗果三糖；24-吡喃葡糖基蔗糖；25-松三糖

2.2 衍生化方法選擇

低聚糖不易揮發(fā)，通常先將其轉(zhuǎn)化為易揮發(fā)的低聚糖衍生物后，再進(jìn)行GC-MS分析。常見的衍生化方法主要為硅烷化、?；屯榛苌?，其中硅烷化衍生適用于含活性氫官能團(tuán)物質(zhì)的衍生化反應(yīng)，其衍生產(chǎn)物易揮發(fā)，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定不易降解，可直接進(jìn)行色譜分析，因此在本研究中被應(yīng)用于蜂蜜中低聚糖的衍生化處理。但還原性低聚糖由于存在環(huán)化和開環(huán)轉(zhuǎn)化等反應(yīng)，直接進(jìn)行硅烷化衍生時(shí)會(huì)產(chǎn)生多種異構(gòu)體，難以準(zhǔn)確定量。在硅烷化衍生前對低聚糖進(jìn)行肟化反應(yīng)，可使其環(huán)化反應(yīng)受限，有效減少還原性低聚糖多種衍生產(chǎn)物的形成[14]。最終，經(jīng)肟化-硅烷化衍生后，還原性低聚糖(黑曲霉二糖、麥芽糖、松二糖、異麥芽酮糖、龍膽二糖、蜜二糖和異麥芽糖)僅形成順式和反式2種衍生產(chǎn)物；非還原性低聚糖(蔗糖、海藻糖，昆布二糖、棉子糖、松三糖、蜜三糖、蔗果三糖和吡喃葡糖基蔗糖)形成單一衍生產(chǎn)物[15]，利于準(zhǔn)確定量分析。

2.3 方法學(xué)評價(jià)

建立食品中內(nèi)源性物質(zhì)檢測分析方法，需對其進(jìn)行方法學(xué)評價(jià)，以確保檢測方法的可靠性和有效性。目前，針對內(nèi)源性物質(zhì)的方法學(xué)評價(jià)主要有標(biāo)準(zhǔn)加入法、替代基質(zhì)法和替代分析物法3種方式[16]，由于枇杷蜂蜜樣品中低聚糖響應(yīng)較高，采用標(biāo)準(zhǔn)加入法添加同濃度目標(biāo)分析物后，會(huì)出現(xiàn)峰值過飽和的現(xiàn)象，損傷儀器，同時(shí)不能實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)物的準(zhǔn)確定量。此外，難以獲得不含目標(biāo)分析物的替代基質(zhì)，使得替代基質(zhì)法同樣不適用于枇杷蜂蜜中低聚糖分析的方法學(xué)評價(jià)。最終采用替代分析物法進(jìn)行方法學(xué)評價(jià)，選用與待測低聚糖結(jié)構(gòu)類似且枇杷蜂蜜和花蜜中均不含有的苯基-β-D-葡萄糖苷作為替代物。為進(jìn)一步驗(yàn)證其作為替代物的可行性，采用體積分?jǐn)?shù)80%乙醇水配制17種低聚糖與苯基-β-D-葡萄糖苷的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng)1.4節(jié)所述方法提取、衍生并上機(jī)測定。結(jié)果顯示待測低聚糖回收率為81.72%～118.99%，苯基-β-D-葡萄糖苷回收率為118.83%，說明苯基-β-D-葡萄糖苷與待測低聚糖在提取以及衍生化過程中化學(xué)行為相近，同時(shí)，經(jīng)色譜分離可實(shí)現(xiàn)良好區(qū)分，因此苯基-β-D-葡萄糖苷可作為待測低聚糖的替代物用于方法學(xué)評價(jià)。

2.3.1 基質(zhì)效應(yīng)評價(jià)

采用替代物評估枇杷蜂蜜中低聚糖含量分析方法的基質(zhì)效應(yīng)。枇杷蜂蜜樣品經(jīng)上述1.4節(jié)制備苯基-β-D-葡萄糖苷空白基質(zhì)液。分別配制質(zhì)量濃度為0.13～13.24 μg/mL的苯基-β-D-葡萄糖苷系列基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和溶劑標(biāo)準(zhǔn)工作溶液并進(jìn)行測定。基質(zhì)效應(yīng)通過替代物的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線和溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率比進(jìn)行評估，結(jié)果表明，替代物在枇杷蜂蜜中的基質(zhì)效應(yīng)為103.25%，符合歐盟對方法學(xué)評價(jià)中基質(zhì)效應(yīng)的相關(guān)要求[17]，因此可采用溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行枇杷蜂蜜和花蜜中低聚糖的定量分析。

2.3.2 線性范圍、檢出限及定量限

內(nèi)標(biāo)法定量可減少前處理及儀器測定過程中的誤差，降低基質(zhì)干擾，實(shí)現(xiàn)對待測物的準(zhǔn)確定量。因此本研究中選擇苯基-β-D-葡萄糖苷為內(nèi)標(biāo)物，采用內(nèi)標(biāo)法對待測低聚糖進(jìn)行定量分析。

吸取適量各低聚糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，配制不同濃度低聚糖系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液(表3)，按1.4節(jié)方法在衍生化前加入20 μL內(nèi)標(biāo)物苯基-β-D-葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.025 mg/mL),經(jīng)衍生化處理后上機(jī)測定。以低聚糖與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比為縱坐標(biāo)，以低聚糖濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程和相關(guān)系數(shù)。17種低聚糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、回歸系數(shù)及線性范圍見表3。17種低聚糖在其相應(yīng)的濃度范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.99。

表3 十七種低聚糖的溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍

2.3.3 回收率和精密度

通過添加替代分析物開展方法的回收率和精密度評價(jià)[18]，選擇與目標(biāo)物線性濃度范圍內(nèi)響應(yīng)相近的替代物添加濃度進(jìn)行添加回收實(shí)驗(yàn)。本方法中枇杷蜂蜜樣品中分別按照0.01、0.10、1.00 g/100g添加苯基-β-D-葡萄糖苷，按照1.4節(jié)進(jìn)行樣品提取與衍生化處理，GC-MS測定，計(jì)算方法回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果表明，蜂蜜樣品中苯基-β-D-葡萄糖苷在3個(gè)添加濃度的回收率在87.43%～117.17%。日內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.97%～11.94%；日間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在5.25%～14.13%，說明方法準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性良好，可滿足檢測的要求，因此本方法適用于枇杷蜂蜜和花蜜中低聚糖的定量分析。

2.4 枇杷蜂蜜和枇杷花蜜中低聚糖組成差異

枇杷蜂蜜和花蜜樣品按1.4節(jié)方法進(jìn)行提取和衍生化處理，采用1.5節(jié)GC-MS方法進(jìn)行測定，結(jié)果表明，枇杷蜂蜜中共有效檢出11種低聚糖，分別為蔗糖、α，β-海藻糖、黑曲霉二糖、松二糖、麥芽糖、異麥芽酮糖、異麥芽糖、蜜三糖、蔗果三糖、吡喃葡糖基蔗糖和松三糖。枇杷花蜜中共檢出6種低聚糖，分別為蔗糖、β，β-海藻糖、昆布二糖、黑曲霉二糖、蔗果三糖和吡喃葡糖基蔗糖。枇杷蜂蜜低聚糖組成較花蜜更為豐富，枇杷花蜜和蜂蜜中低聚糖種類組成差異如圖2所示，枇杷蜂蜜和花蜜中均含有蔗糖、黑曲霉二糖、蔗果三糖和吡喃葡糖基蔗糖。β，β-海藻糖、昆布二糖僅存在于花蜜中，并未在蜂蜜中發(fā)現(xiàn)，其原因是經(jīng)蜂蜜釀造后，花蜜中昆布二糖和β，β-海藻糖可被β-葡萄糖苷酶和海藻糖酶分解為葡萄糖[19-20]。α，β-海藻糖、松二糖、麥芽糖、異麥芽酮糖、異麥芽糖、蜜三糖和松三糖7種低聚糖僅存在于枇杷蜂蜜中，其原因是在蜂蜜釀造過程中，在蜜蜂的分泌物和花蜜中酸類物質(zhì)等作用下解離出花蜜中鍵合的低聚糖[6]，同時(shí)存在酶解[7]和轉(zhuǎn)糖基化[21]等作用使蜂蜜中的糖類物質(zhì)發(fā)生轉(zhuǎn)化，進(jìn)而產(chǎn)生了更多種類的低聚糖。

圖2 枇杷花蜜和枇杷蜂蜜中低聚糖比較的韋恩圖

2.5 枇杷蜂蜜中低聚糖含量特征分析

我國枇杷蜂蜜中低聚糖種類豐富，枇杷蜂蜜中各低聚糖的占比不同。釀造15 d的蜂蜜中，蔗糖含量占檢出低聚糖總含量的52.10%；吡喃葡糖基蔗糖占30.10%；麥芽糖占10.96%；松二糖占1.51%；黑曲霉二糖占1.08%；異麥芽糖占0.95%；蔗果三糖占0.64%；異麥芽酮糖占0.55%；蜜三糖、α，β-海藻糖和松三糖含量偏低，占比均<0.50%。我國枇杷蜂蜜中低聚糖總含量豐富，11種低聚糖的總含量為15.77～20.97 g/100g，高于西班牙北部伊比利亞高原的薰衣草蜜、百花蜜、甘露蜜等蜂蜜(5.63～8.52 g/100g)[22]。

三糖中吡喃葡糖基蔗糖含量最高，含量范圍為2.91～5.51 g/100g，高于西班牙枇杷蜂蜜、牛油果蜂蜜、樹莓蜂蜜以及加拿大苜蓿蜂蜜、油菜蜜、三葉草蜜(0.07～3.43 g/100g)等蜂蜜[10,23]。蔗果三糖含量(0.07～0.12 g/100g)相對高于西班牙枇杷蜂蜜(0～0.09 g/100g)[23]。蜜三糖含量(0.05～0.14 g/100g)相對高于西班牙牛油果蜜、樹莓蜜以及冬香薄荷蜜(0.00～0.05 g/100g)[23]。松三糖含量范圍為0.03～0.05 g/100g，與報(bào)道的西班牙枇杷蜂蜜中松三糖含量范圍(0.00～0.09 g/100g)接近[23]。本研究中枇杷蜂蜜中三糖含量(除松三糖外)較上述已報(bào)道的西班牙和加拿大蜂蜜高，其中吡喃葡糖基蔗糖含量最高，是我國枇杷蜂蜜中特征性三糖。

本研究中江蘇東山白玉枇杷花蜜中蔗糖含量高達(dá)21.70 g/100g，高于報(bào)道的福建莆田枇杷花蜜中蔗糖含量(3.35 g/100g)[24]。不同品種枇杷中的糖類組差異[25]可能是不同品種枇杷花蜜中蔗糖含量差異的原因之一。由于枇杷蜜源中的蔗糖含量較高，導(dǎo)致枇杷蜂蜜中含有較高含量的蔗糖。經(jīng)蜜蜂長時(shí)間釀造轉(zhuǎn)化后，蔗糖含量在釀造15 d的蜂蜜中可降至9.24 g/100g，但高于GH/T 18796—2012《蜂蜜》所規(guī)定蜂蜜中蔗糖含量(≤5 g/100g)以及西班牙枇杷蜂蜜中蔗糖含量(0～0.1 g/100g)[23]。枇杷蜂蜜中，除蔗糖外，麥芽糖含量最高，含量為0.92～2.08 g/100g，高于西班牙枇杷蜂蜜(0.97～1.49 g/100g)[23]以及加拿大油菜蜜(0.76 g/100g)[10]，但低于西班牙龍舌蘭蜂蜜(2.71 g/100g)[23]。黑曲霉二糖在枇杷蜂蜜中含量為0.09～0.20 g/100g，與報(bào)道的加拿大油菜蜜中黑曲霉二糖含量(0.23 g/100g)接近[10]，但低于西班牙枇杷蜂蜜(1.08～1.63 g/100g)[23]。松二糖在枇杷蜂蜜中含量為0.17～0.32 g/100g，低于西班牙枇杷蜂蜜(1.64～2.71 g/100g)[23]及西班牙其他10種蜂蜜(0.72～2.87 g/100g)[13]；枇杷蜂蜜中海藻糖和異麥芽酮糖含量偏低，其中α，β-海藻糖含量(0.04～0.07 g/100g)低于西班牙牛油果蜜、百花蜜、枇杷蜜等蜂蜜(0.35～0.76 g/100g)[23]；異麥芽酮糖含量(0.06～0.11 g/100g)接近報(bào)道的加拿大苜蓿蜂蜜中異麥芽酮糖含量(0.067 g/100g)[10]，但低于西班牙枇杷蜂蜜(0.28～0.56 g/100g)[23]。本研究中枇杷蜂蜜中蔗糖、麥芽糖含量相對高于西班牙枇杷蜂蜜，其他二糖含量相對低于西班牙枇杷蜂蜜。

2.6 蜂蜜干重中低聚糖含量隨釀造天數(shù)變化分析

蜂蜜釀造過程是脫除水分、富集與轉(zhuǎn)化營養(yǎng)物質(zhì)的復(fù)雜生物過程。隨釀造時(shí)間延長，蜂蜜水分含量逐漸降低，如表1水分含量測定結(jié)果所示，花蜜中水分含量受環(huán)境影響較大，環(huán)境濕度高時(shí)采集的花蜜中水分含量高，可達(dá)53.66%質(zhì)量分?jǐn)?shù)?；劢?jīng)蜜蜂采集釀造后，釀造1 d蜂蜜中水分含量降至25.34%，在釀造1～8 d的枇杷蜂蜜中水分含量在21.76%～25.34%波動(dòng)變化，釀造9 d時(shí)水分含量下降，在釀造9～15 d枇杷蜂蜜中水分含量在18.89%～20.52%且含量無顯著性差異。由水分變化規(guī)律可知，在釀造2 d后枇杷蜂蜜中水分含量低于24%，符合行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)GH/T 18796—2012《蜂蜜》所規(guī)定的二等品水分含量要求；釀造13 d后枇杷蜂蜜水分含量低于20%，符合GH/T 18796—2012《蜂蜜》所規(guī)定的一等品水分含量要求。水分含量的減少對蜂蜜中物質(zhì)具有一定的濃縮效應(yīng)。本研究通過對樣品干重中低聚糖含量[樣品干重中低聚糖含量=樣品濕重中低聚糖含量測定值/(100%-樣品水分含量)]變化進(jìn)行分析，以排除因濃縮效應(yīng)造成的低聚糖含量上升。各低聚糖在枇杷花蜜和蜂蜜樣品干重中的含量及單因素方差分析結(jié)果如表4所示。

表4 枇杷花蜜和蜂蜜中低聚糖含量(均值±標(biāo)準(zhǔn)差，n=3) 單位：g/100g干重

2.6.1 枇杷蜂蜜釀造過程中二糖變化規(guī)律

在蜂蜜釀造過程中，蔗糖可被酶解為單糖[7]，同時(shí)也可在酶的轉(zhuǎn)化作用下轉(zhuǎn)化為其他糖類物質(zhì)[26]，因此蔗糖含量隨釀造時(shí)間延長呈下降趨勢。蔗糖在花蜜干重中含量為43.35 g/100g，經(jīng)蜂蜜釀造后，蔗糖含量下降，在釀造1～11 d蜂蜜干重中含量在13.17～18.30 g/100g范圍內(nèi)波動(dòng)，釀造12 d后蔗糖含量顯著降低并在14 d時(shí)降至最低含量(11.41 g/100g)，之后含量無顯著性差異。

除蔗糖外，枇杷蜂蜜中其他二糖在釀造過程中含量均呈上升趨勢。麥芽糖是枇杷蜂蜜中含量較高的二糖，但未在枇杷花蜜中檢出。已有報(bào)道顯示，枇杷花蜜中存在麥芽四糖和麥芽五糖[22]，枇杷蜂蜜的麥芽糖可來源于花蜜中麥芽多糖的分解[27]。麥芽糖在蜂蜜干重的含量在1～6 d內(nèi)含量無顯著性差異，含量為1.54～1.72 g/100g；7 d時(shí)含量上升至2.27 g/100g；在8～11 d內(nèi)含量無顯著性差異，含量為1.89～2.06 g/100g；12 d時(shí)含量開始持續(xù)上升并在15 d時(shí)達(dá)到最高含量(2.41 g/100g)。

松二糖、黑曲霉二糖、異麥芽糖、異麥芽酮糖和α，β-海藻糖在蜂蜜釀造過程中含量表現(xiàn)出相似的上升規(guī)律。松二糖、異麥芽糖、異麥芽酮糖和α，β-海藻糖均未在花蜜中檢出，其在蜂蜜釀造過程中含量的增加可能源于糖類物質(zhì)的轉(zhuǎn)化作用。由于糖苷酶在分解糖類物質(zhì)的同時(shí)伴隨著轉(zhuǎn)糖基化作用而產(chǎn)生新的低聚糖，如麥芽糖經(jīng)轉(zhuǎn)糖基化生成異麥芽糖[28]。黑曲霉二糖在花蜜干重中含量為0.01 g/100g，經(jīng)蜜蜂釀造后，黑曲霉含量增加，除花蜜中黑曲霉二糖的富集外，也可能存在糖類物質(zhì)的轉(zhuǎn)化生成黑曲霉二糖。枇杷蜂蜜中松二糖、黑曲霉二糖、異麥芽糖、異麥芽酮糖和α，β-海藻糖在1～13 d內(nèi)含量保持波動(dòng)上升，在松二糖、黑異麥芽糖、異麥芽酮糖和α，β-海藻糖第14天含量達(dá)到最高水平，分別為0.36、0.21、0.13、0.09 g/100g，之后含量均無顯著性差異；黑曲霉二糖在15 d時(shí)含量達(dá)最高(0.24 g/100g)。

由以上分析結(jié)果可知，枇杷蜂蜜中除蔗糖外，其他二糖含量均隨釀造時(shí)間延長呈增加趨勢，在釀造前期含量波動(dòng)上升，其中麥芽糖和黑曲霉二糖在15 d時(shí)含量達(dá)最高；松二糖、異麥芽糖、異麥芽酮糖和α，β-海藻糖含量在14 d時(shí)達(dá)到最高，之后含量無顯著性差異。

2.6.2 枇杷蜂蜜釀造過程中三糖變化規(guī)律

本研究中三糖在枇杷蜂蜜釀造過程中呈無規(guī)律波動(dòng)性變化。枇杷蜂蜜中，除吡喃葡糖基蔗糖外，其他三糖經(jīng)蜂蜜釀造后含量未表現(xiàn)出明顯增加。吡喃葡糖基蔗糖在枇杷蜂蜜干重中含量顯著高于花蜜，在釀造1～15 d中吡喃葡糖基蔗糖含量呈波動(dòng)性變化，含量為3.80～6.84 g/100g，其在釀造15 d時(shí)含量上升至最高水平(6.84 g/100g)。釀造過程中蔗糖可經(jīng)轉(zhuǎn)糖基化作用生成吡喃葡糖基蔗糖[26]，同時(shí)吡喃葡糖基蔗糖也可被酶解[29]，在這兩種轉(zhuǎn)化作用的共同作用下可造成吡喃葡糖基蔗糖含量的波動(dòng)性變化。

隨釀造時(shí)間延長，蔗果三糖、蜜三糖和松三糖含量分別為0.09～0.16、0.07～0.14、0.03～0.06 g/100g。同時(shí)，蔗果三糖、蜜三糖和松三糖含量分別在釀造1 d與釀造15 d的枇杷蜂蜜干重中無顯著性差異。值得注意的是，蔗果三糖在枇杷花蜜中干重含量達(dá)0.80 g/100g，顯著高于枇杷蜂蜜干重中蔗果三糖含量。經(jīng)蜜蜂釀造，花蜜中蔗果三糖被轉(zhuǎn)化酶分解[30]，可造成枇杷蜂蜜中蔗果三糖含量低于枇杷花蜜。蜂蜜釀造過程中物質(zhì)分解和轉(zhuǎn)化作用是導(dǎo)致三糖含量呈波動(dòng)性變化的原因之一。

2.6.3 枇杷蜂蜜釀造過程中檢出低聚糖總含量變化規(guī)律

隨釀造時(shí)間的延長，蜜蜂將采集的花蜜不斷添加到巢脾中，巢脾內(nèi)蜜量增多，同時(shí)經(jīng)蜜蜂振翅扇風(fēng)和吞吐釀造，蜂蜜中水分被脫除，巢脾逐漸封蓋。在釀造過程中營養(yǎng)物質(zhì)被富集，同時(shí)也發(fā)生著物質(zhì)轉(zhuǎn)化。隨釀造時(shí)間延長，枇杷蜂蜜中糖類物質(zhì)經(jīng)過蜜蜂充分釀造轉(zhuǎn)化，在釀造后期各物質(zhì)含量趨于穩(wěn)定。蔗糖在枇杷蜂蜜11種低聚糖總含量中占比最高，隨釀造時(shí)間延長蔗糖含量降低，也導(dǎo)致低聚糖總含量在蜂蜜干重中隨釀造時(shí)間延長而降低，釀造14 d時(shí)低聚糖總含量達(dá)到最低(19.91 g/100g)，之后含量無顯著性差異。

3 結(jié)果與討論

本研究建立了基于兩步法衍生化的GC-MS法測定枇杷花蜜和不同釀造天數(shù)枇杷蜂蜜中低聚糖含量，該技術(shù)準(zhǔn)確度高、精密度好，可為枇杷蜂蜜品質(zhì)評價(jià)提供技術(shù)支持。通過測定枇杷花蜜和蜂蜜中低聚糖含量，發(fā)現(xiàn)花蜜經(jīng)蜜蜂的釀造轉(zhuǎn)化后，在蜂蜜中產(chǎn)生了種類更為豐富的低聚糖，且以吡喃葡糖基蔗糖為枇杷蜂蜜中特征性三糖。通過分析不同釀造天數(shù)枇杷蜂蜜中低聚糖含量變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)在蜂蜜釀造過程中，低聚糖含量處于動(dòng)態(tài)變化中，隨釀造天數(shù)延長低聚糖含量變化規(guī)律不同。二糖中，蔗糖含量下降，在釀造14 d時(shí)蔗糖含量降低至最低含量水平之后含量無顯著性差異；其他二糖含量均呈上升趨勢，松二糖等4種二糖含量在釀造14 d時(shí)達(dá)到最高，之后無顯著性差異；麥芽糖和黑曲霉二糖含量在釀造15 d時(shí)達(dá)到最高。三糖含量在釀造過程中呈無規(guī)律波動(dòng)變化，其中吡喃葡糖基蔗糖含量在蜂蜜釀造15 d時(shí)達(dá)到最高。本研究為制定枇杷蜂蜜的合理采收時(shí)間和鑒別其是否釀制完全提供數(shù)據(jù)支撐。