舒曉燕，周 鑫，蔣 維，任 玲，謝曉婷，侯大斌

（西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川 綿陽(yáng) 621000）

白芷為傘形科植物白芷（(Fisch. ex Hoffm.) Benth. et Hook. H.）或杭白芷（(Fisch. ex Hoffm.) Benth. et Hook. f. var.(Boiss.)Shan et Yuan）的干燥根，主產(chǎn)于四川、浙江、河南、河北等，是食藥兩用材料。其具有豐富的藥用和食用價(jià)值，主要成分為香豆素和揮發(fā)油類(lèi)。白芷揮發(fā)性成分種類(lèi)、數(shù)量繁多，主要含有十二碳醇、十五烯醇、萜品烯等，它是白芷活性物質(zhì)之一，藥理研究表明其具有抑制黑色素、鎮(zhèn)痛和抗過(guò)敏等作用。同時(shí)揮發(fā)性成分為白芷提供獨(dú)特的香氣成分，使白芷具有香白芷稱(chēng)譽(yù)，在護(hù)膚品、香料等方面也具有巨大的開(kāi)發(fā)和利用潛力。為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用白芷揮發(fā)油，可采用電子鼻（electronic nose，E-nose）與頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜（headspace solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）聯(lián)用技術(shù)對(duì)揮發(fā)性成分進(jìn)行定性識(shí)別，并定量分析，2 種技術(shù)已普遍應(yīng)用于食品、脂質(zhì)微粒自氧化及環(huán)境檢測(cè)中，是較為成熟的分析風(fēng)味物質(zhì)的手段。

高能電子束系高能電子加速器（10 MeV）發(fā)射出的電子束，與傳統(tǒng)Coγ射線(xiàn)輻照一樣具有殺菌滅蟲(chóng)、保鮮、改性等作用，且處理時(shí)間更短、效率更高、輻照均勻，不產(chǎn)生放射性廢物，廣泛應(yīng)用于食品、藥品、醫(yī)療器械等行業(yè)。目前還未有高能電子束輻照處理白芷，關(guān)于揮發(fā)性成分變化的相關(guān)研究。本實(shí)驗(yàn)利用高能電子束輻照處理白芷樣品，采用電子鼻結(jié)合HSSPME-GC-MS對(duì)其香氣及其呈香成分進(jìn)行分析鑒別，采用偏最小二乘判別分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）揮發(fā)性成分、電子鼻與GC-MS之間的關(guān)聯(lián)性，并通過(guò)主成分分析（principal component analysis，PCA）、聚類(lèi)分析（clustering analysis，CA）和線(xiàn)性判別分析（linear discriminant analysis，LDA）比較樣品輻照前后及不同輻照劑量處理白芷揮發(fā)性成分的異同，探明高能電子束輻照對(duì)白芷揮發(fā)性成分的影響規(guī)律，為白芷利用高能電子束輻照應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

白芷購(gòu)于四川省中興藥業(yè)有限公司，產(chǎn)地四川省遂寧市。經(jīng)西南科技大學(xué)藥用植物研究室侯大斌教授鑒定為傘形科植物白芷（(Fisch. ex Hoffm.)Benth. et Hook. H.）的干燥根。

1.2 儀器與設(shè)備

GJ-2高能電子加速器（10 MeV） 四川省眉山市彭州區(qū)潤(rùn)祥輻照有限公司；PEN3電子鼻 德國(guó)Airsense公司；SPME萃取手柄、65 μm PDMS/DVB SPME萃取頭賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；Saturn2100 GC-MS聯(lián)用儀 美國(guó)瓦里安技術(shù)中國(guó)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

將白芷樣品平整裝入PET/PE復(fù)合材料袋，輻照劑量設(shè)置為0（對(duì)照）、1、3、5、7、10 kGy，雙面輻照。樣品經(jīng)粉碎，過(guò)篩，密封保存，備用。

1.3.2 電子鼻檢測(cè)

稱(chēng)取1.0 g白芷粉末裝入15.0 mL頂空瓶中，室溫下插入電子鼻探頭吸取頂端空氣進(jìn)行測(cè)定。測(cè)試條件：載氣為高純空氣，進(jìn)氣流速600.0 mL/min；預(yù)采樣時(shí)間5.0 s，數(shù)據(jù)采集時(shí)間為120.0 s，采樣周期為1.0 s，自動(dòng)沖洗時(shí)間為100.0 s。電子鼻各傳感器信息見(jiàn)表1。

表1 PEN3型便攜式電子鼻傳感器性能描述Table 1 Performance description of PEN3 portable electronic nose sensors

1.3.3 HS-SPME法提取風(fēng)味物質(zhì)

選用65 μm PDMS/DVB萃取纖維頭在GC進(jìn)樣口活化30 min，活化溫度250 ℃?；罨蟛迦胙b有1.0 g白芷粉末的頂空瓶中，60 ℃水浴萃取30 min，然后將纖維萃取頭插入GC進(jìn)樣口解吸3 min。

1.3.4 GC-MS條件

GC條件：初始溫度80 ℃，保留1 min后，以6 ℃/min速率升溫至180 ℃，再以10 ℃/min速率升溫到220 ℃，保留8 min，進(jìn)樣口溫度250 ℃，SPME不分流，載氣（氦氣）流速1.0 mL/min。

MS條件：電子電離源；電離電壓70 eV；離子源溫度260 ℃；質(zhì)量掃描范圍30～600 u。

1.4 數(shù)據(jù)處理

1.4.1 PCA和LDA

取穩(wěn)定后第68～70秒的電子鼻傳感器數(shù)值信息，使用電子鼻系統(tǒng)自帶軟件Winmuster對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA和LDA。

1.4.2 GS-MS數(shù)據(jù)分析

用標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)NIST98進(jìn)行匹配對(duì)照解析，選用匹配度80%以上結(jié)果；采用峰面積歸一化法計(jì)算相對(duì)含量。GC-MS采用Excel處理數(shù)據(jù)、Origin 8.5.1繪圖、Simca13.0進(jìn)行PCA、CA、PLS-DA。

2 結(jié)果與分析

2.1 電子鼻測(cè)定結(jié)果

2.1.1 輻照前后白芷電子鼻特征氣味雷達(dá)指紋圖分析

電子鼻是根據(jù)一系列傳感器，結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)學(xué)方法獲取樣品中揮發(fā)性物質(zhì)的完整信息。提取10 個(gè)傳感器的特征值，選取68～70 s其中1 s繪制高能電子束不同劑量輻照處理的白芷電子鼻特征氣味雷達(dá)指紋圖，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 輻照前后白芷特征氣味雷達(dá)指紋圖Fig. 1 Characteristic odor radar fingerprints of Angelicae Dahuricae Radix before and after irradiation

雷達(dá)指紋圖反映了對(duì)白芷氣味最敏感的電子鼻傳感器，即7號(hào)傳感器（表征為硫化物）和9號(hào)傳感器（表征為芳香成分），推測(cè)白芷氣味中的主要物質(zhì)可能為硫化物和芳香類(lèi)物質(zhì)。由圖1可知，各輻照組（1～10 kGy）白芷樣品特征氣味高度重合，未區(qū)分出其差異，但與對(duì)照組（0 kGy）差異較大。輻照處理后，7號(hào)傳感器響應(yīng)值仍最大，9號(hào)傳感器響應(yīng)值未發(fā)生變化，表明白芷輻照后主要揮發(fā)性成分未發(fā)生改變；但6號(hào)傳感器響應(yīng)值增大，其表征為甲烷成分，即高能電子束輻照會(huì)使白芷氣味增加甲烷物質(zhì)。

2.1.2 PCA結(jié)果

PCA是將可能有相關(guān)性的變量以正交變換的方法轉(zhuǎn)為線(xiàn)性不相關(guān)變量，通過(guò)降維原始數(shù)據(jù)，找到最大貢獻(xiàn)率的因子，提取原始數(shù)據(jù)中最大的幾個(gè)特征向量為PC，并且通過(guò)二維圖體現(xiàn)樣品間的差異。

圖2 不同輻照劑量處理后白芷氣味PCA圖Fig. 2 PCA plot of Angelicae Dahuricae Radix odor after irradiation at different doses

由圖2可知，PC1和PC2的貢獻(xiàn)率分別為89.74%、8.54%，總貢獻(xiàn)率達(dá)98.28%，表明可以較好地反映輻照前后白芷揮發(fā)性氣味全部特征信息。各樣品界線(xiàn)清晰，不同處理間的揮發(fā)性氣體存在差異。0～3 kGy處理組在PC1與PC2距離較短，表明這3 個(gè)樣品相似度較高；5～10 kGy處理組在PC2及PC1距離較短，此3 個(gè)樣品相似度較高；3 kGy與5、10 kGy處理組距離較近，因此，需結(jié)合LDA進(jìn)一步探究不同樣品揮發(fā)性物質(zhì)的區(qū)別。

2.1.3 LDA結(jié)果

圖3 不同輻照劑量處理后白芷氣味的LDA圖Fig. 3 LDA plot of Angelicae Dahuricae Radix odor after irradiation at different doses

LDA是模式識(shí)別中的一種經(jīng)典算法，通過(guò)降維數(shù)據(jù)，凸顯類(lèi)間的差異，減小類(lèi)內(nèi)的差異，更好地分析樣品間的差異性。如圖3所示，PC1貢獻(xiàn)率為52.87%，PC2貢獻(xiàn)率為36.18%，總貢獻(xiàn)率為89.05%，能很好區(qū)分不同樣品。6 個(gè)處理樣品都有各自的香氣區(qū)域，所有的樣品根據(jù)PC1即橫坐標(biāo)跨度的不同可以完全分開(kāi)，即不同輻照劑量處理樣品香味物質(zhì)可以區(qū)分開(kāi)。與PCA相比，LDA的區(qū)分效果更好。結(jié)合圖2、3可以看出，0、1、3 kGy劑量輻照處理后的樣品氣味區(qū)域較為集中，3、5、7、10 kGy輻照處理后的樣品氣味區(qū)域較為集中，說(shuō)明風(fēng)味物質(zhì)相似；0～3 kGy和5～10 kGy樣品氣味區(qū)域在PCA縱坐標(biāo)和LDA橫坐標(biāo)上存在跨度，推測(cè)高于3 kGy劑量輻照對(duì)白芷氣味有較大影響。綜合可知，電子鼻能夠區(qū)分經(jīng)高能電子束不同劑量輻照處理的白芷樣品，將6 個(gè)實(shí)驗(yàn)組分為0～3 kGy和5～10 kGy兩類(lèi)，即低于5 kGy的輻照處理對(duì)白芷氣味無(wú)明顯影響。

2.2 白芷的GC-MS分析

2.2.1 主要香氣成分及相對(duì)含量

表2 白芷中揮發(fā)性成分的種類(lèi)及相對(duì)含量Table 2 Types and relative contents of volatile components in Angelicae Dahuricae Radix irradiated at different doses

為進(jìn)一步分析高能電子束輻照處理對(duì)白芷揮發(fā)性成分產(chǎn)生的影響，利用HS-SPEM-GC-MS聯(lián)用技術(shù)，采用峰面積歸一化法計(jì)算相對(duì)含量。由表2可知，對(duì)照組（0 kGy）的揮發(fā)性成分17 種，其中醛類(lèi)3 種、醇類(lèi)2 種、酯類(lèi)5 種、烴類(lèi)6 種、其他2 種。由各類(lèi)成分占比可知，酯、烴類(lèi)相對(duì)含量較高，占45.64%，是白芷主要風(fēng)味物質(zhì)，這與Zhao Aihong、李偉等對(duì)白芷揮發(fā)油的研究結(jié)果相似。烴是碳?xì)浠衔锏慕y(tǒng)稱(chēng)，可以產(chǎn)生原生的、濃郁的香氣為白芷提供了豐富的香味。其次，醛、醇類(lèi)成分也占有較大比例，這類(lèi)化合物一般是脂質(zhì)的降解產(chǎn)物，具有獨(dú)特的香氣。

經(jīng)高能電子束1～10 kGy劑量輻照后，白芷的揮發(fā)性成分分別為54、64、59、53、58 種，物質(zhì)種類(lèi)明顯增多；烴類(lèi)成分比例仍最大，分別為21.99%、38.45%、23.24%、23.45%、33.86%；酯類(lèi)成分相對(duì)含量下降；隨著輻照劑量增大，醛類(lèi)物質(zhì)相對(duì)含量增加；產(chǎn)生了新物質(zhì)——酮類(lèi)。研究表明酯類(lèi)物質(zhì)可轉(zhuǎn)化為醛、酮類(lèi)，此類(lèi)物質(zhì)可能引起“輻照味”，其含量越高，即輻照異味愈濃烈，高劑量輻照組與低劑量組樣品氣味有明顯差異。此分析結(jié)果與電子鼻檢測(cè)結(jié)果一致，表明“輻照味”的來(lái)源極大可能為醛、酮類(lèi)物質(zhì)，兩者間的具體聯(lián)系還需進(jìn)一步研究。不同輻照處理樣品中揮發(fā)性物質(zhì)名稱(chēng)及相對(duì)含量見(jiàn)表3。

表3 不同輻照劑量處理下白芷的揮發(fā)性物質(zhì)分析結(jié)果Table 3 Relative contents of volatile substances in Angelicae Dahuricae Radix irradiated at different doses

續(xù)表3

續(xù)表3

續(xù)表3

續(xù)表3

由表3可知，輻照前白芷主要成分為2-乙基己基酯乙酸（5.16%）、四甲基吡嗪（6.12%）、正十四碳烷（7.22%）、1-乙烯基-1-甲基-2,4-雙(1-甲基乙烯基)-[1-(1,2,4)]-環(huán)己烷（7.16%）、丁香油烴（7.05%）、正十三烷（6.17%）等烷烴類(lèi)物質(zhì)，與Chen Qinhua等對(duì)白芷揮發(fā)性物質(zhì)的研究結(jié)果一致。樣品經(jīng)高能電子束不同劑量輻照后，2,3-丁二醇、辛醛、十二醛、壬醛、四甲基吡嗪仍能檢出，其中2,3-丁二醇相對(duì)含量下降、十二醛相對(duì)含量上升；其他13 種成分中，(1)-2,6,6-三甲基雙環(huán)[3.1.1]庚-2-烯在3、5 kGy輻照組中未檢出，在1、7、10 kGy輻照組中檢出，但相對(duì)含量較小，可能是高能電子束輻照未完全輻解此物質(zhì)；其余12 種酯、烴類(lèi)物質(zhì)在輻照組中未檢出，推測(cè)高能電子束對(duì)酯、烴類(lèi)物質(zhì)敏感，使其完全輻解。

輻照后白芷揮發(fā)性成分比輻照前更為豐富，可能是白芷中的一些物質(zhì)經(jīng)高能電子束輻照后發(fā)生裂變反應(yīng)，產(chǎn)生了新的物質(zhì)。1 kGy輻照組中主要物質(zhì)為石竹烯（9.11%），3 kGy輻照組主要為-欖香烯（13.92%），5 kGy為四甲基吡嗪（9.08%），7 kGy為十二醛（11.99%）；10 kGy為十二醇（15.14%）。輻照后樣品中增加了烴類(lèi)等香氣成分，可能是由于芳香族氨基酸較其他氨基酸對(duì)輻照更為敏感，易發(fā)生脫氨基、氧化和脫羧反應(yīng)。

輻照組產(chǎn)生了酮類(lèi)物質(zhì)，此類(lèi)化合物多由不飽和脂肪酸氧化、熱降解、氨基酸降解或微生物氧化產(chǎn)生。由此可推斷其來(lái)源可能是2-乙基己基酯乙酸、丁基2-乙基己基酯碳酸、1-乙烯基-1-甲基-2,4-雙(1-甲基乙烯基)-[1-(1,2,4)]-環(huán)己烷、2,2,4-三甲基-1,3-戊二醇三異丁酸酯等酯烴類(lèi)物質(zhì)，化學(xué)結(jié)構(gòu)中的C—O、O—H等化學(xué)鍵經(jīng)輻照后斷裂，形成C＝O雙鍵，從而生成酮類(lèi)化合物。

2.2.2 揮發(fā)性物質(zhì)PCA結(jié)果

根據(jù)因子的特征值、累計(jì)貢獻(xiàn)率及碎石圖拐點(diǎn)的變化趨勢(shì)等因素確定PC，且根據(jù)特征值大于1分析PC載荷矩陣與特征向量。如表4所示，2 個(gè)PC即可完全反映樣品的主要特征信息。

表4 PCA解釋總差異Table 4 Total variance explained

表5 PC載荷矩陣與特征向量Table 5 Principal component loading matrix and eigenvectors

根據(jù)PC與提取的特征向量之間的關(guān)系，可以得到2 個(gè)PC與原變量之間的線(xiàn)性關(guān)系，由表5可得回歸方程：

以PC1、PC2的方差貢獻(xiàn)率為權(quán)重系數(shù)，引入綜合評(píng)價(jià)函數(shù)建立白芷風(fēng)味物質(zhì)識(shí)別評(píng)價(jià)模型，得到PC=0.513 52 PC1+0.259 81 PC2。利用權(quán)重系數(shù)將高能電子束不同劑量輻照組進(jìn)行排名分析，計(jì)算結(jié)果如表6所示。

表6 白芷綜合評(píng)分得分及分類(lèi)Table 6 Comprehensive scores and classification of Angelicae Dahuricae Radix irradiated at different doses

由表6可知，0、1、3 kGy輻照劑量組樣品綜合得分均大于0 分，5、7、10 kGy輻照劑量組樣品綜合得分均小于0 分，表明0～3 kGy劑量輻照組白芷樣品的揮發(fā)性成分較為接近；5～10 kGy劑量輻照組樣品揮發(fā)性成分較為接近，與電子鼻分析結(jié)果一致。可以推測(cè)高能電子束輻照劑量高于3 kGy時(shí)，白芷的揮發(fā)性成分可能會(huì)發(fā)生明顯變化。

2.2.3 GC-MS的CA結(jié)果

CA是使用平均聯(lián)接（組間）的譜系圖、重新標(biāo)度的距離聚類(lèi)組合，將樣品分成多個(gè)類(lèi)的分析方法，分類(lèi)更全面具體。以6 類(lèi)揮發(fā)性成分為變量，對(duì)高能電子束不同劑量輻照的白芷樣品揮發(fā)性成分進(jìn)行CA，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 不同劑量輻照白芷的揮發(fā)性成分CA圖Fig. 4 Cluster analysis dendrogram of Angelicae Dahuricae Radix irradiated at different doses

由圖4可知，當(dāng)橫坐標(biāo)距離為10 時(shí)，6 個(gè)實(shí)驗(yàn)組可以分為2 個(gè)類(lèi)群，分別是0～7 kGy劑量（5 個(gè)實(shí)驗(yàn)組）輻照組歸為1 個(gè)類(lèi)群，10 kGy輻照組單獨(dú)歸為1 個(gè)類(lèi)群。當(dāng)類(lèi)間距為5 時(shí)，5 個(gè)實(shí)驗(yàn)組被分為3 類(lèi)，7 kGy輻照組單獨(dú)為1 個(gè)類(lèi)群，5 kGy輻照組單獨(dú)為1 個(gè)類(lèi)群，0～3 kGy此3 個(gè)實(shí)驗(yàn)組為1 個(gè)類(lèi)群，這與PCA結(jié)果一致。

CA可根據(jù)刻度的不同獲得多種分類(lèi)結(jié)果，而PCA根據(jù)PC得分僅獲得一種分類(lèi)結(jié)果，將PCA、CA及電子鼻定性分析相結(jié)合，可以較全面地分析高能電子束輻照處理對(duì)白芷香氣成分的影響。

2.3 電子鼻與GC-MS的PLS-DA結(jié)果

圖5 揮發(fā)性物質(zhì)電子鼻傳感器PLS-DA（A）和置換檢驗(yàn)圖（B）Fig. 5 PLS-DA plot of volatile substances using E-nose sensors (A) and permutation test (B)

PLS-DA是對(duì)不同處理樣品的特性分別進(jìn)行訓(xùn)練，產(chǎn)生訓(xùn)練集并檢驗(yàn)訓(xùn)練集的可信度的多變量統(tǒng)計(jì)分析方法。選取電子鼻10 個(gè)傳感器與GC-MS檢測(cè)出的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行PLS-DA，結(jié)果見(jiàn)圖5、6。

驗(yàn)證結(jié)果中的和與縱軸的截距分別為0.258和-0.326，鑒別模型最右端的原始值大于左邊任何一個(gè)變量的值，說(shuō)明所構(gòu)建的PLS-DA有較好的穩(wěn)定性和可靠性。由圖5可知，W3S、W3C、W6S、W2C、W5S傳感器與酯烴類(lèi)物質(zhì)相關(guān)性較高，此類(lèi)傳感器能較好的識(shí)別酯烴類(lèi)物質(zhì)，但酯烴類(lèi)閾值較高，在傳感器中響應(yīng)值應(yīng)較小，雷達(dá)圖結(jié)果符合PLS-DA結(jié)果。表明電子鼻對(duì)白芷揮發(fā)性成分區(qū)分識(shí)別度較好。

3 結(jié) 論

基于電子鼻和GC-MS技術(shù)，研究高能電子束輻照處理對(duì)白芷樣品中揮發(fā)性成分的影響，并采用PCA、LDA、CA和PLS-DA統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)。電子鼻能較好地區(qū)分不同劑量輻照處理后的白芷氣味，GC-MS技術(shù)可在電子鼻的基礎(chǔ)上進(jìn)一步分析白芷揮發(fā)性成分種類(lèi)、相對(duì)含量的變化，其分析結(jié)果一致。白芷中主要揮發(fā)性成分為酯烴類(lèi)化合物，高能電子束輻照會(huì)使白芷產(chǎn)生新的化合物——酮類(lèi)物質(zhì)，但不高于3 kGy劑量輻照對(duì)白芷揮發(fā)性成分無(wú)明顯影響。本實(shí)驗(yàn)為高能電子束輻照對(duì)白芷揮發(fā)性成分的影響提供了理論參考，通過(guò)研究揮發(fā)性成分的變化可知不高于3 kGy劑量為輻照適宜劑量，但對(duì)其具體成分的影響課題組還在進(jìn)一步研究中。