孫亞寧，楊蘇珍，楊繼飛，胡驍飛，陳鑫鑫，張穎碩，鄧瑞廣，張改平,2,*

（1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450002）

嘔吐毒素（deoxynivalenol，DON），又稱脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，主要由曲霉、青霉及鐮刀菌產(chǎn)生的單端孢霉烯族真菌毒素，在谷物、谷物制備及動(dòng)物飼料中廣泛存在。DON具有胃腸毒性、細(xì)胞毒性、免疫毒性等，且與其他真菌毒素具有協(xié)同毒性，嚴(yán)重危害動(dòng)物和人類身體健康。GB 2761—2017《食品中真菌毒素限量》中對(duì)谷物及其制品中DON的允許限量為不高于1 000 μg/kg?？刂艱ON危害的最有效手段是能快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)DON污染。DON常用的檢測(cè)方法有薄層色譜法、高效液相色譜法、表面增強(qiáng)拉曼光譜法、電化學(xué)法傳感器法及免疫學(xué)檢測(cè)方法等。

免疫層析法由于具有快速、靈敏、特異、穩(wěn)定、成本低，特別是操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，已經(jīng)普遍應(yīng)用于真菌毒素的快速檢測(cè)。Kong Dezhao等建立了DON膠體金免疫層析試紙，在谷物及飼料中的檢出限為50～750 μg/kg。由于傳統(tǒng)的膠體金免疫層析試紙靈敏度已經(jīng)不能滿足檢測(cè)的需要，越來(lái)越多的新型標(biāo)記材料（特別是熒光納米材料）逐漸應(yīng)用于免疫層析試紙中提高檢測(cè)靈敏度。Huang Xinyu等研制了一種基于花狀金納米顆粒的免疫層析試紙條，同時(shí)檢測(cè)中藥中伏馬菌素B（fumonisin B，F(xiàn)B）和DON，檢測(cè)靈敏度為50 μg/kg。Jin Yongpeng等建立了基于近紅外熒光染料800CW和680LT的免疫層析試紙，同時(shí)檢測(cè)玉米中的玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）和DON，檢出限分別為0.55 μg/kg和3.8 μg/kg。Goryacheva等建立了一種基于硅烷化量子點(diǎn)免疫層析試紙，同時(shí)檢測(cè)谷物中的ZEN和DON，檢出限分別為40 μg/kg和400 μg/kg。Dong Haowei等建立了基于聚苯乙烯熒光微球標(biāo)記的免疫層析試紙，檢測(cè)范圍為1～100 ng/mL，在玉米和飼料中的檢出限分別為0.206 ng/mL和0.216 ng/mL。提高檢測(cè)靈敏度的另一個(gè)方向是利用磁性納米材料實(shí)現(xiàn)樣品中靶標(biāo)物的富集。Han Qiqi等基于金屬-有機(jī)框架的多靶點(diǎn)免疫磁珠實(shí)現(xiàn)了食品中DON、ZEN、T-2毒素的富集。Zhuo Siqi等利用磁性光子晶體微球?qū)崿F(xiàn)樣品中DON的富集，但是磁顆粒對(duì)樣品富集后通常需要復(fù)雜的洗脫過(guò)程才能用于檢測(cè)。

磁熒光納米復(fù)合材料即具有磁性可以富集待測(cè)物又同時(shí)具有熒光特性實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大，已廣泛應(yīng)用于生物傳感、藥物輸送、臨床呈像等領(lǐng)域，而在免疫檢測(cè)領(lǐng)域還處于起步階段。目前鮮見磁熒光免疫層析試紙?jiān)谡婢舅貦z測(cè)方面的報(bào)道。由于磁性納米顆粒與熒光微球結(jié)合后會(huì)造成熒光微球的猝滅，目前磁熒光納米顆粒需要復(fù)雜的制備過(guò)程，不利于廣泛應(yīng)用。

本研究利用磁性納米顆粒和綠色熒光蛋白及DON單克隆抗體一步法制備磁性熒光抗體探針，建立DON磁熒光免疫層析試紙，并將其應(yīng)用于谷物中DON污染物的檢測(cè)中；同時(shí)建立DON膠體金免疫層析試紙，對(duì)比兩種方法的靈敏度，判定新模式的有效性。本研究采用一步法制備磁性熒光抗體探針應(yīng)用于的免疫層析檢測(cè)技術(shù)中，同步實(shí)現(xiàn)樣品的富集及熒光信號(hào)的檢測(cè)，從而提高檢測(cè)靈敏度，促進(jìn)磁熒光納米顆粒在免疫檢測(cè)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，為更靈敏的免疫層析檢測(cè)方法提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

DON 青島普瑞邦生物工程有限公司；檸檬酸三鈉、綠色熒光蛋白 北京索萊寶科技有限公司；牛血清白蛋白（bull serum albumin，BSA） 英國(guó)BDH公司；黃曲霉毒素B（aflatoxin B，AFB）、ZEN、赭曲霉毒素（ochratoxin A，OTA）、FB、T-2、三氯化鐵、葡萄球菌A蛋白（staphylococcal protein A，SPA）、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽（1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride，EDC）美國(guó)Sigma公司；Tween-20 德國(guó)Merck公司；硝酸纖維素膜（NC膜，HF13502S25，（30×2.5）cm）、玻璃纖維棉、吸水紙、支撐底板 德國(guó)Millipore公司；DON單克隆抗體由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自制；實(shí)驗(yàn)用超純水由實(shí)驗(yàn)室自制；氫氧化鈉等其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

AE260電子天平 德國(guó)Mettler公司；JEM-1400透射電子顯微鏡 日本電子株式會(huì)社；4-16K離心機(jī)德國(guó)Sigma公司；ESE-Quant FLUO熒光讀條儀 德國(guó)QIAGEN公司；RH Digital KT/C磁力攪拌器 德國(guó)IKA公司；Zetasizer Nano ZS90型動(dòng)態(tài)散射粒度分析儀 英國(guó)Malvern公司；SpectraMax i3x多功能酶標(biāo)儀 美國(guó)Molecular Devices公司；XYZ-3000型噴膜噴金儀、CM-4000型斬切機(jī)、TSR3000讀條儀 美國(guó)Bio-Dot公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；ZHS-SP低露點(diǎn)轉(zhuǎn)輪除濕機(jī) 無(wú)錫奧波公司。

1.3 方法

1.3.1 羧基修飾的超順磁納米顆粒的制備及表征

采用溶劑熱法制備粒徑為100～300 nm的超順磁顆粒。稱取3 組三氯化鐵（0.675、0.675、0.844 g）及檸檬酸鈉（0.324、0.245、0.245 g），分別加入20 mL乙二醇中，于加熱磁力攪拌器上，90 ℃加熱攪拌至溶解，再分別加入1.2 g醋酸鈉，繼續(xù)加熱攪拌至完全溶解，然后將得到棕色溶液轉(zhuǎn)移至100 mL聚四氟乙烯內(nèi)襯的反應(yīng)釜中，200 ℃烘箱加熱10 h，自然冷卻后產(chǎn)物呈黑褐色，用無(wú)水乙醇、乙醇-超純水（1∶1，/）、超純水清洗3 次，超純水定容至20 mL，分裝2 mL/瓶，冷凍干燥密封，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

選用Zetasizer Nano ZS90型動(dòng)態(tài)散射粒度分析儀分析及透射電子顯微鏡進(jìn)行表征。利用強(qiáng)力磁鐵鑒定超順磁顆粒的磁性：取1 mL磁顆粒于玻璃瓶中，放于強(qiáng)力磁鐵上觀察磁顆粒吸附情況。

1.3.2 一步法制備DON磁熒光抗體探針

選用活潑酯法將羧基磁顆粒與綠色熒光蛋白及DON單抗進(jìn)行一步法偶聯(lián)制備磁熒光抗體探針。取2號(hào)磁顆粒200 μL加入20 μL EDC（1 mg/mL）及40 μL NHS（1 mg/mL）室溫避光攪拌反應(yīng)3 h為A液。取CBS 200 μL加入綠色熒光蛋白2.5 μg、DON單抗2.5 μg，室溫避光攪拌反應(yīng)1 h，在強(qiáng)力磁鐵吸附下分離磁顆粒，去上清液，200 μL重懸液（0.02 mol/L的NaBO·10HO溶液含1% BSA、3%海藻糖、0.05%疊氮鈉）重懸得到磁熒光抗體探針。偶聯(lián)過(guò)程中優(yōu)化了綠色熒光蛋白及DON單克隆抗體的加入量，綠色熒光蛋白與DON單克隆抗體按1∶1加入，200 μL磁顆粒中蛋白加入量分別為5 μg（2.5 μg+2.5 μg）、2.5 μg（1.25 μg+1.25 μg）、1.25 μg（0.625 μg+0.625 μg）、0.625 μg（0.313 μg+0.313 μg），偶聯(lián)結(jié)束后用強(qiáng)力磁鐵吸附磁顆粒，多功能酶標(biāo)儀分別檢測(cè)偶聯(lián)后上清液與偶聯(lián)前的蛋白溶液中熒光信號(hào)（激發(fā)波長(zhǎng)430 nm、發(fā)射波長(zhǎng)510 nm），確定較優(yōu)蛋白加入量。用強(qiáng)力磁鐵檢測(cè)磁熒光抗體探針的磁性；將磁熒光抗體探針加于重懸液中用NC膜上包被有SPA的試紙進(jìn)行檢測(cè)，目察SPA攔截探針情況，從而判斷磁珠與抗體偶聯(lián)是否成功；然后通過(guò)熒光讀條儀掃描試紙熒光信號(hào)，鑒定探針熒光性能。

1.3.3 DON膠體金標(biāo)記抗體探針制備

為驗(yàn)證磁熒光免疫層析試紙的有效性，利用相同的免疫學(xué)試劑建立膠體金免疫層析試紙。

1.3.3.1 膠體金制備

以檸檬酸三鈉為還原劑制備膠體金。取100 mL 超純水加入三角瓶中，于加熱磁力攪拌器上加熱，加入1 mL 1%氯金酸溶液加熱至沸騰，然后攪拌狀態(tài)下迅速加入1.6 mL 1%檸檬酸三鈉溶液，溶液顏色經(jīng)過(guò)透明-黑色-深紅色-酒紅色變化，待顏色不再變化時(shí)再加熱5 min，室溫冷卻后，用超純水將膠體金定容至100 mL，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3.2 膠體金標(biāo)記單克隆抗體

取DON單克隆抗體用超純水稀釋為2 mg/mL備用。取稀釋杯6 孔，分別加入10 μL超純水鋪底，于第一孔中加入稀釋好的單克隆抗體10 μL，倍比稀釋至最后一孔。取膠體金用0.2 mol/L的KCO溶液調(diào)節(jié)pH值為8.2，然后加入上述稀釋杯中，125 μL/孔，反應(yīng)5 min，加入125 μL/孔10% NaCl，觀察膠體金顏色變化，選擇能保持膠體金顏色不變的最低抗體濃度為抗體標(biāo)記濃度。

取10 mL膠體金0.2 mol/L的KCO溶液調(diào)節(jié)pH值為8.2。將DON單克隆抗體，用超純水稀釋為1 mg/mL，取60 μL緩慢加入到調(diào)好pH值的膠體金中，邊加邊攪拌，然后室溫反應(yīng)70 min，然后再加入1 mL 10% BSA溶液，室溫封閉10 min，4 ℃、12 000 r/min離心30 min，棄上清液，沉淀用4 mL重懸液重懸，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 DON免疫層析試紙的組裝

1.3.4.1 免疫層析試紙各組分的制備

取NC膜分別在檢測(cè)線（T線）及質(zhì)控線（C線）位置，用XYZ-3000型噴膜噴金儀按0.9 μL/cm的量噴涂0.2 mg/mL DON-BSA及0.2 mg/mL的SPA，42 ℃干燥1 h，避光密封備用。

結(jié)合墊制備：將0.02 mol/L的NaBO·10HO溶液（含5% BSA、0.1% PVP-10、0.1% Triton X-100、0.05%疊氮鈉），用XYZ-3000型噴膜噴金儀按8 μL/cm的量噴涂在玻璃纖維棉（8 mm×30 mm）上，42 ℃干燥50 min制備結(jié)合墊。將膠體金標(biāo)記DON單克隆抗體用XYZ-3000型噴膜噴金儀按6.5 μL/cm的量噴涂在結(jié)合墊上，42 ℃干燥50 min制備膠金墊，避光密封備用。

樣品墊制備：將玻璃纖維棉（16 mm×30 mm）浸泡于0.1 mol/L的PB溶液（pH 7.4，含1% BSA、0.3%Tween 20、5%海藻糖、0.05%疊氮鈉）中5 min后取出平鋪于干燥箱內(nèi)，42 ℃干燥4 h制備樣品墊。

1.3.4.2 試紙組裝

DON膠體金免疫層析試紙組裝：取制備好的NC膜、膠金墊、樣品墊及吸水紙依次粘貼于支撐底板上，各組分間重疊1～2 mm，用切割機(jī)切成3.0 mm的試紙加干燥劑密封保存。

DON磁熒光免疫層析試紙組裝：取制備好的NC膜、結(jié)合墊、樣品墊及吸水紙依次粘貼于支撐底板上，各組分間重疊1～2 mm，用切割機(jī)切成3.0 mm的試紙加干燥劑密封保存，搭配DON磁熒光抗體探針使用。

1.3.5 試紙的檢測(cè)方法

DON膠體金免疫層析試紙的檢測(cè)方法：取100 μL樣品于反應(yīng)杯中，插入膠體金免疫層析試紙檢測(cè)，10 min后觀察結(jié)果。

DON磁熒光免疫層析試紙的檢測(cè)方法：取300 μL樣品于反應(yīng)杯中，然后加入1 μL磁熒光抗體探針，孵育10 min后，用強(qiáng)力磁鐵分離，100 μL重懸液重懸后插入磁熒光免疫層析試紙檢測(cè)，10 min后觀察結(jié)果。

1.3.6 試紙靈敏度檢測(cè)

用重懸液配制DON質(zhì)量濃度分別為1 000、500、250、125、62.5 ng/mL及40、20、10、5、2.5 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液用于檢測(cè)試紙敏感性，膠體金免疫層析試紙通過(guò)裸眼及TSR3000讀條儀判定結(jié)果；磁熒光免疫層析試紙通過(guò)熒光讀條儀判定結(jié)果，兩種試紙條均根據(jù)掃描峰面積，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量檢測(cè)，計(jì)算50%抑制濃度（IC）衡量其靈敏度，以10%抑制濃度為試紙條的檢出限。

1.3.7 試紙?zhí)禺愋詸z測(cè)

選取常見真菌毒素AFB、OTA、ZEN、FB、T-2作為交叉反應(yīng)靶標(biāo)物，各靶標(biāo)物用甲醇配制成1 mg/mL母液，用相應(yīng)稀釋液稀釋為10 μg/mL。分別用膠體金免疫層析試紙及磁熒光免疫層析試紙檢測(cè)，確定試紙的交叉反應(yīng)率，評(píng)價(jià)試紙?zhí)禺愋浴?/p>

1.3.8 DON磁熒光試紙熒光信號(hào)穩(wěn)定性檢測(cè)

用磁熒光試紙檢測(cè)重懸液，10 min后通過(guò)熒光讀條儀讀取試紙T線熒光信號(hào)，每隔5 min讀取1 次，至反應(yīng)40 min，通過(guò)峰面積分析熒光信號(hào)的穩(wěn)定性。

1.3.9 加標(biāo)樣品檢測(cè)

選用PBS配制DON標(biāo)準(zhǔn)溶液100 μg/mL，取陰性小麥樣品5 份，粉碎后加入DON標(biāo)準(zhǔn)品，配制DON含量為1 000 μg/kg的小麥陽(yáng)性樣品（國(guó)標(biāo)限量）。小麥陽(yáng)性樣品各取1 g/份于5 mL離心管中，加入2 mL PBS充分振蕩提取15 min，10 000 r/min離心3 min，上清液稀釋后用于DON磁熒光試紙檢測(cè)，每份樣品重復(fù)檢測(cè)3 次求取平均值計(jì)算小麥樣品中所含DON質(zhì)量濃度，計(jì)算添加回收率及變異系數(shù)，評(píng)價(jià)DON磁熒光免疫層析試紙的準(zhǔn)確性及精密度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

從檢測(cè)儀器中導(dǎo)出數(shù)據(jù)及圖片，采用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 超順磁顆粒的表征

分別調(diào)整反應(yīng)體系中三氯化鐵及檸檬酸鈉使用量，改變磁性顆粒的粒徑，結(jié)果見表1，保持整個(gè)體系其他成分不變時(shí)，磁顆粒粒徑隨著反應(yīng)體系中三氯化鐵所占比例增加磁顆粒的粒徑增大。磁顆粒分布見圖1，結(jié)合圖1及表1結(jié)果顯示，1號(hào)磁顆粒的分布峰更窄，標(biāo)準(zhǔn)偏差更小，從而說(shuō)明1號(hào)磁顆粒徑均一性更好。對(duì)1號(hào)磁性顆粒進(jìn)行透射電鏡掃描結(jié)果見圖2，結(jié)果顯示磁納米顆粒呈現(xiàn)規(guī)則的球體。磁力鑒定實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：在外加磁場(chǎng)作用下，磁顆?？稍? min內(nèi)被完全吸附于瓶底，說(shuō)明制備的磁顆粒具有較好的磁性，可以用于后期靶標(biāo)物的富集檢測(cè)。

表1 磁性顆粒粒徑變化規(guī)律Table 1 Particle size variation of magnetic microspheres

圖1 超順磁納米顆粒的粒徑分布Fig. 1 Particle size distribution of superparamagnetic nanospheres

圖2 1號(hào)超順磁顆粒的透射電子顯微鏡掃描圖Fig. 2 TEM image of superparamagnetic microspheres

2.2 DON磁熒光抗體探針鑒定及優(yōu)化

磁熒光抗體探針的磁性鑒定結(jié)果見圖3A，結(jié)果顯示在外加磁場(chǎng)作用下磁顆粒在1 min內(nèi)可以完全被吸附于反應(yīng)杯底部，說(shuō)明探針具有很好的磁性；探針免疫學(xué)及熒光性能鑒定結(jié)果見圖3B及3C，結(jié)果顯示磁熒光抗體探針可以被NC膜上固定的SPA攔截，說(shuō)明磁顆粒與DON單克隆抗體偶聯(lián)成功，且具有很好的活性；磁熒光抗體探針的熒光特性鑒定結(jié)果見圖3C，將圖3B中試紙用熒光讀條儀掃描，結(jié)果顯示，在SPA攔截線位置有較強(qiáng)的熒光信號(hào)。綜上所述本實(shí)驗(yàn)通過(guò)一步法偶聯(lián)的DON磁熒光抗體探針制備成功。

圖3 DON磁熒光抗體探針的鑒定Fig. 3 Identification of DON magnetic fluorescent antibody probe

DON磁熒光抗體探針制備過(guò)程中優(yōu)化了綠色熒光蛋白及DON單克隆抗體的加入量，結(jié)果見圖4。當(dāng)200 μL磁珠中加入蛋白量低于1.25 μg時(shí)，磁吸附上清液中熒光信號(hào)完全消失（吸附接近100%），隨著蛋白量的增加，磁珠吸附熒光值快速增加，吸附比逐漸下降。當(dāng)?shù)鞍准尤肓窟_(dá)到5 μg時(shí)，吸附比僅為40.87%，有超過(guò)一半的熒光信號(hào)殘留于上清液中，說(shuō)明蛋白加入已經(jīng)過(guò)量，但5 μg時(shí)吸附熒光值遠(yuǎn)大于2.5 μg時(shí)，因此確定每200 μL磁珠中加入5 μg蛋白為較優(yōu)蛋白量。

圖4 DON磁熒光抗體探針標(biāo)記蛋白加入量?jī)?yōu)化Fig. 4 Optimization of protein concentrations for DON magnetic fluorescent antibody probe

2.3 試紙靈敏度的檢測(cè)

DON磁熒光免疫層析試紙裸眼觀測(cè)結(jié)果見圖5A，用熒光讀條儀掃描獲得熒光曲線見圖5B，利用峰面積值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為-0.562+0.921，=0.990，經(jīng)計(jì)算試紙定量的IC為5.611 ng/mL，檢出限為1.089 ng/mL；DON膠體金免疫層析試紙靈敏度的結(jié)果見圖6，裸眼檢測(cè)靈敏度為500 ng/mL（圖6A）；利用讀條儀掃描灰度曲線為圖6B，根據(jù)峰面積繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為-0.543+1.485，=0.991，經(jīng)計(jì)算試紙定量的IC為65.16 ng/mL，檢出限為11.94 ng/mL。比較兩種方法的IC，結(jié)果顯示DON磁熒光免疫層析試紙是膠體金免疫層析試紙靈敏度的10.96 倍。

圖5 磁熒光免疫層析試紙靈敏度Fig. 5 Sensitivity of magnetic fluorescent immunochromatographic test strip

圖6 DON膠體金免疫層析試紙靈敏度Fig. 6 Sensitivity of colloidal gold immunochromatographic test strip

2.4 試紙?zhí)禺愋缘臋z測(cè)

表2 DON免疫層析試紙?zhí)禺愋澡b定結(jié)果Table 2 Specificity identification of test strips

表2顯示：DON膠體金免疫層析試紙與常見真菌毒素AFB、OTA、ZEN、FB、T-2交叉反應(yīng)率低于0.65%，DON磁熒光免疫層析試紙與常見真菌毒素AFB、OTA、ZEN、FB、T-2交叉反應(yīng)率低于0.06%，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)建立的兩種DON免疫層析試紙具有很好的特異性。

2.5 DON磁熒光試紙熒光信號(hào)穩(wěn)定性檢測(cè)

由于DON磁熒光免疫層析試紙跑板需要8～10 min，為了在干凈的背景下觀測(cè)熒光信號(hào)，因此選擇10 min后進(jìn)行磁熒光信號(hào)穩(wěn)定性檢測(cè)，結(jié)果見圖7，熒光信號(hào)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)呈明顯下降的趨勢(shì)。因此應(yīng)嚴(yán)格控制試紙結(jié)果判定時(shí)間，在試紙檢測(cè)10 min左右讀取結(jié)果。

圖7 磁熒光試紙熒光信號(hào)穩(wěn)定性Fig. 7 Stability of fluorescence signal of magnetic fluorescent test strip

2.6 DON磁熒光試紙加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

檢測(cè)DON加標(biāo)陽(yáng)性小麥樣品5 份，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。添加回收率在81.447%～98.558%之間，平均值為87.378%；變異系數(shù)在14.462%～19.662%之間，平均值為17.351%，均小于20%，說(shuō)明該檢測(cè)方法具有很好的準(zhǔn)確性和精密度。

表3 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=3）Table 3 Recoveries of magnetic fluorescent immunochromatographic test strip for DON in spiked wheat samples (n = 3)

3 討 論

盡管熒光免疫層析試紙快速檢測(cè)技術(shù)、免疫磁珠分離技術(shù)和磁性熒光復(fù)合材料制備技術(shù)已經(jīng)非常成熟且被廣泛應(yīng)用，但綜合以上技術(shù)的磁熒光免疫層析檢測(cè)還鮮有報(bào)道，本研究將超順磁顆粒與綠色熒光蛋白偶聯(lián)制備磁性熒光納米復(fù)合材料作為標(biāo)記物應(yīng)用于免疫層析試紙中，構(gòu)建磁熒光免疫層析試紙技術(shù)模式，該模式兼具了免疫反應(yīng)的特異性、磁顆粒的富集作用及熒光信號(hào)的高靈敏度，并成功應(yīng)用于小麥中DON的檢測(cè)，為高靈敏、更準(zhǔn)確定量的免疫學(xué)快速檢測(cè)提供技術(shù)啟示及支撐。

在磁熒光免疫層析試紙檢測(cè)時(shí)，將1 μL磁熒光抗體探針加入到300 μL的樣品中反應(yīng)，在外加磁場(chǎng)的作用下回收。由于投入的磁顆粒探針量較少，當(dāng)樣品體積超過(guò)300 μL后磁熒光抗體探針回收較困難，因此選擇1 μL探針加入300 μL樣品進(jìn)行檢測(cè)，100 μL重懸液重懸，等于將樣品3 倍富集。選擇磁性探針不僅可以濃縮樣品，而且探針回收后統(tǒng)一用重懸液重懸，大大降低了試紙檢測(cè)過(guò)程中不同樣本的基質(zhì)效應(yīng)，讓檢測(cè)結(jié)果更準(zhǔn)確。

由于超順磁顆粒與熒光納米材料偶聯(lián)后出現(xiàn)熒光猝滅現(xiàn)象，因此在磁熒光納米材料的制備過(guò)程中需要硅化處理及偶聯(lián)等復(fù)雜的制備過(guò)程，技術(shù)門檻很高，限制了推廣應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)選取的綠色熒光蛋白，熒光性質(zhì)穩(wěn)定，從藍(lán)光到紫外線都能使其激發(fā)，發(fā)出綠色螢光，采用一步法將磁顆粒、綠色熒光蛋白與抗體偶聯(lián)制備磁熒光抗體探針，大大簡(jiǎn)化了磁熒光抗體探針的制備過(guò)程，降低了磁熒光納米材料的技術(shù)門檻，為其更廣泛的應(yīng)用于免疫層析檢測(cè)中提供技術(shù)手段。

4 結(jié) 論

采用溶劑熱法成功制備了超順磁顆粒，并采用一步法將其與綠色熒光蛋白及DON單克隆抗體偶聯(lián)獲得磁熒光抗體探針。通過(guò)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)參數(shù)，分別制備了DON磁熒光免疫層析試紙及DON膠體金免疫層析試紙，DON磁熒光免疫層析試紙可以實(shí)現(xiàn)樣品的富集及熒光信號(hào)檢測(cè)，靈敏度是DON膠體金免疫層析試紙的10.96 倍，可以實(shí)現(xiàn)DON的定量檢測(cè)。該實(shí)驗(yàn)成功建立了磁熒光免疫層析試紙模式，并將其應(yīng)用于DON檢測(cè)中，為磁熒光納米顆粒應(yīng)用于免疫層析領(lǐng)域提供技術(shù)支撐。