葉代全

(福建省洋口國有林場，福建 順昌 353211)

光皮樹(Cornuswilsoniana)又名光皮梾木，是山茱萸科(Cornaceae)梾木屬植物，是我國特有的多用途木本油料樹種，分布于中國長江流域至西南各地的石灰?guī)r山區(qū)[1-3]。光皮樹果油不僅可以作為高級食用油，而且具有顯著的降膽固醇、減肥等藥用和保健價值[1，4-10]。2013年12月，國家衛(wèi)生和計劃生育委員會正式批準光皮樹果實油為我國的新食品原料。光皮樹在城市綠化、丘陵和荒山營造生態(tài)經濟林以及石漠化地區(qū)的生態(tài)恢復起到重要作用[3，11-12]。

本研究于2013年11月對閩西北地區(qū)(主要在明溪縣、將樂縣和寧化縣境內)光皮樹的分布情況進行調查，收集閩西北地區(qū)的光皮樹種質資源(優(yōu)樹)24份，采集11個優(yōu)樹的種子并進行子代測定[1]。由于福建處于中國光皮樹自然分布區(qū)的邊緣，顯然從種質資源保護的角度這些優(yōu)樹具有重要價值。然而這些優(yōu)樹的遺傳多樣性水平、福建光皮樹種群與國內其它地區(qū)光皮樹種群之間的遺傳距離等未見報道。

分子標記是在 DNA水平上反應不同個體或種群間的遺傳多樣性。相比其它的遺傳標記，DNA分子標記不易受環(huán)境影響，可靠性更高，可以快速、準確地對植物遺傳多樣性進行研究。EST-SSR是基于表達序列標簽(Expressed Sequence Tag)開發(fā)的SSR分子標記[13]，與基因組SSR相比，EST-SSR可以在物種之間轉移。目前，EST-SSR已被廣泛應用于植物遺傳多樣性評價、種質鑒定研究等。本研究采用轉錄組技術，開發(fā)光皮樹EST-SSR分子標記，并利用這些標記對福建省11個優(yōu)樹種質資源進行遺傳多樣性相關研究，以期為光皮樹的種質資源收集保存及遺傳育種提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料與試驗地概況

光皮樹材料來自福建省洋口國有林場的光皮樹優(yōu)樹子代測定林，共11個優(yōu)樹子代。其中9個來自明溪(MX)，1個來自寧化(NH)，1個來自將樂(JL)。

試驗地位于福建省洋口國有林場元峰工區(qū)3林班3大班2小班，地理位置為東經117°41′、北緯27°4′，南坡，坡度24°，海拔329 m。小班面積為10.2 hm2，其中試驗地面積為1.3 hm2。造林地前茬屬杉木林地，土壤為紅壤，立地等級Ⅱ級。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣本采集、處理與DNA提取 2020年4月，在福建省洋口國有林場的光皮樹優(yōu)樹子代測定林采集11個優(yōu)樹子代新鮮葉片，每個樣本標號后裝入自封袋中，放入裝有干冰的泡沫盒帶回實驗室，將樣品置于-80 ℃的超低溫冰箱中備用。各樣本DNA提取采用QIAGEN DNeasy Plant Mini Kit(50)植物DNA提取試劑盒；采用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行DNA 檢測，帶型清楚整齊、無拖尾等現(xiàn)象表示提取結果較佳；結合紫外分光光度計、Qubit熒光計檢測DNA純度與濃度。

1.2.2 光皮樹EST-SSR位點檢索 對項目組前期開展的光皮樹不同組織轉錄組測序數據，采用MISA軟件檢索重復單元在3～5 bp的微衛(wèi)星位點，重復次數大于5次。

1.2.3 光皮樹EST-SSR引物設計 采用PRIMER3軟件，對上述檢索結果依據擴增產物區(qū)段在100～300 bp，最小TM值為55 ℃和最優(yōu)TM值為57 ℃的設計原則，共開發(fā)了200對EST-SSR引物。

1.2.4 光皮樹EST-SSR引物合成與多態(tài)性引物篩選 采用加尾法進行熒光引物合成，再隨機選取8份光皮樹DNA，對200對引物經過初篩和復篩，共選出29對多態(tài)性好、穩(wěn)定性高的有效引物；采用29對引物(表1)對全部11個樣本DNA 進行PCR擴增。

表1 用于光皮樹種質資源分析的29對EST-SSR 引物序列信息

表1(續(xù))

1.2.5 光皮樹EST-SSR PCR擴增、檢測 光皮樹EST-SSR PCR擴增反應在ABI PCR擴增反應儀上進行。PCR反應條件為：95 ℃預變性3 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，72 ℃修復延伸5 min；35次循環(huán)。

圖1 光皮樹樣本EST-SSR引物PCR擴增毛細管電泳圖

PCR產物使用ABI 3730 測序儀進行毛細管電泳檢測(圖1)，結合分子內標來分析片段大小，測序儀檢測結果采用Gene mapper 3.0軟件分析。

1.2.6 光皮樹EST-SSR數據及分析 根據熒光檢測的峰值得到片段大小信息，按樣本和引物制備EST-SSR擴增產物大小矩陣，用于遺傳多樣性分析。應用GenAlEx 6.51b2軟件分析得到各微衛(wèi)星位點的基因頻率、特有多態(tài)位點、Shannon 信息指數和基因多樣性指數等。

2 結果與分析

2.1 福建省光皮樹優(yōu)樹EST-SSR標記的多態(tài)性

采用經2輪篩選的29對光皮樹EST-SSR多態(tài)引物對福建省11個光皮樹優(yōu)樹材料進行分析，共擴增出90個EST-SSR位點，平均多態(tài)性位點占55.17%。29對引物的有效多態(tài)位點數變幅為0.333(M1)～3.195(M3)。29對引物的Shannon 信息指數變幅為0.0000(M1，M13)～1.068(M3)，平均值為0.426。說明篩選出的EST-SSR引物在11個光皮樹優(yōu)樹種質資源材料間存遮豐富的遺傳多樣性(表2)。從優(yōu)樹采集地點上看，來自明溪的光皮樹優(yōu)樹多態(tài)性位點比例為93.10%，寧化為27.59%，將樂為44.86%。

表2 光皮樹29對EST-SSR標記的多態(tài)性分析

2.2 福建省光皮樹優(yōu)樹EST-SSR遺傳多樣性

對來自福建省3個地點的11株優(yōu)樹的EST-SSR標記進行F統(tǒng)計量及有效種群大小參數Nm估算，結果見表3。從Fst可以看出，29個EST-SSR標記的遺傳分化指數平均值為0.498，說明目前收集的福建省11株優(yōu)樹群體具有較好的遺傳多樣性。群體特有等位基因數量分析結果表明：11個優(yōu)樹共發(fā)現(xiàn)51個特有等位基因，占56.67%。其中，來自明溪的有45個，寧化的有1個，將樂的有5個。

表3 光皮樹各位點F統(tǒng)計量和Nm的估計值

2.3 光皮樹優(yōu)樹EST-SSR主坐標分析

從全國8個光皮樹種群EST-SSR分子標記主坐標PCoA分析結果可知，前3個主成分解釋變異的累積百分率分別為42.52%、66.39%、83.09%。二維PCoA分析(圖2)明顯將各群體劃分為3大類(湖南、湖北、貴州、江西、重慶和廣東為一類，福建和廣西各自為一類)。其中廣西的分布與其它群體相距最遠，福建次之，的確位于全國光皮樹分布區(qū)的邊緣。PCoA分析結果大致表現(xiàn)出光皮樹種質資源在分布上的地域規(guī)律性。

2.4 光皮樹優(yōu)樹EST-SSR特有等位基因分析

在來自重慶、江西、湖南、湖北、貴州、廣西、廣東和福建等全國8個光皮樹種群綜合分析中，全部275個優(yōu)樹群體中共獲得124個特有等位基因。其中，來自福建的有11個，占8.87%；而且來自福建省的11個優(yōu)樹個體每個個體均含有特有等位基因(表4)。

GZ為貴州；HB為湖北；HN為湖南；GD為廣東；JX為江西；GX為廣西；FJ為福建；CQ為重慶 圖2 光皮樹群體的PCoA分析

3 結論與討論

3.1 結論

本研究利用光皮樹轉錄組測序數據開發(fā)了光皮樹EST-SSR分子標記，并篩選出了29對多態(tài)引物，來自福建省11個優(yōu)樹子代共擴增出90個EST-SSR位點，平均多態(tài)性位點占55.17%；來自明溪的光皮樹優(yōu)樹多態(tài)性位點比例為93.10%，寧化為27.59%，將樂為44.86%。福建省11個光皮樹優(yōu)樹個體間遺傳分化指數平均值為0.498，11株優(yōu)樹中共發(fā)現(xiàn)51個特有等位基因，占56.67%。全國8個光皮樹種群275株優(yōu)樹中共獲得124個特有等位基因，其中來自福建的有11個，占8.87%；且11株優(yōu)樹每株均含有特有等位基因。

3.2 討論

油脂既是人們生活必需的消費品，又是食品、醫(yī)藥、皮革、紡織、化妝和油漆等工業(yè)的重要原料。維護糧油安全一直是世界各國高度關注的重大戰(zhàn)略。我國在大豆和油菜籽方面一直是凈進口國，進口量也呈持續(xù)增加態(tài)勢。我國油料凈進口量由2000年的1260萬t增加到2017年的1億t，2020年油料凈進口量為1.04億t，較上年增加12.8%。大豆凈進口量占我國油料凈進口總量的比例一直在90%以上，2020年達到96.5%，凈進口總量達到1億t。

目前，我國食用植物油構成以大豆油、棕櫚油和菜子油為主，以茶油為主的木本植物油只占年總量的1.8%左右。聯(lián)合國糧農組織已將木本油料列為重點推廣的健康型高級食用油。發(fā)展木本油料產業(yè)，有利于維護國家糧油和能源安全。維護糧油安全一直是世界各國高度關注的重大戰(zhàn)略。長期以來，黨中央、國務院始終把糧油生產放在突出位置，采取一系列有力措施，確保糧食連年增產，創(chuàng)造了用占世界9%的耕地資源養(yǎng)活占世界21%人口的奇跡，但是，保障國家糧油安全依然面臨嚴峻的挑戰(zhàn)。

表4 福建省光皮樹優(yōu)樹特有等位基因及頻率

在世界面臨能源危機的今天，可再生的生物質能源越來越受到人們的重視，成為世界能源戰(zhàn)略調整重要的發(fā)展方向。木本油料是優(yōu)質食用植物油及可再生的生物質能源，加快木本油料產業(yè)發(fā)展，有利于保障國家糧油市場供應，確保國家油料和能源安全。光皮樹是我國特有的木本油料植物，除作為油料植物栽培，還在園林綠化得到廣泛應用，尤其是能夠在石灰?guī)r山地生長，近年來得到這些地區(qū)領導和企業(yè)家的密切關注，作為生態(tài)林來建設的同時，能夠產生經濟效益，目前正受到重視。在適宜地區(qū)進行光皮樹的推廣種植將是未來我國木本油料產業(yè)發(fā)展過程中的必然趨勢。

福建省雖然是我國光皮樹分布的邊緣產區(qū)，但從前期開展的光皮樹種質資源調查中發(fā)現(xiàn)，福建省仍存在一定數量的古樹，根據當地農民口述估計，均約在100 a 以上，大多位于風景名勝區(qū)[3]。因此，在歷史上福建省很有可能存在原始光皮樹種群，因本次獲得的福建省光皮樹優(yōu)樹數量有限，不同群體的數量差異較大，很多遺傳參數無法估算。但從本項研究的結果還是能夠看出，福建省的光皮樹優(yōu)樹的遺傳多樣性較高，尤其是獲得較高比例的特有等位基因，超過一半，占56.67%。來自將樂風景區(qū)的1株優(yōu)樹上含有5個特有等位基因，說明這些種質資源非常值得保護和收集。從建設全國光皮樹種質資源庫的角度來看，來自福建省的光皮樹種質資源是不可缺少的重要部分。今后應加強福建省光皮樹種質資源的收集、保護和開發(fā)利用等方面的基礎和應用研究。