李祥，劉龍，安世恒，關(guān)若冰

（河南省害蟲(chóng)綠色防控國(guó)際聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室/河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，河南鄭州，450002）

0 引言

成熟的microRNA（miRNA）長(zhǎng)度約為18～35 nt，不具有開(kāi)放閱讀框（ORF），因而不能編碼蛋白質(zhì)，其序列在不同物種的基因進(jìn)化上高度保守，并且在生物發(fā)育過(guò)程中miRNAs的表達(dá)表現(xiàn)出明顯的組織特異性和時(shí)間特異性（Jonas and Izaurralde，2015；Lukasik and Zielenkiewicz，2016）。miRBase Sequence Database（http：//www.mirbase.org/）作為最大的miRNA信息存儲(chǔ)數(shù)據(jù)庫(kù)，目前已收錄了超過(guò)48860個(gè)miRNA成熟體序列，涵蓋了包括動(dòng)物、植物和微生物在內(nèi)的271個(gè)物種（Kozomara et al.，2019）。

生物體內(nèi)絕大多數(shù)基因可能受到miRNA的調(diào)控，且同一miRNA可能調(diào)控多個(gè)功能相似甚至功能完全不相關(guān)基因的表達(dá)（Seitz and Pinzón，2017）。準(zhǔn)確識(shí)別miRNA的靶基因是明確其功能必不可少的環(huán)節(jié)。但目前，還沒(méi)有十分準(zhǔn)確、有效的預(yù)測(cè)手段，已明確了靶基因的miRNA也比較有限，不足以對(duì)后續(xù)研究提供充足的參考信息，極大限制了mi-RNA的相關(guān)研究和生產(chǎn)應(yīng)用。本研究概述了miRNA的特征、在細(xì)胞內(nèi)的形成過(guò)程、對(duì)靶基因的調(diào)控機(jī)制及其在生物體內(nèi)的功能，尤其是miRNA在昆蟲(chóng)生長(zhǎng)、發(fā)育以及植物-病原物互作中的關(guān)鍵作用，并討論了miRNA作為生物農(nóng)藥的研發(fā)潛力。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步從軟件預(yù)測(cè)和試驗(yàn)分析等角度詳細(xì)論述了miRNA靶基因預(yù)測(cè)和驗(yàn)證的方法及其優(yōu)、缺點(diǎn)，并指出當(dāng)前研究的不足和未來(lái)的發(fā)展方向，為今后miRNA相關(guān)研究和生產(chǎn)應(yīng)用方面提供一些思路。

1 miRNA在細(xì)胞內(nèi)的形成過(guò)程

生物體內(nèi)的少數(shù)miRNAs轉(zhuǎn)錄于編碼基因的內(nèi)含子區(qū)域，其產(chǎn)生會(huì)被所在基因的轉(zhuǎn)錄行為所影響；而大多數(shù)miRNAs來(lái)源于基因間的序列，通常擁有獨(dú)立的啟動(dòng)子及調(diào)控元件（Chang et al.，2015）。當(dāng)轉(zhuǎn)錄因子與miRNA轉(zhuǎn)錄序列的調(diào)控位點(diǎn)結(jié)合后，會(huì)激活RNA聚合酶II（RNA polymerase II）并在細(xì)胞核內(nèi)生成初級(jí)轉(zhuǎn)錄物，即初級(jí)miRNA（Primary miRNA，pri-miRNA）（Roden et al.，2017；Creugny et al.，2018）。有研究證實(shí)，極少數(shù)pri-miRNA（如pri-mir-634）是在RNA聚合酶III的催化作用下形成（Paraboschi et al.，2017）。

miRNA成熟體的形成通常需要pri-miRNA經(jīng)過(guò)2次剪切。在動(dòng)物細(xì)胞核中，pri-miRNAs在Drosha蛋白的作用下，首先被剪切形成miRNA前體（Precursor miRNA，pre-miRNA）（Lee et al.，2003；Roden et al.，2017）。Drosha蛋白隸屬于核糖核酸酶III（RNase III）家族，通常存在于細(xì)胞核內(nèi)，能特異性的識(shí)別雙鏈RNA結(jié)構(gòu)并將其剪切成3′端具有2個(gè)突出堿基的產(chǎn)物（Lee and Shin，2018）。pre-miRNA的長(zhǎng)度一般為60～80 nt，可形成典型的莖—環(huán)結(jié)構(gòu)以維持較低的自由能（Creugny et al.，2018）。核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Exportin5（Exp5）是一種Ran-GTP依賴(lài)性蛋白，能識(shí)別并結(jié)合pre-miRNA的莖—環(huán)末端結(jié)構(gòu)，并將剪切好的pre-miRNA運(yùn)出細(xì)胞核。進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)后，GTP發(fā)生去磷酸化反應(yīng)變?yōu)镚DP，同時(shí)釋放pre-miRNA（Kim et al.，2016）。在此過(guò)程中，Exp5不僅承擔(dān)了運(yùn)輸功能，還保護(hù)著pre-miRNA不被其他酶類(lèi)降解（Zeng and Cullen，2006；Wu et al.，2018）。

在細(xì)胞質(zhì)中，RNase III家族的另一個(gè)成員Dicer將對(duì)pre-miRNA進(jìn)行第二次剪切，形成一個(gè)不穩(wěn)定的miRNA：miRNA*復(fù)合體（Sand，2014）。在此過(guò)程中，TRBP（Transactivation-response RNA-binding protein）和PACT（Protein kinase R-activating protein）兩類(lèi)輔助蛋白能大幅提高Dicer對(duì)miRNA：miRNA*復(fù)合體的親和力并從中挑選出合適的miRNA成熟體；其中，TRBP負(fù)責(zé)對(duì)底物進(jìn)行識(shí)別和定位（Komori et al.，2020），PACT則促進(jìn)了Dicer的剪切過(guò)程（Wilson et al.，2015）。在miRNA：miRNA*復(fù)合體中，穩(wěn)定性較高的miRNA即成為miRNA成熟體，并將協(xié)同AGO、Dicer等蛋白共同形成miRNA沉默誘導(dǎo)復(fù)合體（miRNA-induced silencing complex，miRISC），另一個(gè)miRNA則會(huì)在細(xì)胞內(nèi)被迅速降解（Krol et al.，2010；Carthew et al.，2017）。如果這兩個(gè)miRNAs的5'末端的穩(wěn)定性相近，則有可能形成2種不同的miRNA成熟體以及相應(yīng)的miRISC（Sheu-Gruttadauria and MacRae，2018）（圖1）。

植物miRNA的形成方式與動(dòng)物存在明顯的差異，最典型的差異是植物中不存在Drosha或與其同源的蛋白（Chorostecki et al.，2017）。但在擬南芥（）中 發(fā) 現(xiàn) 了Dicer的 同 源 物DCL1，并證明了DCL1主要在細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)，并參與了pre-miRNA和miRNA成熟體的形成過(guò)程（Suarez et al.，2015），因而推測(cè)DCL1表現(xiàn)出類(lèi)似Drosha或Dicer的功能。需要注意的是，植物miRNA通常在細(xì)胞核內(nèi)被加工成熟，而動(dòng)物miRNA的成熟通常發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)中，進(jìn)一步佐證了上述推斷。此外，植物中HYL1的功能與動(dòng)物中的TRBP和PACT相似，均發(fā)揮協(xié)同催化的作用；植物中HST則是Exp5的同源物，被認(rèn)為是miRNA-miRNA*復(fù)合體運(yùn)出細(xì)胞核的載體蛋白（Mengistu and Tenkegna，2021）。

圖1 miRNA在動(dòng)物體內(nèi)的生物合成過(guò)程（Ameres and Zamore，2013）Fig.1 miRNA biogenesis process in animals（Ameres and Zamore，2013）

2 miRNA對(duì)靶基因的調(diào)控機(jī)制

成熟的miRNA會(huì)協(xié)同AGO、Dicer、TRBP、PACT等元件形成miRISC，并通過(guò)對(duì)mRNA進(jìn)行降解或翻譯抑制兩種不同的作用機(jī)制來(lái)實(shí)現(xiàn)其沉默效應(yīng)（Tang，2005；Liu et al.，2017）。miRNA與靶基因序列的互補(bǔ)程度則決定了具體的調(diào)控機(jī)制。

大多數(shù)植物miRNA與其靶標(biāo)mRNA的序列幾乎完全互補(bǔ)，其作用機(jī)制與siRNA形成的RISC相類(lèi)似（郝大海和龔明，2020），即與mRNA結(jié)合后，miRISC引導(dǎo)其中的外切酶和內(nèi)切酶同時(shí)作用，降解所在的mRNA。反應(yīng)完成后，miRISC被完整的釋放出來(lái)并參與下一個(gè)剪切事件（Samad et al.，2017）。值得注意的是，植物miRNA與靶基因的結(jié)合位點(diǎn)可能存在于整個(gè)mRNA序列；而動(dòng)物miRNA的結(jié)合位點(diǎn)通常定位在mRNA的3'UTR。與植物不同的是，動(dòng)物miRNA僅在靠近5'端的少數(shù)序列與靶基因完全互補(bǔ)，而其余序列的互補(bǔ)程度則很低，使得miRNA在動(dòng)物體內(nèi)的主要作用方式為翻譯抑制。目前普遍認(rèn)為在動(dòng)物體內(nèi)miRISC能在不破壞mRNA結(jié)構(gòu)的前提下，抑制其翻譯過(guò)程中的某個(gè)階段，導(dǎo)致無(wú)法合成或減少合成相應(yīng)的蛋白產(chǎn)物（Ameres and Zamore，2013；Gebert and Macrae，2019）。動(dòng)物中多數(shù)miRNAs與靶標(biāo)mRNA的結(jié)合位點(diǎn)位于3'UTR，極大降低了靶基因的預(yù)測(cè)范圍。但越來(lái)越多的研究報(bào)道指出，miRNA-mRNA的結(jié)合位點(diǎn)也可能存在于靶基因的編碼區(qū)（CDS）和5'UTR（Baizhigitova et al.，2018），這使得研究者需要重新評(píng)估和審視以前的研究。

3 miRNA對(duì)生物的調(diào)控功能

3.1 miRNA在生物體內(nèi)的一般功能

目前對(duì)于miRNA的功能研究主要采用反向遺傳學(xué)的方法。一方面通過(guò)突變靶基因的結(jié)合位點(diǎn)來(lái)觀(guān)察miRNA的結(jié)合情況以及相應(yīng)的表型變化，另一方面通過(guò)過(guò)表達(dá)或抑制miRNA的表達(dá)水平來(lái)觀(guān)察所造成的影響（Gebert et al.，2019）。大多數(shù)miRNAs行使調(diào)控作用時(shí)，往往是微調(diào)（Fine-tune）靶基因的表達(dá)水平使其維持適宜的表達(dá)豐度，因此，改變miRNA的表達(dá)量并不一定能觀(guān)察到十分明顯的表型變化。在探索miRNA的功能時(shí)，研究者通常采用高通量測(cè)序加生物信息學(xué)分析的方法，明確miRNA的時(shí)空表達(dá)特性，并根據(jù)miRNA與mRNA的序列互補(bǔ)程度和結(jié)合穩(wěn)定性預(yù)測(cè)其靶基因，然后結(jié)合分子生物學(xué)手段對(duì)miRNA與mRNA的互作關(guān)系進(jìn)行驗(yàn)證，并根據(jù)靶基因的作用判斷miRNA的功能。

植物miRNA與靶基因的結(jié)合序列幾乎完全互補(bǔ)，極大提高了靶基因預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性（崔俊霞等，2018）。已知的植物miRNA靶基因中，很多都是在生長(zhǎng)發(fā)育中起關(guān)鍵調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子基因（Zhang et al.，2006a；Reichel et al.，2015）。Pandey等（2019）指出，植物miRNA可通過(guò)抑制細(xì)胞分化過(guò)程中的關(guān)鍵基因控制植物細(xì)胞發(fā)育的方向。動(dòng)物miRNA的功能鑒定相對(duì)困難。由于“不完全匹配”的機(jī)制，動(dòng)物miRNA的靶基因預(yù)測(cè)會(huì)產(chǎn)生大量的假陽(yáng)性結(jié)果，必須經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的試驗(yàn)驗(yàn)證才能確定。與植物一樣的是，動(dòng)物miRNA的靶基因中也包含大量轉(zhuǎn)錄因子基因，并在生物體生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要功能（Vorozheykin and Titov，2020）。更多的研究表明，miRNA表現(xiàn)出能調(diào)控大多數(shù)生理和病理過(guò)程的潛力，包括發(fā)育階段的劃分、干細(xì)胞分化、神經(jīng)發(fā)育、細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡、激素分泌、脂類(lèi)代謝、病變和癌癥等（Llave and Carrington，2002；Vikram et al.，2015）。此外，不同外部因子或內(nèi)部生理變化所導(dǎo)致的表達(dá)差異暗示了miRNA具有更廣泛的作用。近年來(lái)，生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，miRNA具有多元化的調(diào)控路徑，甚至具備調(diào)控所有生理活動(dòng)的潛力（Gebert and Macrae，2019）。

3.2 miRNA在昆蟲(chóng)發(fā)育中的功能

作為生物體內(nèi)一類(lèi)重要的調(diào)控因子，miRNA廣泛參與了昆蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育、生殖、代謝、免疫防御等絕大多數(shù)的生理生化過(guò)程。在果蠅中，通過(guò)敲除AGO蛋白阻止miRNAs發(fā)揮功能，能顯著抑制其卵母細(xì)胞的形成（Azzam et al.，2012），且構(gòu)建基因缺失的突變品系能阻礙果蠅卵母細(xì)胞的成熟（Nakahara et al.，2005）。在褐飛虱（）中抑制基因的表達(dá)，獲得了與果蠅相似的表型（Zhang et al.，2013）。、等通過(guò)調(diào)節(jié)Notch信號(hào)通路和骨形態(tài)發(fā)生蛋白信號(hào)通路中關(guān)鍵基因的表達(dá)，可阻止果蠅的生殖干細(xì)胞（Germline stem cells）分 化（Poulton et al.，2011；Li et al.，2012），而啟動(dòng)生殖干細(xì)胞的分化也同樣需要miRNA的調(diào)控（如）（Pek et al.，2009）。昆蟲(chóng)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育同樣需要miRNA的參與，如（Li and Carthew，2005）、（Loya et al.，2009）、（Weng and Cohen，2012）等；缺失這些miRNAs的表達(dá)則會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)退行性功能缺失、神經(jīng)干細(xì)胞分化異常、信號(hào)傳導(dǎo)受阻等發(fā)育或功能缺陷。是參與昆蟲(chóng)邊界形成的關(guān)鍵基因之一，能通過(guò)抑制基因的表達(dá)從而阻止果蠅翅芽盤(pán)（Wing imaginal discs）的細(xì)胞增殖；基因被抑制后，其靶基因大量表達(dá)，該基因又進(jìn)一步促進(jìn)了翅芽盤(pán)上背—腹軸向的分化（Becam et al.，2011）?；虻臅r(shí)序性表達(dá)從時(shí)間維度上控制了翅芽盤(pán)上的細(xì)胞增殖，缺失的果蠅翅尺寸會(huì)明顯減?。–aygill and Johnston，2008）。

miRNA對(duì)昆蟲(chóng)變態(tài)發(fā)育中的激素代謝、蛻皮行為、組織降解和重建同樣具有重要的調(diào)控作用（Ylla et al.，2016；Belles，2017）。在果蠅的整個(gè)發(fā)育過(guò)程中，多個(gè)miRNAs的表達(dá)水平與蛻皮和變態(tài)過(guò)程密切相關(guān)。蛻皮激素功能通路中的關(guān)鍵基因能顯著上調(diào)、、等基因的表達(dá)水平，并抑制基因的表達(dá)，共同維護(hù)蛻皮過(guò)程的有序進(jìn)行（Sempere et al.，2002，2003）。能靶向果蠅中蛻皮激素的受體基因，從而形成一個(gè)反饋調(diào)控環(huán)，以維持蛻皮激素的適宜滴度并適時(shí)啟動(dòng)或終止相應(yīng)的蛻皮過(guò)程（Varghese and Cohen，2007）。在家蠶（）中，同樣能作用于蛻皮激素調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的多個(gè)基因和步驟，共同維持生長(zhǎng)發(fā)育的有序性（He et al.，2019a，2019b）。通過(guò)負(fù)調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子dLMO來(lái)控制果蠅翅發(fā)育過(guò)程的細(xì)胞凋亡，塑造適宜的翅形（Epstein et al.，2017）；在褐飛虱的長(zhǎng)、短翅型分化和發(fā)育中，基因能響應(yīng)寄主營(yíng)養(yǎng)水平和胰島素受體基因的信號(hào)調(diào)控，通過(guò)調(diào)節(jié)基因的適宜表達(dá)水平來(lái)促進(jìn)種群向長(zhǎng)翅化或短翅化發(fā)展（Li et al.，2021）。這也間接說(shuō)明miRNA對(duì)昆蟲(chóng)生理生化過(guò)程的調(diào)控作用存在一定的保守性，在今后的應(yīng)用實(shí)踐中，應(yīng)經(jīng)過(guò)合理的篩選和驗(yàn)證，基于miRNA調(diào)控作用的藥劑開(kāi)發(fā)可兼顧特異性和廣譜性雙重優(yōu)勢(shì)。

3.3 miRNA在植物抗病中的功能

miRNA不僅通過(guò)作用于轉(zhuǎn)錄因子來(lái)調(diào)控植物自身的生長(zhǎng)發(fā)育，還參與植物與病原物的“斗爭(zhēng)”。這些致病微生物通過(guò)表達(dá)或誘導(dǎo)寄主植物表達(dá)某些miRNAs來(lái)抑制寄主的免疫防御，協(xié)同致病過(guò)程（Umbach and Cullen，2009）。例如丁香假單胞菌（）侵染擬南芥時(shí)，通過(guò)誘導(dǎo)寄主過(guò)表達(dá)來(lái)抑制自身防御基因和的轉(zhuǎn)錄，關(guān)閉植物的免疫過(guò)程（Niu et al.，2016）。黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus）通過(guò)編碼一種2b蛋白與寄主植物的AGO1蛋白競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，從而阻礙植物對(duì)自身miRNA的加工和修飾，導(dǎo)致由miRNA介導(dǎo)的寄主防御反應(yīng)受到抑制（Zhang et al.，2006b）。另一方面，植物在抵御致病微生物的侵染時(shí)，會(huì)有目的地上調(diào)或下調(diào)一些內(nèi)源性miRNAs的表達(dá)，用于激活自身免疫系統(tǒng)，以提高對(duì)病原物的抗性。當(dāng)煙草受到煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus）侵染時(shí)，通過(guò)降低自身的表達(dá)水平來(lái)促進(jìn)免疫基因的表達(dá)，以抵御該病毒（Jiang et al.，2019）。

利用基因編輯或轉(zhuǎn)基因技術(shù)，可有目的地使植物過(guò)表達(dá)某些特定的miRNAs，從而沉默病原物的關(guān)鍵致病基因。該項(xiàng)技術(shù)已應(yīng)用于水稻、番茄、煙草等作物的品種選育（Schwab et al.，2006；Ossowski et al.，2008）。例如，在煙草基因組中插入人工構(gòu)建的miRNA前體序列，使其特異性地過(guò)表達(dá)目的miRNA片段，可以沉默馬鈴薯Y病毒（Potato virus Y）的致病基因HC-Pro和馬鈴薯X病毒（Potato virus X）中的致病基因p25，最終削弱這兩種病毒對(duì)煙草的致病能力（Ai et al.，2011）。針對(duì)田間多種病害混合發(fā)生的現(xiàn)狀，可以針對(duì)病原物致病基因的保守序列構(gòu)建miRNA表達(dá)載體，以拓寬農(nóng)作物的抗病譜（Zheng and Qu，2015）。

4 miRNA的靶基因預(yù)測(cè)

隨著高通量測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)的發(fā)展，生物中大量miRNA被相繼鑒定出來(lái)。一些miRNAs通過(guò)作用于昆蟲(chóng)、植物或病原微生物中的關(guān)鍵基因，從而調(diào)控昆蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育和植物-病原物的互作過(guò)程，在農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)防治和植物抗病免疫等方面顯示出非常好的應(yīng)用潛力?；赗NA沉默技術(shù)的生物農(nóng)藥研發(fā)也因此成為可持續(xù)植保發(fā)展的熱點(diǎn)研究領(lǐng)域。但如何從包含成百上千個(gè)miRNAs的生物轉(zhuǎn)錄組中準(zhǔn)確篩選和鑒定出對(duì)靶標(biāo)基因具有調(diào)控作用的mi-RNA成為限制該領(lǐng)域發(fā)展的一個(gè)難題。早在21世紀(jì)初期，Lai（2002）比對(duì)了果蠅中調(diào)控基因和基因的11個(gè)miRNAs，結(jié)果發(fā)現(xiàn)二者的miRNAs 5'端的前8個(gè)堿基（實(shí)際為靠近5'端的6個(gè)堿基）與靶基因序列能精確互補(bǔ)，稱(chēng)這些堿基為種子序列（Seed region），并推測(cè)種子序列是miRNA發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用的關(guān)鍵因素。這一發(fā)現(xiàn)確立了以種子序列為依據(jù)進(jìn)行miRNA靶基因預(yù)測(cè)的計(jì)算機(jī)理論基礎(chǔ)。迄今為止，尚未發(fā)現(xiàn)比利用種子序列進(jìn)行預(yù)測(cè)更準(zhǔn)確的手段。近十幾年來(lái)，逐步確立了以種子序列為核心，miRNA-mRNA復(fù)合體的熱穩(wěn)定性和二級(jí)結(jié)構(gòu)為依據(jù)的理論體系，并誕生多種各具特色的預(yù)測(cè)軟件（Chen et al.，2018）。

4.1 根據(jù)miRNA-mRNA復(fù)合體的熱力學(xué)穩(wěn)定性進(jìn)行預(yù)測(cè)

miRanda是首個(gè)以miRNA與潛在靶基因之間熱力學(xué)穩(wěn)定性為依據(jù)進(jìn)行預(yù)測(cè)的軟件，該軟件不受物種限制，還可在Windows、Linux等多種操作平臺(tái)上進(jìn)行不聯(lián)網(wǎng)運(yùn)行（Ahmadi et al.，2013）。miRanda強(qiáng)調(diào)miRNA與靶基因互補(bǔ)序列在進(jìn)化上的保守性，主要參考miRNA 5'端序列與靶序列之間C：G、A：U、G：U的配對(duì)情況進(jìn)行熱穩(wěn)定性評(píng)估，并構(gòu)建出相應(yīng)的打分矩陣，同時(shí)根據(jù)miRNA 5'端和3'端各自的互補(bǔ)特性進(jìn)行區(qū)別評(píng)分。用戶(hù)還可根據(jù)實(shí)際需要自行定義閾值，從而篩除不穩(wěn)定的復(fù)合體（Ahmadi et al.，2013；程爽等.，2018）。此后，更多基于熱力學(xué)穩(wěn)定性的miRNA靶基因預(yù)測(cè)軟件被相繼開(kāi)發(fā)。例如，RNAhybrid算法強(qiáng)調(diào)根據(jù)結(jié)合能來(lái)推算最佳結(jié)合位點(diǎn)，并獲得最穩(wěn)定的配對(duì)模式，避免了miRNA和靶基因之間形成無(wú)關(guān)的復(fù)合體結(jié)構(gòu)（Krüger and Rehmsmeier，2006；Pio et al.，2014）。PITA算法僅根據(jù)靶基因的3′UTR對(duì)已形成穩(wěn)定二級(jí)結(jié)構(gòu)的序列進(jìn)行剔除（Beretta et al.，2017；Kertesz et al.，2017），但出現(xiàn)跨度較大的互補(bǔ)配對(duì)情況或較大的二級(jí)結(jié)構(gòu)時(shí)，該算法會(huì)產(chǎn)生一部分假陽(yáng)性結(jié)果。

基于miRNA與靶基因的作用方式，以及不同miRNAs間的序列比對(duì)分析，Miranda等（2006）開(kāi)發(fā)了第二代預(yù)測(cè)軟件——RNA22。該軟件是首個(gè)不使用同源保守信息進(jìn)行預(yù)測(cè)的軟件，具有很強(qiáng)的靈活性，可將靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)范圍延伸至整個(gè)mRNA序列。RNA22以Rfam 3.0數(shù)據(jù)庫(kù)中miRNA成熟體為訓(xùn)練集合，采用一種模糊匹配的模式進(jìn)行預(yù)測(cè)。該算法將供試序列分割成靶點(diǎn)島（Target island），并依次評(píng)估與miRNA的結(jié)合情況來(lái)尋找假定結(jié)合位點(diǎn)（Miranda et al.，2006；Plotnikova and Skoblov，2018）。

4.2 根據(jù)物種間的序列保守性進(jìn)行預(yù)測(cè)

種子序列通常在物種之間的保守性很高，研究者可根據(jù)靶基因序列的同源性進(jìn)行預(yù)測(cè)。TargetScan是目前使用頻率最高的預(yù)測(cè)軟件。該算法提出了“假陽(yáng)性率”的概念，并根據(jù)物種之間的保守性原則對(duì)預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行二次評(píng)估（Agarwal et al.，2015）。TargetScan首先搜索并比對(duì)不同物種之間的mRNA 3'UTR序列的保守區(qū)域，然后根據(jù)miRNA與潛在靶標(biāo)的3'UTR及其周?chē)蛄械幕パa(bǔ)程度進(jìn)行綜合評(píng)估（Lewis et al.，2005；Wu et al.，2017）。該算法以保守性為主要依據(jù)，其局限性在于不能對(duì)具有物種特異性的互補(bǔ)情況進(jìn)行有效預(yù)測(cè)。TargetScan S則是在TargetScan基礎(chǔ)上進(jìn)行了優(yōu)化，不再對(duì)miRNA非種子序列區(qū)域與靶序列匹配的自由能進(jìn)行評(píng)估，而是增加對(duì)人類(lèi)、鼠、狗、雞等一些進(jìn)化距離較遠(yuǎn)的物種進(jìn)行保守性分析，進(jìn)一步提高了預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性（Huang et al.，2019）。

4.3 基于多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)

miRNA不僅可調(diào)控多個(gè)mRNAs，也可作用于同一mRNA的多個(gè)位點(diǎn)。基于此現(xiàn)象，對(duì)多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行同時(shí)預(yù)測(cè)時(shí)，可通過(guò)增加信噪比參數(shù)對(duì)預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行適當(dāng)?shù)睾Y除。盡管這種算法可能會(huì)過(guò)濾一些真實(shí)靶標(biāo)，但其優(yōu)勢(shì)在于預(yù)測(cè)結(jié)果更加準(zhǔn)確（Ritchie et al.，2009a，2009b）。PicTar主要應(yīng)用于脊椎動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物中的miRNA靶基因預(yù)測(cè)，是多靶標(biāo)和多結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)的代表算法。該算法不僅能同時(shí)評(píng)估多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，還對(duì)miRNA-mRNA結(jié)合能力進(jìn)行綜合評(píng)估，甚至允許種子序列出現(xiàn)不完全匹配的情況，并進(jìn)行區(qū)別打分（Sarker et al.，2011）。此外，該算法還考慮了結(jié)合位點(diǎn)的保守性因素，并關(guān)聯(lián)了多個(gè)網(wǎng)站的miRNA信息數(shù)據(jù)庫(kù)。

4.4 根據(jù)miRNA和mRNA的表達(dá)水平進(jìn)行預(yù)測(cè)

一些miRNA通過(guò)降解mRNA來(lái)阻斷其翻譯過(guò)程（Ameres and Zamore，2013；Samad et al.，2017），因此，在miRNA表達(dá)活躍的區(qū)域，相應(yīng)的靶基因表達(dá)水平通常較低。檢測(cè)特定組織中miRNA與mRNA表達(dá)量的關(guān)系，也是靶基因篩選的一個(gè)重要手段（Jing et al.，2016；Ye et al.，2019）。該方法不同于匹配原則的算法，可以對(duì)基于序列互補(bǔ)原則而獲得的結(jié)果進(jìn)行二次篩選，另一個(gè)優(yōu)勢(shì)在于不單純依賴(lài)于3′UTR進(jìn)行預(yù)測(cè)。但在動(dòng)物中，一些miRNAs并不能直接影響mRNA的表達(dá)水平，或者影響十分微弱，導(dǎo)致很多真實(shí)的結(jié)果被忽視，此時(shí)可用檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)水平代替對(duì)mRNA的檢測(cè)。

4.5 根據(jù)功能相關(guān)性進(jìn)行預(yù)測(cè)

miRNA參與了生物體內(nèi)大多數(shù)的生理生化過(guò)程（Llave and Carrington，2002；Lim et al.，2005），因此，可根據(jù)其功能分類(lèi)對(duì)無(wú)關(guān)的預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行剔除。mirBridge算法錨定一組或一類(lèi)已知功能的mRNA，有針對(duì)性的對(duì)這些潛在靶標(biāo)進(jìn)行排查（Tsang et al.，2010）。此算法適用于一些具有特殊功能的基因或通路研究，但對(duì)于尚未進(jìn)行功能劃分的miRNA和mRNA無(wú)法預(yù)測(cè)。

4.6 根據(jù)miRNA信息庫(kù)尋找潛在靶標(biāo)

隨著miRNA-mRNA互作研究成果的不斷積累，一些研究者或機(jī)構(gòu)建立了多種miRNA數(shù)據(jù)庫(kù)，以整合miRNA及其靶基因的相關(guān)信息。starBase（http：//starbase.sysu.edu.cn/）網(wǎng)站較為全面的收錄了由miRNA介導(dǎo)的mRNA降解組和CLIP-Seq等高通量測(cè)序數(shù)據(jù)，包含了miRNA-mRNA、miRNA-lncRNA、miRNA-ceRNA等多種互作模式下的miRNA靶標(biāo)信息。ChIPBase（http：//deepbase.sysu.edu.cn/chipbase/）偏向于探討miRNA的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用，構(gòu)建了比較系統(tǒng)的“轉(zhuǎn)錄因子-miRNA-靶基因”調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。Tarbase（http：//microrna.gr/tarbase/）側(cè)重于收集已被試驗(yàn)證實(shí)過(guò)的miRNA靶基因信息。此外，PMRD主要收錄植物miRNA的數(shù)據(jù)信息，miRGator v2.0則重點(diǎn)整合了疾病相關(guān)miRNA的研究結(jié)果。鑒于miRNA在序列和功能方面的保守性，收錄的研究結(jié)果被廣泛借鑒于當(dāng)前的研究。但受限于miRNA相關(guān)研究的不系統(tǒng)性，這些網(wǎng)站建立的數(shù)據(jù)庫(kù)仍不夠全面。

5 miRNA的靶基因驗(yàn)證

盡管目前已存在大量各具特色的預(yù)測(cè)軟件，但這些算法主要依賴(lài)于miRNA與靶基因的互補(bǔ)潛力進(jìn)行預(yù)測(cè)，并強(qiáng)調(diào)種子序列的重要性。由于miRNAmRNA復(fù)合體允許一定程度的錯(cuò)配、跳躍、G：U配對(duì)的情況出現(xiàn)，在很大程度上會(huì)出現(xiàn)許多錯(cuò)誤的預(yù)測(cè)結(jié)果。在實(shí)際研究中，需要對(duì)預(yù)測(cè)的結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步分析和驗(yàn)證。

miRNA的靶基因驗(yàn)證試驗(yàn)最初是以線(xiàn)蟲(chóng)體為研究對(duì)象，通過(guò)構(gòu)建miRNA缺失的突變體以獲得相反表現(xiàn)，從而證明miRNA與mRNA的調(diào)控關(guān)系（Lee et al.，1993）。這種方法受基因編輯技術(shù)等因素的局限，無(wú)法在生物中推廣使用。Vatolin等（2006）、Andachi（2008）將一段已知序列的特異性接頭連接至miRNA后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增，進(jìn)一步通過(guò)定量分析或高通量測(cè)序的方法成功鑒定出、LIN-14等靶基因。

當(dāng)前驗(yàn)證miRNA與靶基因的互作關(guān)系時(shí)，通常是人為構(gòu)建出一套表達(dá)系統(tǒng)用于模擬相應(yīng)的調(diào)控過(guò)程，并檢測(cè)mRNA表達(dá)的蛋白產(chǎn)物含量。報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)是驗(yàn)證miRNA與靶基因互作時(shí)最常見(jiàn)的研究手段。當(dāng)miRNA與mRNA上的作用位點(diǎn)結(jié)合后，能有效抑制其翻譯過(guò)程，并顯著減少蛋白產(chǎn)物的含量（Huang et al.，2020；Li et al.，2021）。將包含潛在結(jié)合位點(diǎn)的一部分或全部序列連接至報(bào)告基因（通常為熒光素酶基因）CDS的下游，并將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒導(dǎo)入細(xì)胞系內(nèi)進(jìn)行表達(dá)；同時(shí)將miRNA的模擬物或表達(dá)載體共同轉(zhuǎn)染至細(xì)胞系中，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間后檢測(cè)熒光強(qiáng)度或者熒光素酶的活性。為核實(shí)miRNA與靶基因的作用位點(diǎn)，還可將結(jié)合位點(diǎn)序列進(jìn)行突變，從而反向觀(guān)察結(jié)合情況，檢測(cè)報(bào)告基因的表達(dá)水平，用以驗(yàn)證預(yù)測(cè)位點(diǎn)的真?zhèn)危≧itchie et al.，2010；Ye et al.，2019）。當(dāng)細(xì)胞系內(nèi)源表達(dá)的miRNAs包含供試miRNA時(shí)，也可通過(guò)外源轉(zhuǎn)入miRNA的抑制劑（如Inhibitors或Sponge vectors）對(duì)其表達(dá)進(jìn)行抑制（Tang et al.，2017；Zhang et al.，2018）。經(jīng)過(guò)miRNA處理后的細(xì)胞系，報(bào)告基因表達(dá)的蛋白產(chǎn)物可通過(guò)Western雜交、免疫組化、流式細(xì)胞術(shù)等方法進(jìn)行定量分析（任禹珂等，2021）。需要指出的是，報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)中miRNA和結(jié)合序列是在人工干預(yù)的異源系統(tǒng)里進(jìn)行相互作用，而在活體中miRNA和靶基因的表達(dá)均存在時(shí)空特異性；克隆到載體上的序列可能會(huì)因?yàn)槎?jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化而產(chǎn)生假陽(yáng)性或假陰性的結(jié)果；細(xì)胞系內(nèi)復(fù)雜多樣的生理生化過(guò)程也可能會(huì)干擾試驗(yàn)結(jié)果。

6 展望

病蟲(chóng)害的頻繁發(fā)生一直是限制農(nóng)業(yè)發(fā)展的重要難題?；瘜W(xué)農(nóng)藥是當(dāng)前防治病蟲(chóng)害的主要手段，但其不合理的使用造成了嚴(yán)重的環(huán)境問(wèn)題和人畜安全問(wèn)題。選育抗病蟲(chóng)品種往往費(fèi)時(shí)費(fèi)力，難以滿(mǎn)足生產(chǎn)的迫切需求?；赗NA沉默技術(shù)的RNA生物農(nóng)藥的研發(fā)帶來(lái)了新的農(nóng)藥革命，該方法可用于殺蟲(chóng)劑、殺菌劑、除草劑等多種新型農(nóng)藥的研制，并兼具特異性強(qiáng)、環(huán)境友好等特點(diǎn)，為可持續(xù)植保的發(fā)展提供了新的途徑（Dhandapani et al.，2019；Niehl and Heinlein，2019）。

鑒于miRNA在動(dòng)物和植物中的重要功能，開(kāi)發(fā)miRNA生物農(nóng)藥成為未來(lái)病蟲(chóng)害防治的重要選擇。如何使目的miRNA成功作用于靶標(biāo)生物，是利用該技術(shù)進(jìn)行病蟲(chóng)害防治的關(guān)鍵。目前主要總結(jié)了兩種miRNA遞送方式：一種是利用轉(zhuǎn)基因或基因編輯技術(shù)使植物內(nèi)源表達(dá)目的miRNA片段，待病原物侵染或昆蟲(chóng)取食時(shí)，miRNA進(jìn)入有害生物體內(nèi)發(fā)揮相應(yīng)的功能，該方式被稱(chēng)為寄主誘導(dǎo)的基因沉默（Hostinduced gene silencing）；另一種方式是將體外合成的功能性miRNA經(jīng)過(guò)穩(wěn)定性處理制作成相應(yīng)的殺菌劑或殺蟲(chóng)劑，直接施用在作物上，該方式被稱(chēng)為噴灑誘導(dǎo)的基因沉默（Spray-induced gene silencing）（Wang and Jin，2017；Zotti et al.，2018）。迄今為止，至少有5項(xiàng)基于RNAi原理的生物農(nóng)藥獲準(zhǔn)在田間投入使用，展現(xiàn)出了良好的應(yīng)用前景。但需要指出的是，并不是所有的植物都能通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育商業(yè)化的抗病蟲(chóng)品種，也不可能做到同時(shí)防治多種病蟲(chóng)害。對(duì)于外源施用的RNA生物農(nóng)藥，除了較高的生產(chǎn)成本外，在田間的穩(wěn)定性和持效性也一直是研究人員需要解決的難題。此外，為了避免脫靶效應(yīng)和潛在的安全風(fēng)險(xiǎn)，miRNA的序列設(shè)計(jì)和靶基因的篩選均必須經(jīng)過(guò)嚴(yán)密的科學(xué)論證。

經(jīng)過(guò)十余年的發(fā)展，miRNA靶基因的預(yù)測(cè)和鑒定已發(fā)展成為一門(mén)較為系統(tǒng)的學(xué)科，為miRNA的功能鑒定和應(yīng)用研發(fā)提供了便利。本研究對(duì)當(dāng)前mi-RNA靶基因預(yù)測(cè)和驗(yàn)證的研究方法進(jìn)行較為系統(tǒng)地概述和比較，不僅指出這些方法的優(yōu)勢(shì)和特色，還認(rèn)識(shí)到當(dāng)前研究手段的不足。通常，miRNA-mRNA復(fù)合體的形成需要考慮時(shí)間和空間上的特異性，因此，基于序列匹配的算法預(yù)測(cè)實(shí)際上并不能真實(shí)反應(yīng)生物體內(nèi)的相互作用模式?，F(xiàn)有的預(yù)測(cè)方法是在不丟失真實(shí)靶標(biāo)的原則下盡量剔除無(wú)關(guān)結(jié)果，但受限于目前的miRNA理論研究的不足，想要兼顧預(yù)測(cè)的靈敏度和精確度仍有較大的距離。鑒于各種算法各有其利弊，學(xué)者們通常利用多個(gè)算法或手段分別進(jìn)行預(yù)測(cè)后，再對(duì)結(jié)果集合進(jìn)行比對(duì)。

對(duì)于今后miRNA靶基因預(yù)測(cè)領(lǐng)域的發(fā)展，可著重關(guān)注以下3個(gè)方面：（1）miRNA和mRNA的互補(bǔ)配對(duì)要考慮表達(dá)時(shí)間和空間上的一致性；（2）盡管已有不少算法增加了RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)分析，但對(duì)于較長(zhǎng)序列的結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)仍缺乏準(zhǔn)確性，預(yù)測(cè)時(shí)也沒(méi)有考慮規(guī)避蛋白結(jié)合位點(diǎn)等功能區(qū)域；（3）miRNA-mRNA復(fù)合體的形成及穩(wěn)定性機(jī)制方面的研究仍不夠完善，現(xiàn)有的理論基礎(chǔ)不能很好的支撐新算法的研發(fā)。在驗(yàn)證預(yù)測(cè)結(jié)果時(shí)，還應(yīng)注意以下情況：（1）miRNA過(guò)表達(dá)時(shí)通常能使其表達(dá)水平上調(diào)成百上千倍，可能會(huì)引起一些副作用并干擾了其他內(nèi)源基因的表達(dá)；（2）人工干預(yù)下的靶基因驗(yàn)證系統(tǒng)往往忽略了miRNA和mRNA的組織特異性表達(dá)特性；（3）改變miRNA的表達(dá)水平可能導(dǎo)致上千個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生變化，但這種變化可能來(lái)自于靶基因變化而引起的間接調(diào)控；（4）不同miRNA在與靶基因結(jié)合過(guò)程中可能存在競(jìng)爭(zhēng)或者協(xié)同作用，單一改變某個(gè)miRNA的含量可能無(wú)法模擬出真實(shí)的情況；（5）miRNA對(duì)靶基因的上調(diào)作用在目前的研究中往往被忽視。