曾省都，鐘斌，唐曉媛

(贛南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院，江西 贛州 341000)

肺癌是全球患病人數(shù)最多的惡性腫瘤，世界衛(wèi)生組織將肺癌分為兩大組織學亞型[非小細胞肺癌(NSCLC)和小細胞肺癌(SCLC)]，其中NSCLC占肺癌總病例數(shù)的85%[1]。NSCLC的亞型又被分為腺癌(占所有肺癌的38.5%)、鱗狀細胞癌(20%)和大細胞癌(3%)[2]。近幾十年來，隨著NSCLC早期診斷和治療技術的不斷進步，NSCLC的病死率有所下降[3]。然而，大部分NSCLC患者初次確診時已進入中晚期，導致患者失去手術根治機會，預后較差，5 年生存率只有10%～15%[4]。因此，尋找有效的NSCLC早期診斷生物標志物和治療靶點具有重要意義。

非編碼RNA是一類不能編碼任何蛋白質(zhì)的RNA，微小RNA和長鏈RNA 是目前研究最多的非編碼RNA[5]。環(huán)狀RNA(circRNA)是新發(fā)現(xiàn)的廣泛表達于不同細胞中的非編碼RNA。研究表明[6]，circRNA的異常表達有助于各種癌癥的發(fā)生發(fā)展，如肺癌、肝細胞癌和結(jié)直腸癌。肺癌中circRNA的發(fā)現(xiàn)和對其具體分子機制的深入研究可能會提高肺癌的治療水平。公共基因芯片數(shù)據(jù)庫(GEO)顯示Circ-WHSC1在NSCLC 組織中異常高表達[7]，然而Circ-WHSC1在NSCLC中的影響作用及其潛在機制尚不清楚。

微小RNA在包括NSCLC在內(nèi)的各種癌癥的發(fā)生和進展中發(fā)揮重要作用[8]。早期通過生物信息學分析預測Circ-WHSC1與miR-95-3p結(jié)合的可能性最大，并且miR-95-3p與真核起始因子3B(EIF3B)存在靶向結(jié)合位點。研究發(fā)現(xiàn)[9]，EIF3B在NSCLC細胞中高度表達且與疾病發(fā)展和預后相關。本研究旨在探究Circ-WHSC1通過靶向miR-95-3p上調(diào)EIF3B的表達促進NSCLC細胞增殖的機制。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

NSCLC細胞系包括NCI-A549，NCI-H460，NCI-H125，NCI-H358，SW1537和正常肺上皮細胞BEAS-2B。BEAS-2B在Lonza BEBM基礎培養(yǎng)基中培養(yǎng)。A549和NCI-H460細胞在含10%胎牛血清的杜氏改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)中培養(yǎng)。其余細胞在含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。所有細胞添加100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素，在37 °C培養(yǎng)箱培養(yǎng)。隨機將所有細胞分為空載對照組(轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒載體，即轉(zhuǎn)染si-NC)、敲低組(轉(zhuǎn)染si-Circ-WHSC1)、過表達組(轉(zhuǎn)染Circ-WHSC1過表達質(zhì)粒)、敲低Circ-WHSC1+上調(diào)miR-95-3p組(轉(zhuǎn)染si- Circ-WHSC1、miR-95-3p模擬物各一半)、上調(diào)miR-95-3p組(轉(zhuǎn)染miR-95-3p模擬物，miR-95-3p mimics)及其對照組miR-NC、下調(diào)miR-95-3p組(轉(zhuǎn)染miR-95-3p抑制劑，miR-95-3p inhibitor) 及其對照組inh-NC。

1.2 主要試劑與材料

NSCLC細胞系A549細胞、NCI-H460細胞、NCI-H125細胞、NCI-H358細胞、SW1537細胞及正常肺上皮細胞BEAS-2B均購于全球生物資源中心 (ATCC)；10%胎牛血清購于GE公司；RPMI-1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶和脂質(zhì)體Lipofect-amine2000購于Invitrogen公司(美國)；空質(zhì)粒載體(NC)、Circ-WHSC1過表達質(zhì)粒、Circ-WHSC1特異性小干擾RNA(si-Circ-WHSC1)及其陰性對照物si-NC，miR-95-3p模擬物及其對照物miR-NC，miR-95-3p抑制劑及其對照物inh-NC均購于RiboBio公司(廣州)；細胞計數(shù)試劑盒-8(CCK8)購于MedChemExpress公司(美國)；一抗HMGA2抗體、內(nèi)參GAPDH抗體及對應二抗、Ago2抗體和IgG抗體購于Abcam公司(上海)；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購于Promega公司(Madison，WI，USA)；EZMagnaRIP試劑盒購于Millipore公司(美國)。

1.3 實時定量聚合酶鏈反應

通過使用RNA提取試劑盒，從肺癌細胞和正常上皮細胞中分離RNA，根據(jù)Total試劑說明書提取總RNA，將分別提取得到的細胞總RNA逆轉(zhuǎn)錄成互補DNA(cDNA)。同時擴增各個樣本的目的基因和內(nèi)參基因，每組細胞設計6 個重復孔。采用2-ΔΔCT分析法檢測Circ-WHSC1相對表達量。

1.4 CCK8實驗檢測細胞增殖

通過CCK8檢測細胞增殖情況。在每孔中植入了5 000個肺癌細胞，根據(jù)試劑盒操作說明進行實驗，應用酶標儀檢測450 mm處的吸光度，分別測定A549細胞轉(zhuǎn)染及共轉(zhuǎn)染后24 h，48 h，72 h增殖變化。

1.5 Western blot 實驗

收集細胞用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗，加入150 μL裂解液，采用蛋白定量(BCA)試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度。各組取等量蛋白進行電泳，將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，4 ℃封閉1 h，加入一抗(1∶1 000)于4 ℃孵育過夜。隨后，加入二抗(1∶2 000)室溫雜交1 h，基于Tris的免疫印跡洗滌緩沖液(TBST)洗滌3 次，每次5 min。將電化學發(fā)光(ECL)化學發(fā)光底物均勻加在PVDF膜上，顯色、拍照，用凝膠圖像處理系統(tǒng)進行蛋白條帶的灰度測定，以甘油醛-3-磷酸脫氧酶(GAPDH)為內(nèi)參，比較各組蛋白質(zhì)表達水平。每個實驗重復3 次。

1.6 雙熒光素酶報告實驗

由Promega公司構(gòu)建熒光素酶報告載體Circ-WHSC1野生型(Circ-WHSC1-WT)、Circ-WHSC突變型(Circ-WHSC1-MUT)、EIF3B野生型 (EIF3B-WT) 和EIF3B突變型 (EIF3B-MUT)。將上述載體分別與miR-95-3p mimics 或 miR-95-3p inhibitors轉(zhuǎn)染A549細胞，培養(yǎng)24 h。隨后，檢測各組的熒光素酶活性。

1.7 RNA免疫共沉淀實驗

EZMagnaRIP試劑盒用于RNA免疫共沉淀實驗。首先提取蛋白，將A549細胞置于滅菌的離心管中，加入預冷的RIPA裂解液和蛋白酶抑制劑，于冰上充分研磨后，在冰上靜置30 min。于4 ℃下以1 500 r/min離心20 min，小心吸取上清液。隨后，準備免疫沉淀磁珠，離心管中加入50 μ LA/G磁珠懸液，再加入500 μL RIPA洗滌液，輕輕攪拌混合均勻，將離心管置于磁力架上，使磁珠聚集到離心管管壁的一側(cè)，去除上清。離心管中加入500 μL RIPA洗滌液，輕輕晃動，洗滌磁珠，去上清。隨后，在離心管中加入100 μL RIPA洗滌液，再加入人Ago2抗體，陰性對照組加入IgG抗體，室溫孵育30 min。取上清，再次洗滌磁珠，吸出上清。離心管中加入500 μL RIP洗滌液，短暫渦旋后，將離心管轉(zhuǎn)移至冰上，去上清。得到的RNA-目的蛋白復合物進行純化，隨后進行熒光定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR)分析以進一步分析Circ-WHSC1和miR-95-3p的表達。

1.8 統(tǒng)計學方法

2 結(jié) 果

2.1 Circ-WHSC1在NSCLC細胞系中表達

我們設計了發(fā)散型和收斂型引物來擴增Circ-WHSC1外顯子和線性WHSC1外顯子。使用cDNA和基因組DNA進行RT-qPCR。RT-qPCR數(shù)據(jù)顯示，聚合引物可以擴增基因組DNA和cDNA中的線性WHSC1外顯子，而發(fā)散引物只能擴增cDNA中的Circ-WHSC1外顯子(見圖1a)。在總RNA和多聚核糖體(PolyA) RNA中均可擴增出WHSC1的線性mRNA，而在PolyA RNA中Circ-WHSC1水平顯著降低。此外，Circ-WHSC1在NSCLC細胞系中的表達高于正常肺上皮BEAS-2B細胞(見圖1b)。

(a)：采用隨機引物或寡核苷酸T對A549細胞進行RT-qPCR實驗。(b)：檢測NSCLC細胞中Circ-WHSC1的表達

2.2 Circ-WHSC1對細胞增殖的影響

我們進一步研究了Circ-WHSC1在非小細胞肺癌中的生物學作用。首先檢測了Circ-WHSC1對肺癌細胞生長的影響。在A549細胞中成功轉(zhuǎn)染Circ-WHSC1(見圖2a)。Circ-WHSC1的沉默顯著抑制了癌細胞的增殖(見圖2b)。而過表達Circ-WHSC1則促進了癌細胞的增殖(見圖2c)。

(a)：將無義siRNA和Circ-WHSC1 siRNA分別轉(zhuǎn)染A549細胞；(b)：si-Circ-WHSC1抑制細胞增殖；(c)：過表達Circ-WHSC1促進細胞增殖；(d)：生物信息學分析預測miR-95-3p與Circ-WHSC1之間可能存在的結(jié)合位點

2.3 Circ-WHSC1與miR-95-3p的靶向關系

為了進一步探究Circ-WHSC1的下游機制，我們通過生物信息學網(wǎng)站預測發(fā)現(xiàn)miR-95-3p與Circ-WHSC1之間可能存在結(jié)合位點(見圖2d)。隨后，我們采用雙熒光素酶報告實驗驗證二者的結(jié)合關系，結(jié)果顯示上調(diào)miR-95-3p顯著抑制Circ-WHSC1-WT的熒光素酶活性，下調(diào)miR-95-3p顯著促進Circ-WHSC1-WT的熒光素酶活性；而上調(diào)或下調(diào)miR-95-3p對Circ-WHSC1-MUT的熒光素酶活性無顯著影響(見圖3a)。隨后，采用免疫共沉淀實驗進一步驗證二者的結(jié)合關系，結(jié)果顯示miR-95-3p與Circ-WHSC1在Ago2組中高度富集，這表明二者可直接結(jié)合(見圖3b)。

2.4 Circ-WHSC1通過吸附miR-95-3p對NSCLC細胞的增殖作用

為了進一步驗證Circ-WHSC1是否通過吸附miR-95-3p對 NSCLC 細胞增殖和凋亡發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，我們將si-Circ-WHSC1和 miR-95-3pmimics單獨或共轉(zhuǎn)染A549細胞。CCK8實驗和流式細胞術結(jié)果顯示，與si-NC組相比，敲低Circ-WHSC1抑制A549細胞增殖，上調(diào)miR-95-3p促進增殖，共轉(zhuǎn)染si-Circ-WHSC1+miR-95-3p mimics可逆轉(zhuǎn)敲低Circ-WHSC1對細胞增殖的抑制作用(見表1)。

表1 轉(zhuǎn)染后細胞OD值

2.5 Circ-WHSC1通過吸附miR-95-3p上調(diào)EIF3B的表達

隨后，我們試圖進一步探究miR-95-3p的下游機制，通過數(shù)據(jù)庫，我們發(fā)現(xiàn)EIF3B是miR-95-3p的潛在靶基因之一，雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果顯示，上調(diào)miR-95-3p可顯著抑制EIF3B-WT的熒光素酶活性，下調(diào)miR-95-3p可顯著促進EIF3B-WT的熒光素酶活性；而miR-95-3p對 EIF3B-MUT 的熒光素酶活性無影響(見圖4a)。Western blot 結(jié)果顯示，相比于對照組，敲低Circ-WHSC1可顯著抑制EIF3B的表達，而上調(diào)miR-95-3p可逆轉(zhuǎn)敲低Circ-WHSC1對EIF3B表達的抑制作用 (見圖4b、圖5)。

(a)：miR-95-3p與EIF3B的雙熒光素酶實驗；(b)：WB法檢測Circ-WHSC1通過吸附miR-95-3p上調(diào)EIF3B對A549細胞EIF3B蛋白表達的影響

WB法檢測Circ-WHSC1通過吸附miR-95-3p上調(diào)EIF3B對A549細胞EIF3B蛋白表達條帶圖

3 討 論

肺癌已經(jīng)成為全球健康的沉重負擔。近幾十年來，非小細胞肺癌的診斷和治療發(fā)展緩慢，晚期患者的5 年生存率在20%以下，局部晚期或轉(zhuǎn)移性疾病的患者大多失去了手術機會[10]。臨床上對非小細胞肺癌研究不斷深入，研究者在分子生物學領域?qū)ふ曳切〖毎伟┘毎麧撛诘陌悬c與標志物，用于治療非小細胞肺癌患者，提高患者生存率。研究非小細胞肺癌的早期診斷和致癌因素有助于尋找新的靶向治療方法。CircRNA是新發(fā)現(xiàn)的RNA形式，在哺乳動物細胞中廣泛表達，穩(wěn)定性和基因保守性是CircRNA的兩個最重要的特征[11]。所有這些特征表明，與其他非編碼RNA(如微小RNA和長鏈RNA)相比，CircRNA作為癌癥生物標志物更有前景[12]。近年來，CircRNA在癌癥中的作用越來越受到研究人員的關注，研究CircRNA的功能將為癌癥的治療提供更多的新思路。通過改變CircRNA在腫瘤中的表達水平，可以間接調(diào)節(jié)腫瘤的良性或惡性發(fā)展，如在肝癌細胞中，過表達Circ-100395可抑制細胞增殖、誘導細胞凋亡、降低細胞的遷移和侵襲能力[13]。本文主要報告了Circ-WHSC1通過靶向miR-95-3p上調(diào)EIF3B的表達促進NSCLC細胞增殖。

非小細胞肺癌的進展是一個涉及多種因素的復雜過程。已有研究報道了CircRNA在非小細胞肺癌組織中的表達譜，然而，CircRNA的具體功能至今仍不清楚。因此，對非小細胞肺癌中CircRNA的研究對非小細胞肺癌的治療具有重要意義。Circ-WHSC1是由WHSC1基因產(chǎn)生的。據(jù)報道[14]，WHSC1在癌癥中起致癌作用。然而，Circ-WHSC1直到近幾年才被發(fā)現(xiàn)，Circ-WHSC1在癌癥中的作用至今研究較少。CircRNA最重要的功能是通過海綿吸附微小RNA來調(diào)節(jié)基因的表達。本文通過生物信息學分析預測Circ-WHSC1與miR-95-3p結(jié)合位點，通過雙螢光素酶實驗報告以及免疫共沉淀實驗驗證了Circ-WHSC1與miR-95-3p的靶向調(diào)控關系。已有報道m(xù)iR-95-3p可調(diào)控多種癌基因，上調(diào)miR-95-3p可促進腫瘤進展機制。此外，miR-95-3p的上調(diào)激活了mTOR通路，促進了細胞增殖。研究報道[15]，miR-95-3p可以靶向腫瘤相關通路中的許多致癌基因(如EGFR，PIK3CD等)，表明在癌癥中具有顯著的促進作用。微小RNA是長度為19～25 個核苷酸的內(nèi)源性短鏈非編碼RNA，在調(diào)控基因表達中起關鍵作用。微小RNA可參與調(diào)控與癌癥發(fā)展過程相關的多種信號通路，包括 DNA損傷修復通路、凋亡信號通路和成纖維細胞生長因子受體信號通路等[16]。我們進行RT-qPCR、熒光素酶報告實驗證實Circ-WHSC1是miR-95-3p的海綿。通過生物信息學分析，我們注意到了EIF3B。EIF3B是EIFs家族中常見的成員之一，已發(fā)現(xiàn)在許多癌癥中過表達，包括食管鱗狀細胞癌、透明細胞腎癌和前列腺癌。此外，在腎透明細胞癌患者中，EIF3B高表達與侵襲性腫瘤表型相關，在膀胱癌和前列腺癌患者中，EIF3B的表達與腫瘤分級呈正相關[17]。表明EIF3B的過度表達與多種癌癥的發(fā)展有關。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-95-3p靶基因上調(diào)EIF3B促進NSCLC細胞增殖，推測可能原因是EIF3B通過調(diào)節(jié)多種基因表達或通路激活，包括下調(diào)整合素α5的表達、抑制腫瘤壞死因子的表達或激活β-catenin信號通路，促進細胞增殖、細胞遷移或抑制細胞凋亡，導致非小細胞肺癌細胞擴散。

本研究進行了諸多實驗，證明Circ-WHSC1是非小細胞肺癌進展過程中的致癌因子，Circ-WHSC1通過上調(diào)miR-95-3p的水平和增加EIF3B的表達來促進肺癌的發(fā)展。Circ-WHSC1通過靶向miR-95-3p上調(diào)EIF3B的表達可能成為NSCLC的治療靶點。既往也有研究發(fā)現(xiàn)，EIF3B與NSCLC細胞周期、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、自噬和耐藥等密切相關，但本研究未對此進行分析，需要未來深入探討。