宋 娜，李竹生，張艷麗

（鄭州職業(yè)技術(shù)學(xué)院 生物標(biāo)志物定量檢測河南省工程實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450121）

低聚木糖亦稱木寡糖（xylooligosaccharide，簡稱XOS)，由2～7個(gè)D-木糖以β-1,4-糖苷鍵連接而成的功能性聚合糖[1]。低聚木糖具有優(yōu)異生物學(xué)特性[2]，如增殖雙歧桿菌的能力，不被消化、預(yù)防齲齒，促進(jìn)人體鈣吸收等，被廣泛地應(yīng)用于食品、藥品和化妝品等工業(yè)中。

我國是一個(gè)農(nóng)業(yè)大國，以玉米秸稈為代表的農(nóng)林生物質(zhì)原料來源廣泛、價(jià)格低廉，在很多方面有著巨大的潛在利用價(jià)值，玉米秸稈高值化利用是近幾年來的熱門話題[3]。以農(nóng)林生物質(zhì)材料制備新型功能性聚合糖——低聚木糖逐漸成為研究者的研究熱點(diǎn)。關(guān)海寧等[4]通過響應(yīng)面法對微波預(yù)處理輔助木聚糖酶制備稻殼低聚木糖的工藝進(jìn)行了優(yōu)化；孫軍濤等[5]通過單因素和正交試驗(yàn)確定了超聲波輔助復(fù)合酶法制備玉米芯低聚木聚糖的最佳工藝。玉米秸稈中半纖維素含量較高，且為木聚糖類半纖維素，是制備低聚木糖的理想原料，超聲波在酶催化水解過程中具有協(xié)同作用[6]。本試驗(yàn)采用超聲波處理玉米秸稈，用木聚糖酶和纖維素酶組成的復(fù)合酶對超聲波處理后的玉米秸稈液進(jìn)行酶解制備低聚木糖，該方法反應(yīng)條件溫和可控、安全、無污染，創(chuàng)新了以玉米秸稈為原料制備低聚木糖技術(shù)，提高了玉米秸稈附加值利用，對保護(hù)環(huán)境，維護(hù)生態(tài)平衡有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

材料：玉米秸稈收集于鄭州市滎陽郊區(qū)，除去稈皮，粉碎過60目篩，用水洗凈，于45℃鼓風(fēng)干燥箱中烘干，裝密封袋備用。

1.2 主要試劑

木聚糖酶和纖維素酶，上海源葉生物科技有限公司；3,5-二硝基水楊酸，天津市大茂化學(xué)試劑廠；乙腈，色譜級，天津市大茂化學(xué)試劑廠；木糖、木二糖、木三糖、木四糖、木五糖的分析標(biāo)準(zhǔn)品，上海源葉生物科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)儀器設(shè)備

HH-US型恒溫振蕩培養(yǎng)箱，江蘇新春蘭科學(xué)儀器有限公司；ES-J型分析天平，廈門萊斯德科學(xué)儀器有限公司；UV-8000型紫外分光光度計(jì)，上海精密儀器儀表公司；TGL-16型離心機(jī)，長沙湘儀試驗(yàn)儀器有限公司；XO-1800D超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，南京先歐儀器制造有限公司：LC981-AAA型高效液相色譜儀，上海五豐科學(xué)儀器有限公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1超聲波-復(fù)合酶法制備玉米秸稈低聚木糖工藝方法

1.4.1.1超聲處理玉米秸稈提取木聚糖

考察不同超聲波溫度和超聲處理時(shí)間對木聚糖提取率的影響。稱取20.00 g玉米秸稈放入燒杯，加入400 mL去離子水后進(jìn)行超聲波處理。

1.4.1.2復(fù)合酶水解制備低聚木糖

用NaOH溶液調(diào)節(jié)超聲處理后玉米秸稈液pH值至5.8，添加一定量配比的復(fù)合酶，在50℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中酶解。酶解結(jié)束后，將酶解液置于沸水浴煮沸10 min滅酶活性。取上清液測定還原糖含量、可溶性總糖含量和平均聚合度。

1.5 試驗(yàn)分析方法

1.5.1還原糖含量測定：DNS法[7]；

1.5.2可溶性總糖測定

向酶解后的玉米秸稈渣液中加入質(zhì)量濃度為72.00 g/L的濃硫酸，沸水浴2 h，冷卻后，用6 mol/L的氫氧化鈉溶液中和至中性，用DNS法測定可溶性總糖的含量。

1.5.3平均聚合度（DP）的計(jì)算

DP=可溶性總糖含量/還原糖含量

1.5.4單因素試驗(yàn)

分別選擇超聲波溫度、超聲處理時(shí)間、木聚糖酶和纖維素酶配比、復(fù)合酶添加量和酶解時(shí)間作為影響因素，以酶解液中還原糖含量、可溶性總糖含量及平均聚合度為指標(biāo)，研究各因素對制備玉米秸稈低聚木糖的影響。

1.5.5超聲波-酶法制備玉米秸稈低聚木糖優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法（Box-Behnken）試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以超聲波溫度、超聲處理時(shí)間、復(fù)合酶添加量、酶解時(shí)間為影響因素，以酶解液中還原糖含量為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)4因素3水平的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)方案。

1.6 低聚木糖高效液相色譜法（HPLC）分析

色 譜 柱：ShimNex S-NH2-SOG，3.5 μm，4.6×250mm；流動(dòng)相：乙腈：水65：35；流速：10 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；柱溫：80℃；樣品濃度：20 mg/mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1超聲波溫度對玉米秸稈低聚木糖制備的影響

分別設(shè)定超聲波溫度為30℃、40℃、50℃、60℃、70℃的條件下，超聲處理玉米秸稈60 min，添加2.0%（相對于玉米秸稈干物料，下同）的復(fù)合酶（木聚糖酶和纖維素酶按1∶1配比）酶解3 h，考察超聲波溫度對低聚木糖制備的影響。結(jié)果如圖1所示：隨著超聲波溫度的升高，還原糖含量和可溶性總糖含量先逐漸升高后有些許降低，平均聚合度隨溫度升高逐漸降低。當(dāng)超聲波溫度達(dá)到50℃時(shí)，還原糖含量和可溶性總糖含量達(dá)到最大，分別為36.87mg/g和75.29 mg/g，此時(shí)平均聚合度為2.04。這是因?yàn)橛衩捉斩捴邪肜w維素是以氫鍵和范德華力與木質(zhì)素緊密連接，使得植物細(xì)胞之間具有一定的抗降解能力，阻止了結(jié)構(gòu)多糖的酶解聚合，超聲波主要通過空化效應(yīng)與機(jī)械效應(yīng)作用于玉米秸稈，超聲溫度越高，產(chǎn)生的超聲波空化效應(yīng)越劇烈，對玉米秸稈細(xì)胞壁的破碎能力越強(qiáng)，利于糖組分的溶出。但隨著超聲波溫度的繼續(xù)升高，破壞糖的結(jié)構(gòu)，使還原糖糖含量和可溶性總糖含量下降。故超聲波溫度選擇50℃。

圖1 超聲波溫度對玉米秸稈低聚木糖制備的影響

2.1.2超聲波處理時(shí)間對玉米秸稈低聚木糖制備的影響

設(shè)定超聲波溫度50℃，分別超聲處理玉米秸稈20 min、30 min、40 min、50 min、60 min，添加2.0%復(fù)合酶（木聚糖酶和和纖維素酶酶按1∶1配比）酶解3h，考察超聲處理時(shí)間對低聚木糖制備的影響，結(jié)果如圖2所示：隨著超聲處理時(shí)間的延長，還原糖含量和可溶性總糖含量先升高后逐漸降低，平均聚合度逐漸降低；當(dāng)超聲超過處理時(shí)間達(dá)到40 min時(shí)，還原糖含量和可溶性總糖含量最高，分別為：35.93 mg/g和73.86 mg/g，此時(shí)平均聚合度為2.06。這是因?yàn)閯傞_始超聲處理時(shí)超聲波產(chǎn)生的空化效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng)促進(jìn)玉米秸稈結(jié)構(gòu)的破壞，加速糖的溶出；但隨著超聲處理時(shí)間的延長，部分溶出的糖降解為糠醛，導(dǎo)致酶解液中還原糖含量和可溶性總糖含量降低。因此，選擇超聲處理時(shí)間為40 min。

圖2 超聲波處理時(shí)間對玉米秸稈低聚木糖制備的影響

2.1.3復(fù)合酶配比對玉米秸稈低聚木糖制備的影響

設(shè)定超聲波溫度50℃處理玉米秸稈40 min，添加2.0%復(fù)合酶（木聚糖酶和纖維素酶分別按3∶1、2∶1、1∶1、1∶2配比）酶解3 h，考察復(fù)合酶配比對低聚木糖制備的影響，結(jié)果如圖3所示：當(dāng)木聚糖酶與纖維素酶配比為2∶1時(shí)，酶解液中還原糖含量最大，達(dá)到34.76 mg/g，可溶性總糖含量為49.91 mg/g，平均聚合度為2.08。這是因?yàn)槟揪厶峭ㄟ^木聚糖酶、纖維素酶等進(jìn)行水解，由于木聚糖酶具有優(yōu)異的定向水解能力，能夠隨著酶解反應(yīng)的深入，破壞植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)，使更多低聚木糖溶出。當(dāng)纖維素酶占的比例大時(shí)，纖維素酶充分降解了植物細(xì)胞壁的纖維素骨架，使木聚糖很容易從細(xì)胞壁中溶出，溶出的總糖量增加，因?yàn)槟揪厶桥c酶蛋白間反應(yīng)位點(diǎn)空間有限，當(dāng)木聚糖酶過量時(shí)這些活性位點(diǎn)將會全部被木聚糖酶占據(jù)，而多余的酶只會與底物形成無效吸附，反而使酶解率降低、成本增加；而木聚糖酶占的比例較低時(shí)，沒有足夠的木聚糖酶降解木聚糖，使還原糖的量降低。綜合還原糖、可溶性總糖量以及平均聚合度指標(biāo)，復(fù)合酶的配比選擇2∶1。

圖3 復(fù)合酶配比對玉米秸稈低聚木糖制備的影響

2.1.4復(fù)合酶添加量對玉米秸稈低聚木糖制備影響

選擇溫度為50℃超聲處理玉米秸稈40 min，分別添加0.25%、0.50%、1.00%、1.25%、1.50%的復(fù)合酶（木聚糖酶和纖維素酶之比為2∶1）酶解3 h，考察復(fù)合酶添加量對低聚木糖制備的影響。結(jié)果如圖4所示：還原糖含量和可溶性總糖含量均呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，當(dāng)復(fù)合酶的添加量從0.50%增加至1.00%時(shí)，可溶性總糖的含量和平均聚合度逐漸增加，并在復(fù)合酶添加量為1.00%時(shí)還原糖含量和可溶性總糖達(dá)到最高，分別為34.87 mg/g和68.25mg/g。此時(shí)平均聚合度為1.96。平均聚合度隨著復(fù)合酶添加量的增大逐漸減小。這是因?yàn)楫?dāng)復(fù)合酶添加量小于1.00%時(shí)，酶解反應(yīng)體系中底物木聚糖過量，反應(yīng)速率的增加隨著復(fù)合酶的增加而增大。隨著復(fù)合酶添加量進(jìn)一步增加，還原糖的產(chǎn)量略有下降。這可能是由于反應(yīng)體系中自由水的量減少，混合效率低下，導(dǎo)致物質(zhì)間的傳質(zhì)效能降低，進(jìn)而限制了木聚糖水解進(jìn)程。因此，選擇復(fù)合酶的添加量為1.00%。

圖4 復(fù)合酶添加量對玉米秸稈低聚木糖制備的影響

2.1.5酶解時(shí)間對玉米秸稈低聚木糖制備的影響

在超聲波溫度50℃條件下處理玉米秸稈40min，添加1.0%的復(fù)合酶（木聚糖酶和纖維素酶之比為2∶1），分別酶解10 min、20min、30 min、40 min、50 min，考察復(fù)合酶酶解時(shí)間對低聚木糖制備的影響。結(jié)果如圖5所示：還原糖含量和可溶性總糖含量均呈現(xiàn)先升高后有些許下降，平均聚合度逐漸降低。當(dāng)酶解30 min時(shí)，酶解液中還原糖含量和可溶性總糖達(dá)到最高，分別為35.37 mg/g和68.49 mg/g。此時(shí)平均聚合度為1.94。在酶解反應(yīng)初期，木聚糖酶與木聚糖粗液充分接觸，使得還原糖和總糖產(chǎn)量迅速上升，隨著木聚糖粗液消耗量不斷加大，反應(yīng)趨于相對飽和的狀態(tài)，最后還原糖質(zhì)量濃度呈現(xiàn)平穩(wěn)的狀態(tài)?？紤]到酶反應(yīng)的高效性以及酶的活性會隨時(shí)間的延長會逐漸降低，還原糖含量增加不明顯，反應(yīng)時(shí)間過長會增加能耗。綜合還原糖、可溶性總糖量以及平均聚合度指標(biāo)，選擇酶解時(shí)間為30 min。

圖5 酶解時(shí)間對玉米秸稈低聚木糖制備的影響

2.2 采用響應(yīng)面分析法對超聲波-酶法制備玉米秸稈低聚木糖的工藝的優(yōu)化

綜合2.1單因素試驗(yàn)結(jié)果，運(yùn)用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以還原糖含量為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)4因素3水平的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)方案。試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 響應(yīng)面因素設(shè)計(jì)水平

2.2.1響應(yīng)面分析方案及結(jié)果

由Design-Expert軟件做響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面分析方案及結(jié)果

2.2.2方差分析

利用Design-Expert軟件對所得結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表3。

從表3可知：模型P＜0.000 1，說明該模型高度顯著，失擬項(xiàng)P=0.152 4（＞0.05），說明失擬項(xiàng)不顯著。說明模型擬合良好，試驗(yàn)誤差小，可以通過此模型來預(yù)測玉米秸稈低聚木糖制備的最優(yōu)條件。一次項(xiàng)(A、C、D)、交互項(xiàng)A和C、二次項(xiàng)（A2、D2）對結(jié)果影響顯著(P≤0.05)，說明因素超聲波溫度，復(fù)合酶添加量和酶解時(shí)間對還原糖含量的影響線性關(guān)系顯著，超聲波溫度和復(fù)合酶添加量交互作用對低聚木糖制備影響顯著。

2.2.3響應(yīng)曲面圖分析

通過Design Expert 10.0.7軟件分別做出超聲波溫度和復(fù)合酶添加量交互作用的響應(yīng)曲面，結(jié)果如圖6所示：超聲波溫度和復(fù)合酶添加量對水解液中還原糖含量的影響顯著，還原糖含量的變化均是隨兩者的增大而增大。隨著超聲波溫度的升高，復(fù)合酶添加量減小，表現(xiàn)為曲線較陡，曲面圖越陡表示交互作用強(qiáng)。超聲波溫度和復(fù)合酶添加量之間的交互作用對玉米秸稈制備低聚木糖的影響與表3中的方差分析結(jié)果一致。

圖6 超聲波溫度和復(fù)合酶添加量的交互作用對低聚木糖制備結(jié)果影響的響應(yīng)面圖

表3 回歸模型方差分析表

2.2.4最佳提取條件的驗(yàn)證

通過Design Expert 10.0.7軟件預(yù)測最佳制備玉米秸稈低聚木糖的條件：超聲波溫度56.38℃，超聲處理時(shí)間42.89 min，復(fù)合酶添加量0.806%，酶解時(shí)間28.17 min，酶解液中還原糖含量36.24 mg/g。為了驗(yàn)證預(yù)測條件與實(shí)際工藝的符合性，做驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)合實(shí)際情況，選擇超聲波溫度56℃，超聲處理時(shí)間40 min，復(fù)合酶添加量0.80%，酶解時(shí)間30 min，做3次平行驗(yàn)證，酶解液中還原糖含量實(shí)際平均值為36.43 mg/g，與理論預(yù)測值基本一致。此時(shí)，可溶性總糖含量為74.32 mg/g,平均聚合度為2.04。表明該模型可較好地?cái)M合玉米秸稈低聚木糖制備過程。

2.2.5HPLC成分分析

從低聚木糖的HPLC分析圖可以看出：制備的低聚木糖產(chǎn)物除少量木糖外，主要是木二糖和木三糖。木二糖和木三糖在酶解產(chǎn)物中占比82.7%。低聚木糖組成不同，功能不同，作為益生元的一種，低聚木糖的活性組分以木二糖、木三糖和木四糖為優(yōu)，可改善腸道微生態(tài)，調(diào)節(jié)人體生理機(jī)能，促進(jìn)機(jī)體對鈣、鐵等礦物質(zhì)吸收[8]。用此方法制備的低聚木糖可很好滿足低聚木糖作為益生元的活性組分的需求。

圖7 低聚木糖的HPLC分析圖

3 結(jié)論與討論

應(yīng)用響應(yīng)面分析法優(yōu)化超聲波-復(fù)合酶法制備玉米秸稈低聚木糖工藝，得出最佳工藝條件為：超聲波溫度56℃，超聲處理時(shí)間40 min，復(fù)合酶（木聚糖酶和纖維素酶之比為2∶1）添加量0.8%，酶解時(shí)間30 mim，酶解液中還原糖含量為36.43 mg/g，可溶性總糖含量為74.32 mg/g,平均聚合度為2.04。HPLC分析顯示：制備的低聚木糖的主要成分為木二糖和木三糖。該研究結(jié)果可為超聲波-復(fù)合酶法制備玉米秸稈低聚木糖工藝提供一定的參考依據(jù)。