嚴(yán)國鴻，許 文，徐 偉

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院，福建 福州 350004；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122；3.福建中醫(yī)藥大學(xué)生物醫(yī)藥研發(fā)中心，福建 福州 350122）

蔞芍痙攣平方［1］包括瓜蔞、白芍、桂枝、川芎、地龍、華重樓、甘草7味藥材，干預(yù)腦卒中后癱瘓肢體肌肉痙攣療效確切。由于湯劑的服用量大、攜帶不便、易發(fā)霉變質(zhì)、口感差等缺點(diǎn)［2］，其應(yīng)用受到限制。根據(jù)福建省《醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑注冊管理辦法》及原國家食品藥品監(jiān)督管理總局《關(guān)于對醫(yī)療機(jī)構(gòu)應(yīng)用傳統(tǒng)工藝配制中藥制劑實(shí)施備案管理的公告》（2018年第19號）等要求，擬將蔞芍痙攣平方開發(fā)成院內(nèi)制劑蔞芍痙攣平顆粒，以擴(kuò)大臨床使用范圍。中藥復(fù)方具有“多成分，多靶點(diǎn)”的治療特性，評價(jià)提取工藝優(yōu)劣時(shí)僅憑單一或少數(shù)成分具有局限性，故需進(jìn)行多成分考察。近年來，超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）法因其分離速度快、靈敏度高、測定專屬性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，廣泛用于中藥及復(fù)方制劑復(fù)雜體系的分析中［3-6］。為應(yīng)對目前中藥復(fù)方提取工藝的瓶頸，本研究中基于質(zhì)量源于設(shè)計(jì)（QbD）理念，采用UPLC-MS/MS法同時(shí)測定萎芍痙攣平顆粒多成分含量，并結(jié)合G1-熵權(quán)法，通過正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝，為后續(xù)中藥復(fù)方的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Xevo TQ-S型超高效液相色譜串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀（美國Waters公司）；CPA225D型十萬分之一分析天平（德國Sartorius公司）；Milli-Q超純水儀（美國Millipore公司）；HDM-2000型調(diào)溫恒溫電熱套（常州國華電器有限公司）。

1.2 試藥

芍藥苷對照品（批號為110736-201842，含量97.4%），甘草苷對照品（批號為111610-201908，含量95.0%），木犀草苷對照品（批號為111720-201810，含量98.2%），肉桂酸對照品（批號為110786-201503，含量97.9%），阿魏酸對照品（批號為110773-201915，含量99.4%），甘草酸對照品（批號為110731-202021，含量97.7%），重樓皂苷Ⅶ對照品（批號為100081-201610，含量98.1%），重樓皂苷Ⅱ?qū)φ掌罚ㄅ枮?11591-201604，含量98.4%），重樓皂苷Ⅰ對照品（批號為111590-201604，含量98.3%），均購于中國食品藥品檢定研究院。甲酸為色譜純，甲醇、乙腈為質(zhì)譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。瓜蔞根藥材飲片（批號為180701）、白芍藥材飲片（批號為201101）、地龍藥材飲片（批號為200801），均購于北京本草方源（亳州）藥業(yè)科技有限公司；桂枝藥材飲片（亳州市慈濟(jì)堂中藥飲片有限公司，批號為2010012）；川芎藥材飲片（安國市一方藥業(yè)有限公司，批號為20090303）；重樓藥材飲片（湖北金貴中藥飲片有限公司，批號為A201105）；甘草藥材飲片（廈門燕來福制藥有限公司，批號為201126）。飲片均經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物實(shí)驗(yàn)室范世明高級實(shí)驗(yàn)師鑒定為正品。

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測定

2.1.1 試驗(yàn)條件

色譜條件：色譜柱為Waters CORTECS C18柱（100 mm×2.1 mm，1.6 μm）；流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～0.5 min時(shí)87%B；0.5～4.5 min時(shí)87%B→80%B；4.5～6.5 min時(shí)80%B→68%B；6.5～9.0 min時(shí)68%B→10%B）；流速為0.25 mL/min；柱溫為40℃；進(jìn)樣量為2 μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧正負(fù)離子多反應(yīng)監(jiān)測模式；毛細(xì)管電壓2.5 kV；錐孔電壓3.00 V；脫溶劑氣流為氮?dú)猓魉?00 L/h，脫溶劑溫度500℃；錐孔氣流為氮?dú)?，流?0 L/h；離子源溫度150℃；提取因子（Extractor）3.00 V；碰撞氣體為氬氣。各成分質(zhì)譜檢測其他參數(shù)見表1（其中ES+為正離子模式，ES-為負(fù)離子模式）。

表1 各成分質(zhì)譜檢測參數(shù)Tab.1 Mass spectrometry parameters of each component

2.1.2 溶液制備

取芍藥苷、甘草苷、木犀草苷、肉桂酸、阿魏酸、甘草酸、重樓皂苷Ⅶ、重樓皂苷Ⅱ、重樓皂苷Ⅰ對照品各適量，精密稱定，加20%甲醇溶解制成上述成分質(zhì)量濃度分別為1.038，0.782，1.072，0.741，0.944，1.128，0.992，1.052，1.058 mg/mL的單一對照品貯備液。精密量取各適量，加20%甲醇稀釋得上述成分質(zhì)量濃度分別為103.80，15.64，5.36，7.41，4.72，56.40，4.96，5.26，5.29 μg/mL的混合對照品溶液。按后續(xù)提取工藝提取蔞芍痙攣平顆粒，將所得提取液（含1個(gè)處方量75 g藥材飲片：瓜蔞、白芍藥材飲片各18 g，桂枝、川芎、地龍藥材飲片各9 g，重樓、甘草藥材飲片各6 g）濃縮，加水定容至100 mL，精密吸取0.1 mL，置50 mL容量瓶中，加20%甲醇定容，經(jīng)0.22 μm濾膜濾過，即得供試品溶液。以20%甲醇作為空白對照溶液。

2.1.3 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：取2.1.2項(xiàng)下除單一對照品貯備液外的3種溶液各適量，按2.1.1項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果供試品溶液色譜中，在與混合對照品溶液相應(yīng)位置有相應(yīng)吸收峰。詳見圖1。

圖1 超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜圖1.Paeoniflorin 2.Liquiritin 3.Cynaroside 4.Cinnamic acid 5.Ferulic acid 6.Glycyrrhizic acid 7.PolyphyllinⅦ8.PolyphyllinⅡ9.PolyphyllinⅠA.Blank reference solution B.Mixed reference solution C.Test solutionFig.1 UPLC-MS/MS chromatograms

線性關(guān)系考察：精密吸取2.1.2項(xiàng)下混合對照品溶液20，50，100，200，400，1 000 μL，分別置10 mL容量瓶中，加20%甲醇定容，搖勻，分別取適量，按2.1.1項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以各待測成分質(zhì)量濃度（X，ng/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，回歸方程和線性范圍見表2。

檢測限和定量限考察：取9種待測成分的單一對照品貯備液各適量，逐一稀釋，按2.1.1項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，以信噪比（S/N）為3和10時(shí)待測成分的質(zhì)量濃度分別記作檢測限和定量限。結(jié)果見表2。

表2 線性關(guān)系及檢測限、定量限考察結(jié)果Tab.2 Results of linear relation test，limit of detection and limit of quantitation

精密度試驗(yàn)：取混合對照品溶液適量，按2.1.1項(xiàng)下試驗(yàn)條件，1 d內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣測定6次，以及連續(xù)3 d、每天進(jìn)樣測定3次，記錄峰面積。結(jié)果芍藥苷、甘草苷、木犀草苷、肉桂酸、阿魏酸、甘草酸、重樓皂苷Ⅶ、重樓皂苷Ⅱ、重樓皂苷Ⅰ日內(nèi)精密度的RSD分別為3.21%，

2.31%，3.42%，2.49%，2.02%，2.22%，1.59%，1.12%，3.23%（n=6）；日間精密度的RSD分別為2.57%，1.39%，2.72%，3.11%，1.52%，2.51%，2.61%，3.27%，1.51%（n=3），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取供試品溶液適量，室溫下分別于0，2，4，8，12，24 h時(shí)按2.1.1項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果芍藥苷、甘草苷、木犀草苷、肉桂酸、阿魏酸、甘草酸、重樓皂苷Ⅶ、重樓皂苷Ⅱ、重樓皂苷Ⅰ峰面積的RSD分別為3.51%，2.89%，2.22%，3.23%，2.44%，2.12%，3.48%，2.11%，1.79%（n=6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：精密吸取同一樣品提取液0.1 mL，共6份，按2.1.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1.1項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，并計(jì)算含量。結(jié)果芍藥苷、甘草苷、木犀草苷、肉桂酸、阿魏酸、甘草酸、重樓皂苷Ⅶ、重樓皂苷Ⅱ、重樓皂苷Ⅰ的平均含量分別為每0.1 mL含393.86，31.74，18.94，15.88，10.18，36.86，14.92，7.88，8.96 μg，RSD分 別 為3.48%，3.02%，3.63%，3.82%，4.19%，2.71%，2.34%，3.29%，3.21%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：精密吸取已知含量的樣品提取液0.05 mL，分別加入各成分對照品適量，按2.1.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1.1項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見表3。

表3 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab.3 Results of the recovery test（n=6）

2.2 得膏率測定

1個(gè)蔞芍痙攣平顆粒處方量的藥材飲片經(jīng)后續(xù)最佳提取工藝提取后，離心，濾過，精密吸取25 mL，60℃減壓濃縮得浸膏，真空干燥48 h得干浸膏，計(jì)算得膏率。得膏率=（m干×V）/（25×m總）×100%，其中m干為干燥膏質(zhì)量（g），V為提取液體積（mL），m總為復(fù)方提取飲片總質(zhì)量（g）。

2.3 提取工藝研究

2.3.1 單因素考察

浸泡時(shí)間：稱取1組蔞芍痙攣平顆粒藥材飲片（每組2份，每份75 g），加10倍量水（約750 mL）浸泡，分別于0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 h時(shí)取出，稱定質(zhì)量，計(jì)算吸水率。結(jié)果見表4?？梢?，浸泡3 h后吸水率幾乎達(dá)到峰值，且隨浸泡時(shí)間延長吸水率趨于平緩，故浸泡時(shí)間確定為3 h。

表4 浸泡時(shí)間考察結(jié)果（n=2）Tab.4 Results of the investigation of soaking time（n=2）

提取時(shí)間：取蔞芍痙攣平顆粒藥材飲片適量（每組平行2次），共5組，加8倍量水，浸泡3 h，分別加熱回流1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 h（保持微沸），提取1次，按2.1項(xiàng)下UPLC-MS/MS法測定9個(gè)成分的含量，計(jì)算得膏率。結(jié)果見表5。

加水量：取蔞芍痙攣平顆粒藥材飲片適量（每組平行2次），共5組，分別加入6，8，10，12，15倍量水，浸泡3 h，加熱回流2 h（保持微沸），提取1次，同法測定9個(gè)成分的含量，計(jì)算得膏率。結(jié)果見表5。

提取次數(shù)：取蔞芍痙攣平顆粒中藥飲片適量（每組平行2次），共3組，分別加入8倍量水，浸泡3 h，加熱回流1.5 h（保持微沸），分別提取1，2，3次，同法測定9個(gè)成分的含量，計(jì)算得膏率。結(jié)果見表5。

表5 提取時(shí)間、加水量及提取次數(shù)考察結(jié)果（n=2）Tab.5 Results of the investigation of extraction time，water addition and extraction times（n=2）

2.3.2 綜合評分（Pj）計(jì)算

各指標(biāo)權(quán)重賦值采用評價(jià)指標(biāo)G1法主觀賦權(quán)和熵權(quán)法客觀賦權(quán)相結(jié)合的組合賦權(quán)法。

G1法［7-8］：設(shè)同級評價(jià)指標(biāo)為｛x1，x2，…，xm｝，確定各指標(biāo)順序關(guān)系。設(shè)rk為wk-1于wk的重要程度之比，且k=m，m-1，…，2，則wk-1=rkw（k=m，m-1，…，2）。計(jì)算權(quán)重系數(shù)wk，公式如下。

熵權(quán)法［9-10］：對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)矩陣歸一化，設(shè)m個(gè)評價(jià)指標(biāo)，n個(gè)評價(jià)對象的試驗(yàn)數(shù)據(jù)矩陣為X=（xij）n×m，對其歸一化后得到屬性矩形R=（rij）n×m，對效益型屬性（指屬性值愈大愈好的指標(biāo)）而言，進(jìn)行歸一化，公式如下。

其中xij為第i個(gè)評價(jià)對象的第j項(xiàng)指標(biāo)數(shù)據(jù)，xjmax、xjmin分別為xij的最大值、最小值，i=1，2，…，n；j=1，2，…，m。

求取指標(biāo)熵值sj，公式如下。

其中fij為正交數(shù)據(jù)經(jīng)矩陣排列后第j項(xiàng)指標(biāo)下第i個(gè)樣本值占該指標(biāo)的比重，當(dāng)fij=0時(shí)，xijlnn=0。并計(jì)算各指標(biāo)權(quán)重系數(shù)wj，公式如下。

G1-熵權(quán)法的組合權(quán)重確定［11］：設(shè)定由G1法得到的主觀權(quán)重為w1，熵權(quán)法得到的客觀權(quán)重為w2，組合權(quán)重wj計(jì)算公式如下。

依據(jù)復(fù)方“君臣佐使”配伍原則及功效相關(guān)藥效物質(zhì)，由G1法確定7個(gè)評價(jià)指標(biāo)的重要性依次為得膏率（源于全方）>木犀草苷（源于瓜蔞）>芍藥苷（源于白芍）=肉桂酸（源于桂枝）>重樓皂苷（Ⅰ+Ⅱ+Ⅶ源于華重樓）>阿魏酸（源于川芎）>甘草苷+甘草酸（源于甘草），權(quán)重評價(jià)標(biāo)度分別為r2（得膏率及木犀草苷）=1.5、r3（木犀草苷及芍藥苷）=1.2、r4（芍藥苷及肉桂酸）=1.0、r5（肉桂酸及重樓皂苷Ⅰ+Ⅱ+Ⅶ）=1.2，r6（重樓皂苷Ⅰ+Ⅱ+Ⅶ及阿魏酸）=1.2、r7（阿魏酸及甘草苷、甘草酸）=1.2，求得7個(gè)指標(biāo)主觀權(quán)重值w1，再用熵權(quán)法計(jì)算各指標(biāo)客觀權(quán)重值w2，然后計(jì)算組合權(quán)重值w和綜合評分Pj，計(jì)算公式如下，權(quán)重值見表6。

表6 提取工藝評價(jià)指標(biāo)權(quán)重值Tab.6 Weight value of evaluation indexes of the extraction process

2.3.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)考察結(jié)果，以加水量（X）、提取時(shí)間（Y）、提取次數(shù)（Z）為考察因素，以芍藥苷、甘草苷+甘草酸、木犀草苷、肉桂酸、阿魏酸、重樓皂苷Ⅰ+Ⅱ+Ⅶ的含量及得膏率的綜合評分Pj為評價(jià)指標(biāo)，進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。因素和水平見表7，試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果見表8，方差分析結(jié)果見表9。由表8及表9可知，因素X，Y，Z對蔞芍痙攣平顆粒水提工藝均有顯著影響（P<0.05），且影響強(qiáng)度為Z>X>Y。因此，確定最佳工藝為X3Y3Z2，即每次水提時(shí)，加10倍量水，浸泡3 h，提取2次，每次2.0 h。

表7 因素與水平Tab.7 Factors and their levels

表8 L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab.8 Design and results of the L9（34）orthogonal test

表9 方差分析結(jié)果Tab.9 Results of the ANOVA

2.2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

分別稱取3份處方量藥材飲片，共225 g，按最佳工藝條件進(jìn)行水提，并計(jì)算得膏率，結(jié)果見表10?？梢姡?個(gè)成分含量的RSD值均小于2.50%（n=3），表明該方法穩(wěn)定、可行。

表10 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果（n=3）Tab.10 Results of the verification test（n=3）

3 討論

3.1 評價(jià)指標(biāo)選擇

蔞芍痙攣平方是福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院梁暉主任臨床經(jīng)驗(yàn)方，由經(jīng)典方栝樓（瓜萎）桂枝湯加減而成，方中君藥瓜蔞，味甘、微苦，性寒，入肺胃二經(jīng)，清熱瀉火、潤燥柔筋，用于此方，既能清熱降火以消熱之源，又能生津柔筋以緩脈急，益陰分津液，養(yǎng)其筋經(jīng)，標(biāo)本兼顧。輔以桂枝、芍藥為臣藥，桂枝味辛、甘，性溫，入血分，溫經(jīng)通脈活絡(luò)；芍藥味酸、甘，性寒，養(yǎng)陰舒筋，益君藥養(yǎng)陰柔肝，舒筋止痛。佐以華重樓，其味苦，性微寒，歸肝經(jīng)，清熱解毒，涼肝定驚；川芎味辛，性溫，入肝、膽心包經(jīng)，活血行氣，祛風(fēng)止痛；地龍味咸，性寒，歸肝、脾經(jīng)，清熱涼血、通絡(luò)止痛，擅治高熱神昏、驚癇抽搐、關(guān)節(jié)痹痛、肢體麻木、半身不遂；以炙甘草為使藥，調(diào)和諸藥，益氣和中。全方具有清熱養(yǎng)陰、柔筋緩急、活血通絡(luò)之效。以2020年版《中國藥典（一部）》與現(xiàn)代藥理學(xué)研究為指導(dǎo)，瓜蔞在藥典中雖無指標(biāo)性成分，但研究表明，其中木犀草苷成分能抑制腦組織核因子κB激活信號，從而發(fā)揮重要的神經(jīng)保護(hù)作用，為腦缺血治療提供有效方法［12］。白芍中芍藥苷可作為一種新型的抗血小板藥物，通過調(diào)節(jié)血管性血友病因子與血小板糖蛋白Ib（GP Ib）的相互作用，抑制剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的血小板聚集和擴(kuò)張血管，促進(jìn)血液流通［13］，又能抑制神經(jīng)炎性蛋白ASK1磷酸化，從而減輕神經(jīng)病理性疼痛［14］，對于腦卒中的治療具有重要意義。桂枝的指標(biāo)性成分肉桂酸，在桂枝中含量較高［15］，且具有通過內(nèi)皮依賴的方式松弛血管，誘導(dǎo)血管舒張，達(dá)到促進(jìn)血流通暢的作用［13］。川芎中阿魏酸能抑制Toll樣受體/髓樣分化因子88信號通路，并對氧供應(yīng)不足和血流恢復(fù)不足的腦缺血疾病起到保護(hù)作用［16］；華重樓中的重樓皂苷（Ⅰ，Ⅱ，Ⅶ）可抑制內(nèi)皮素的分泌，降低血壓，保護(hù)心血管系統(tǒng)［17］。甘草中甘草苷和甘草酸具有很強(qiáng)的抗炎活性，能通過減少巨噬細(xì)胞炎性因子的釋放和抑制前列腺素E2合成的花生四烯酸代謝途徑中的關(guān)鍵酶［18］，緩解腦卒中引發(fā)的神經(jīng)炎癥。因此，綜合全方的指標(biāo)性成分，最終選擇用于優(yōu)化提取工藝的指標(biāo)成分為木犀草苷、芍藥苷、肉桂酸、重樓皂苷Ⅰ+Ⅱ+Ⅶ、阿魏酸、甘草苷+甘草酸。

3.2 主客觀賦權(quán)結(jié)合正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

為獲得全方活性成分最佳提取工藝參數(shù)，先通過單因素試驗(yàn)，以浸泡時(shí)間、加水量、提取時(shí)間以及提取次數(shù)為考察因素，再通過正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝條件。因該方前期臨床采用湯劑，且患者使用后有確切療效，結(jié)合預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，確定本課題沿用水作為提取溶劑。在該過程中，賦予各指標(biāo)權(quán)重直接關(guān)系到結(jié)果的科學(xué)合理性。本試驗(yàn)中采用了近些年在中藥提取工藝領(lǐng)域常用的G1-熵權(quán)法［19-21］，其中，G1法為主觀賦權(quán)法，該方法依據(jù)處方中“君臣佐使”配伍規(guī)律進(jìn)行賦權(quán)，木犀草苷、芍藥苷、肉桂酸、重樓皂苷Ⅰ+Ⅱ+Ⅶ、阿魏酸及甘草苷+甘草酸的主觀權(quán)重系數(shù)分別為0.168 9，0.140 7，0.140 7，0.117 3，0.097 7，0.081 4。得膏率可直觀反映水溶性成分的總含量，因此加大其主觀權(quán)重系數(shù)為0.253 3。熵權(quán)法為客觀賦權(quán)法，該方法的權(quán)重系數(shù)由試驗(yàn)數(shù)據(jù)綜合評判而來，最后將主觀與客觀權(quán)重系數(shù)相結(jié)合，得到組合權(quán)重系數(shù)。該方法既可避免只根據(jù)專家主觀評判而忽視試驗(yàn)數(shù)據(jù)特征，又可避免忽視專家經(jīng)驗(yàn)的主觀信息而過于依賴數(shù)據(jù)，使結(jié)果更科學(xué)、合理。

綜上所述，蔞芍痙攣平顆粒最佳提取工藝為，藥材飲片加10倍量水浸泡3 h，煎煮2次，每次2 h。該工藝數(shù)據(jù)可為后期蔞芍痙攣平顆粒申報(bào)院內(nèi)制劑奠定基礎(chǔ)。