時(shí)曉麗,楊 洋,張會(huì)茹,羅愛國

(晉中學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)系，山西晉中 030619)

四溴乙基環(huán)己烷(tetrabromoethylcyclohexane)，又名1,2-二溴-4-(1,2-二溴乙基)環(huán)己烷(TBECH或DBE-DBCH)，是一種被廣泛用于泡沫塑料、黏合劑、塑料制品和電力電纜涂料等材料的新型溴代阻燃劑(NBFRs)。TBECH被認(rèn)為是傳統(tǒng)溴代阻燃劑多溴聯(lián)苯醚(PBDEs)和六溴環(huán)十二烷(HBCDs)的潛在替代品。研究表明，TBECH具有潛在的環(huán)境持久性和長距離遷移性，其較高的親脂性(log=5.24)意味著TBECH具有潛在的生物富集性和放大性。TBECH已被美國環(huán)保署列入環(huán)境關(guān)注的化合物。

截至目前，TBECH在環(huán)境介質(zhì)、生物體內(nèi)、甚至非職業(yè)暴露人群的血清中被檢出。TBECH的生物毒性效應(yīng)受到廣泛關(guān)注。體外試驗(yàn)和對魚類、鳥類等體內(nèi)試驗(yàn)研究表明，TBECH具有內(nèi)分泌干擾毒性、神經(jīng)毒性、免疫毒性和腎毒性。此外，TBECH具有多模式內(nèi)分泌干擾作用，包括雌激素、抗雄激素和甲狀腺激素等毒性作用。目前關(guān)于TBECH的毒性效應(yīng)多集中在水生生物和動(dòng)物體內(nèi)。但是，關(guān)于新型溴代阻燃劑TBECH對植物毒性的影響才開始受到關(guān)注。

土壤是溴代阻燃劑重要的匯，溴代阻燃劑進(jìn)入土壤后迅速與土壤有機(jī)質(zhì)結(jié)合。因此，溴代阻燃劑的生物富集與土壤有機(jī)質(zhì)的含量和性質(zhì)有關(guān)。植物是陸地生態(tài)系統(tǒng)的基本生命組成部分，能夠吸收、富集和代謝一定濃度的有機(jī)污染物，如殺蟲劑、雙酚類似物和阻燃劑等。有機(jī)污染物可以通過植物吸收進(jìn)入食物鏈，從而對野生動(dòng)物和人類健康造成風(fēng)險(xiǎn)。為了更好地了解植物對有機(jī)污染物的生化和分子反應(yīng)，有必要檢測有機(jī)污染物的植物毒性。目前，關(guān)于傳統(tǒng)溴代阻燃劑(如PBDEs)的植物毒性效應(yīng)已經(jīng)有了較為深入的研究。PBDEs能夠誘導(dǎo)植物細(xì)胞產(chǎn)生過量活性氧(ROS)，引起玉米根細(xì)胞膜脂過氧化、蛋白羰基化和DNA雙鏈斷裂等損傷，影響植物組織和細(xì)胞的正常代謝過程，最終導(dǎo)致植物生長受到抑制甚至死亡。西葫蘆和蘿卜通過自身吸收轉(zhuǎn)運(yùn)PBDEs到地上部分來減少其在環(huán)境中的含量，提高土壤中PBDEs的生物有效性，進(jìn)而增加人類暴露風(fēng)險(xiǎn)。

綠豆(L.)屬于豆科草本植物，富含多種營養(yǎng)物質(zhì)，且具有強(qiáng)的固氮能力，可以有效改善土壤肥力，是我國的主要糧食作物之一。該研究采用綠豆為受試植物，探究TBECH對綠豆種子萌發(fā)和幼苗生長的影響，通過測定種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢、干重、鮮重以及幼苗株高、根長、過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)的活性來初步研究TBECH對綠豆的毒性效應(yīng)，為評價(jià)TBECH對綠豆的毒性作用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

供試綠豆為大同小明綠豆種子(購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院)。TBECH(純度>95%)購自上海艾美克生化有限公司。其他試劑購自北京化學(xué)試劑公司，均為分析純。

配制不同濃度(0、60、120、180 μg/L)的TBECH溶液備用。選擇大小相近飽滿的綠豆為供試植物。3% HO對綠豆種子處理30 min，用蒸餾水進(jìn)行反復(fù)沖洗。

種子暴露：在鋪有2層濾紙的培養(yǎng)皿中各放置10粒綠豆種子，并加入25 mL不同濃度暴露液。對照組用等量的去離子水培養(yǎng)，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)平行。將種子置于25 ℃相對空氣濕度80%的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行避光培養(yǎng)。幼苗暴露：發(fā)芽4 d后，將長勢均一的綠豆幼苗轉(zhuǎn)移至錐形瓶進(jìn)行暴露，每瓶放置10顆幼苗，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)平行。置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，白天光照14 h，暗培養(yǎng)10 h。每天更換暴露溶液以消除濃度改變的影響。在每個(gè)暴露瓶外部用鋁箔包裹以防TBECH發(fā)生光解。

從綠豆暴露第2天起，每天記錄露白數(shù)、發(fā)芽數(shù)、根長至種子體長1/2數(shù)。分別在第3天和第6天，計(jì)算每個(gè)處理種子的發(fā)芽勢和發(fā)芽率。

發(fā)芽率=第6天供試綠豆種子發(fā)芽數(shù)/總種子數(shù)×100%

發(fā)芽勢=第3天供試綠豆種子發(fā)芽數(shù)/總種子數(shù)×100%

鮮重的測定。發(fā)芽試驗(yàn)結(jié)束后，定性濾紙吸干水分，用電子天平稱量15粒綠豆種子的總鮮重。每個(gè)濃度各取3個(gè)平行組種子鮮重的平均值。

干重的測定。發(fā)芽試驗(yàn)結(jié)束后，分別從各組中隨機(jī)選取5粒綠豆種子，放入電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中于105 ℃下烘15 min后調(diào)至80 ℃烘干至綠豆種子恒重，用電子天平稱其干重。每個(gè)濃度各取3個(gè)平行組干重的平均值。

選取生長狀況良好、長勢相似的9株幼苗，連續(xù)5 d進(jìn)行根長、株高的測量。將綠豆植株水平放置，直接用尺子測量株高。由于根部彎曲脆弱故采用細(xì)線測量，做好標(biāo)記后用尺子測量標(biāo)記長度，觀察在不同濃度下綠豆生長狀況的變化。

用無菌水清洗綠豆幼苗，拭去水分，稱取幼苗鮮樣0.3 g置于玻璃研磨器中，在冰浴中加少量石英砂，用5 mL KHPO將幼苗研磨成勻漿，轉(zhuǎn)入離心管，4 ℃ 4 000 r/min離心15 min，取上清液，即得到樣品粗酶液。

采用Bradford法，以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)測定幼苗中的蛋白含量。采用愈創(chuàng)木酚法測定POD的活性，在470 nm波長下測定其吸光度，根據(jù)吸光度計(jì)算POD活性。采用紫外吸收法測定CAT活性，在波長240 nm下測定其吸光度，根據(jù)吸光度計(jì)算CAT活性。

利用GraphPad Prism 5進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)分析采用多組獨(dú)立樣本(≥3)單因素方差分析，<0.05表示數(shù)據(jù)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

暴露于不同濃度TBECH(0、60、120、180 μg/L)溶液中綠豆種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、鮮重和干重見圖1。從圖1可以看出，隨著TBECH濃度的增加，TBECH對種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢的影響無顯著差異。與對照組相比，綠豆種子的鮮重和干重隨著TBECH濃度的增加而顯著下降。在60～180 μg/L，鮮重從3.37 g下降到2.91 g，干重從100.08 mg下降到75.67 mg。

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05) Note: Different lowercase letters indicate significant difference (P<0.05)圖1 不同濃度TBECH對綠豆種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢、鮮重和干重的影響Fig.1 Effects of different concentrations of TBECH on germination rate, germination potential,fresh weight and dry weight of Vigna radiata seeds

從圖2可以看出，TBECH對綠豆幼苗莖的伸長有顯著的抑制作用且具有濃度依賴性(<0.05)。與對照組相比，當(dāng)TBECH濃度為180 μg/L時(shí)，株高由5.4 cm降低至3.4 cm，僅為對照組的63.0%。TBECH處理5 d后，根系生長形態(tài)出現(xiàn)顯著變化。隨著暴露濃度的增加，主根和側(cè)根變短，側(cè)根數(shù)量減少，且主根出現(xiàn)斷裂的情況。TBECH濃度達(dá)到180 μg/L時(shí)，主根的根長由4.9 cm 降低至0.9 cm,是對照組的18.4%(<0.05)。TBECH對幼苗主根生長的抑制作用高于對莖的抑制，可能是由于根部富集的有機(jī)污染物濃度較高的原因。

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05) Note: Different lowercase letters indicate significant difference (P<0.05)圖2 不同濃度TBECH對綠豆幼苗株高和根長的影響Fig.2 Effects of different concentrations of TBECH on plant height and root length of Vigna radiata seedlings

不同濃度TBECH溶液處理綠豆幼苗5 d后，測定綠豆幼苗中2種抗氧化酶POD和CAT的活性變化(圖3)。從圖3可以看出，隨著暴露濃度的增加，POD的活性呈上升趨勢；當(dāng)暴露濃度為60、120、180 μg/L時(shí)，處理組幼苗POD的活性顯著升高，分別是對照組的1.3、2.0和2.1倍(<0.05)。CAT的活性隨著TBECH暴露濃度的增加而顯著升高；濃度為180 μg/L時(shí)，CAT的活性達(dá)到最大值，是對照組的3.2倍。該研究結(jié)果表明在最高濃度的TBECH處理下，POD和CAT活性顯著增加，表明TBECH能夠誘導(dǎo)綠豆幼苗發(fā)生氧化損傷，導(dǎo)致綠豆幼苗生長延遲。

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05) Note: Different lowercase letters indicate significant difference (P<0.05)圖3 不同濃度TBECH對綠豆幼苗抗氧化酶POD和CAT活性的影響Fig.3 Effects of different concentrations of TBECH on the activities of antioxidant enzymes POD and CAT in Vigna radiata seedlings

3 小結(jié)與討論

種子萌發(fā)期間的生長狀況直接影響著植物的生長發(fā)育和產(chǎn)量。目前，已有多種苗期生長指標(biāo)用于研究多溴聯(lián)苯醚、六溴環(huán)十二烷等有機(jī)污染物的生態(tài)毒理學(xué)效應(yīng)。該研究選用綠豆作為受試植物，研究不同濃度TBECH對綠豆種子萌發(fā)和幼苗生長的影響。將綠豆種子和幼苗暴露于0～180 μg/L TBECH中，發(fā)現(xiàn)TBECH能夠抑制綠豆種子的萌發(fā)和幼苗生長；TBECH能夠顯著降低種子的鮮重和干重等生物量，但對種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢的影響無顯著差異。Xu等研究發(fā)現(xiàn)多溴聯(lián)苯醚BDE-47、6-OH-BDE-47和6-MeO-BDE-47均能夠抑制玉米種子的萌發(fā)，暴露濃度為5 μg/L 時(shí)，玉米種子的發(fā)芽率分別為76.2%、73.6%和66.3%，與該研究的結(jié)果不一致。王練書研究發(fā)現(xiàn)100 mg/kg高溴代阻燃劑BDE-209能夠降低玉米的發(fā)芽率，與該研究的結(jié)果一致。據(jù)報(bào)道，PBDEs通過影響植物的結(jié)構(gòu)和功能，破壞色素體膜系統(tǒng)、類囊體、線粒體結(jié)構(gòu)，進(jìn)而抑制植物的生長發(fā)育。綠豆種子生物量的顯著下降表明，TBECH可能通過種皮滲透進(jìn)入植物細(xì)胞，影響細(xì)胞質(zhì)膜的組分、透性和運(yùn)輸?shù)龋M(jìn)而損害膜的正常生理功能，破壞細(xì)胞的代謝作用。張瓊等研究發(fā)現(xiàn)3 mg/L 4,4′-二溴聯(lián)苯醚(BDE-15)能夠顯著降低纖細(xì)裸藻的蛋白含量，抑制率達(dá)69.70%。為了抵御TBECH的侵害，種子呼吸作用增強(qiáng)，從而進(jìn)一步影響綠豆的代謝作用。

該研究發(fā)現(xiàn)TBECH對綠豆幼苗莖的伸長有顯著的抑制作用且具有濃度依賴性。當(dāng)TBECH濃度為180 μg/L 時(shí)，株高僅為對照組的63.0%。隨著暴露濃度的增加，主根和側(cè)根變短，側(cè)根數(shù)量減少，且主根出現(xiàn)斷裂的情況。TBECH對幼苗主根生長的抑制作用高于對莖的抑制，可能是根部富集的有機(jī)污染物濃度較高的原因。Wu等研究發(fā)現(xiàn)六溴環(huán)十二烷(HBCD)能夠抑制玉米的生長，HBCD對根的抑制率(31.94%)顯著高于對莖葉的抑制率(11.97%)。玉米地上部分對β-HBCD的總富集量低于根部，主要通過根部吸收和莖向傳輸2種方式進(jìn)行積累。謝顯傳研究發(fā)現(xiàn)100 mg/kg十溴聯(lián)苯醚(BDE-209)對黑麥草株高和根長的抑制率均為25%。李麗華等研究發(fā)現(xiàn)1 000 mg/kg BDE-209使紫花苜蓿的根長減小20.7%，芽長減小18.3%。趙良元研究發(fā)現(xiàn)30 mg/kg BDE-209對水蔥產(chǎn)生毒性作用，使水蔥的株高和莖粗分別降低34.4%和28.1%。以上發(fā)現(xiàn)均與該研究的結(jié)果一致。植物的根是污染物與植物的第一個(gè)接觸點(diǎn)，污染物對植物根系生長的抑制作用會(huì)影響營養(yǎng)物質(zhì)在植物內(nèi)的吸收和運(yùn)輸，進(jìn)而影響莖的伸長。

在污染物脅迫下，植物各組織細(xì)胞產(chǎn)生的活性氧增加，這是植物中毒的普遍表現(xiàn)。如果不及時(shí)清除，會(huì)導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化、DNA損傷和酶活性喪失等效應(yīng)。植物具有由POD和CAT組成的抗氧化防御系統(tǒng)，在清除氧化脅迫產(chǎn)生的活性氧方面發(fā)揮重要作用。植物中毒癥狀較輕時(shí)，植物通過增大抗氧化酶活性來清除活性氧。隨著中毒癥狀的加重，植物的生命力快速下降，抗氧化應(yīng)激能力隨之減弱直至消失，抗氧化酶活性出現(xiàn)低促高抑的現(xiàn)象。在植物體清除ROS過程中POD和CAT起關(guān)鍵作用，POD和CAT催化HO發(fā)生歧化反應(yīng)生成HO和O。隨著污染物暴露濃度的增加，HO水平逐漸升高，最終超過抗氧化酶的清除能力，導(dǎo)致氧化損傷的發(fā)生。抗氧化酶表達(dá)水平的改變被認(rèn)為是ROS產(chǎn)物觸發(fā)氧化應(yīng)激的指示物。該研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)幼苗抗氧化酶POD和CAT的活性隨TBECH濃度的增加而顯著提高，最高濃度180 μg/L TBECH的暴露誘導(dǎo)POD和CAT活性顯著增加，分別是對照組的2.1和3.2倍，表明TBECH的脅迫誘導(dǎo)綠豆幼苗發(fā)生氧化應(yīng)激，從而導(dǎo)致綠豆幼苗生長延遲。綠豆為了阻止超氧化物自由基和羥基自由基的形成，激活了綠豆體內(nèi)的抗氧化酶活性，進(jìn)而保護(hù)細(xì)胞膜系統(tǒng)免受損害。孟范平等研究發(fā)現(xiàn)低濃度2，2′，4，4′-四溴聯(lián)苯醚(BDE-47)(0.1和1.0 μg/L)處理海水小球藻24 h能夠誘導(dǎo)其SOD和CAT酶活性增加，隨著暴露時(shí)間的延長這2種酶的活性受到抑制。BDE-209處理雜交狼尾草，其CAT酶活性也呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。武彤等研究發(fā)現(xiàn)β-HBCD能夠誘發(fā)玉米體內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)的應(yīng)激反應(yīng)，SOD和APX(抗壞血酸過氧化物酶)活性出現(xiàn)先增加后降低的趨勢，與該研究的結(jié)果不一致。王丹研究發(fā)現(xiàn)TBECH能夠誘導(dǎo)玉米體內(nèi)活性氧累積量增多和抗氧化酶CAT、SOD和POD基因表達(dá)上調(diào)，與該研究的結(jié)果一致。

綜上所述，TBECH對綠豆具有毒性作用，在綠豆種子中，TBECH能夠顯著降低種子的鮮重和干重等生物量，但對種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢的影響無顯著差異。在綠豆幼苗中，TBECH對綠豆幼苗莖根的伸長有顯著的抑制作用且具有濃度依賴性，TBECH對幼苗主根生長的抑制作用高于對莖的抑制。幼苗抗氧化酶POD和CAT的活性隨TBECH濃度的增加而顯著提高。氧化應(yīng)激可能是導(dǎo)致植物毒性的關(guān)鍵因素。該研究為更全面地了解TBECH的環(huán)境行為和毒性效應(yīng)提供了有價(jià)值的信息。為了闡明TBECH對綠豆的致毒機(jī)制，今后有必要使用組學(xué)技術(shù)結(jié)合分子生物學(xué)手段進(jìn)行進(jìn)一步研究。