陳 臻，曾翠云，張永合，萬家秀

(1.蘭州資源環(huán)境職業(yè)技術(shù)大學(xué)環(huán)境與化工學(xué)院，甘肅蘭州 730021；2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，甘肅蘭州 730000；3.西北中藏藥協(xié)同創(chuàng)新中心，甘肅蘭州 730000)

無土基質(zhì)栽培有效地解決了以往設(shè)施農(nóng)業(yè)與露地農(nóng)業(yè)生產(chǎn)爭地的矛盾，實(shí)現(xiàn)了蔬菜對水分、肥料的高吸收。甘肅現(xiàn)代絲路寒旱農(nóng)業(yè)區(qū)通過循環(huán)利用玉米秸稈等農(nóng)業(yè)廢棄物，以及椰糠、草炭、牛糞等制作無土栽培基質(zhì)，不僅解決了農(nóng)業(yè)面源污染難題，而且實(shí)現(xiàn)了農(nóng)果蔬結(jié)合、農(nóng)牧互補(bǔ)和資源再利用的綠色循環(huán)發(fā)展。無土基質(zhì)栽培已成為現(xiàn)代絲路寒旱農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要環(huán)節(jié)，現(xiàn)已在我國西北地區(qū)大面積推廣應(yīng)用。由于基質(zhì)是作物賴以生存的基礎(chǔ)，戈壁農(nóng)業(yè)中作物生長發(fā)育所需要的養(yǎng)分、水分和土壤微生物都需從基質(zhì)中獲得，尤其是土壤微生物與植物的生長和健康密切相關(guān)，是土壤肥力的重要組成部分和重要保障。

微生物菌劑是從土壤或植物體內(nèi)經(jīng)篩選、分離后得到的一類菌群，再經(jīng)過發(fā)酵等一系列工業(yè)化處理將這些微生物擴(kuò)增培養(yǎng)后加工成一種液態(tài)或固態(tài)的活菌制劑，將其應(yīng)用到農(nóng)作物上，能夠?qū)崿F(xiàn)綠色無污染的現(xiàn)代化農(nóng)業(yè)生產(chǎn)模式。木霉菌(spp.) 是自然界廣泛分布的生防真菌，其中的綠色木霉() 和哈茨木霉() 是常用的微生物菌劑。近年來研究發(fā)現(xiàn)，哈茨木霉協(xié)同秸稈處理對馬鈴薯土壤微生物群落有一定影響，尤其對真菌群落多樣性、群落結(jié)構(gòu)組成影響較大。施用微生物菌劑有利于改善土壤的微生物結(jié)構(gòu)，增加土壤細(xì)菌、放線菌的數(shù)量。

目前，關(guān)于河西走廊戈壁農(nóng)業(yè)區(qū)無土栽培基質(zhì)根際微生物現(xiàn)狀以及微生物菌劑施用后對基質(zhì)的根部微生物群落等影響報(bào)道較少。為此，該研究以溫室大棚栽培土壤作為對照，對比其與栽培基質(zhì)本身的微生物群落結(jié)構(gòu)狀況；并通過在基質(zhì)上施用哈茨木霉，探討微生物菌劑對基質(zhì)微生物群落多樣性的影響，以期為戈壁生態(tài)農(nóng)業(yè)無土栽培基質(zhì)中微生物菌劑的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

供試植物。供試?yán)苯?L.)品種為螺絲椒，市場購買，生產(chǎn)廠家為河北茂華種業(yè)有限公司。

供試微生物菌劑。哈茨木霉，主要菌種為哈茨木霉菌()，有效活孢數(shù)≥10億/g，市場購買，生產(chǎn)廠家為北海亦強(qiáng)生物科技有限公司。

供試基質(zhì)?；|(zhì)購自酒泉康多生態(tài)農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司，以有機(jī)質(zhì)為主要原料，通過高溫發(fā)酵腐熟后，復(fù)配生物菌劑、草炭、珍珠巖，經(jīng)自動化程序加工而成。其中有機(jī)質(zhì)35%～45%，pH中性，腐殖酸15%～25%。

供試土壤。采自白銀區(qū)水川鎮(zhèn)樺皮川村農(nóng)業(yè)示范園溫室大棚。

試驗(yàn)于2021年3—6月在白銀市白銀區(qū)水川鎮(zhèn)樺皮川村農(nóng)業(yè)示范園溫室大棚內(nèi)進(jìn)行，以基質(zhì)栽培為處理1(T)，以土壤栽培為處理2(T)，定植時(shí)將哈茨木霉菌對水稀釋2 000倍后灌根，每株澆灌200 mL。設(shè)1個(gè)對照(CK)，對照用清水噴施，其他栽培方式、條件相同。

取樣：在定植移栽后60 d，按五點(diǎn)取樣法采集0～20 cm土層基質(zhì)(土壤)得到混合土樣。迅速將土樣保存于帶有冰袋的保溫箱中，帶回實(shí)驗(yàn)室，于-20 ℃冰箱保存，備用。

采用 Power Soil DNA Isolation kit 提取試劑盒(MOBIO)，稱取 0.5 g土樣，按試劑盒說明書分別提取供試土壤(T)、噴施哈茨木霉的栽培基質(zhì)(T)和對照(CK)的 DNA。用 0.8% 瓊脂糖凝膠電泳對 DNA的質(zhì)量進(jìn)行檢測，測定DNA的純度和濃度。樣品總 DNA 提取后，對細(xì)菌16S rRNA V3-V4區(qū)和真菌18S rRNA V4區(qū)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增：細(xì)菌引物序列為341F(5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′)和805R(5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′)；真菌引物序列為V4F(5′-GGCAAGTCTGGTGCCAG-3′)和V4R(5′-ACGGTATCTRATCRTCTTCG-3′)。PCR 反應(yīng)成分：Phusion DNA 聚合酶預(yù)混液 12.5 μL，上下引物各 2.5 μL，DNA 50 ng，補(bǔ)無菌水至 25 μL。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)條件：98 ℃預(yù)變性 2 min；98 ℃變性 15 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，25個(gè)循環(huán)；72 ℃ 延伸5 min。用 2% 的瓊脂糖凝膠電泳對 PCR 產(chǎn)物進(jìn)行檢測，PCR 產(chǎn)物的回收采用 AXYGEN 公司的凝膠回收試劑盒，待測定后產(chǎn)物的濃度和特異性合格后，送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

利用 Uparse 軟件對所有有效序列按 97%相似度進(jìn)行分類操作單元(operational taxonomic units，OTUs)劃分；然后選取每個(gè) OTUs 中頻數(shù)最高的代表性序列，進(jìn)行物種注釋，用 Mothur 方法將 OTUs 的代表序列與 SSUrRNA 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行物種注釋，最終獲得分類學(xué)信息。統(tǒng)計(jì)各個(gè)樣本的物種在門、綱、目、科、屬和種分類水平上的分類單元數(shù)量。運(yùn)用QIIME2軟件計(jì)算各樣本微生物群落的α多樣性指數(shù)，以表征物種的豐富度、多樣性及均勻度。采用語言的Venn Diagram包繪制各分類學(xué)水平上的細(xì)菌和真菌基因序列的Venn圖。

2 結(jié)果與分析

從稀釋曲線(圖1)可以看出，從樣本中隨機(jī)抽取一定數(shù)量的序列，隨著抽取的測序數(shù)據(jù)量的增加，細(xì)菌和真菌稀釋曲線均基本趨于平緩，所有個(gè)體的深度測序指數(shù)(Coverage指數(shù))在 0.996 9～0.999 7(表1)，說明該研究的測序結(jié)果有足夠的測序數(shù)據(jù)量，能反映當(dāng)前樣本所包含的多樣性。

圖1 相似度為0.97條件下各土壤細(xì)菌(A)和真菌(B)的稀釋曲線Fig.1 The dilution curve of each soil bacteria (A) and fungi (B) under the condition that the similarity is 0.97

Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)代表了微生物群落結(jié)構(gòu)的變化，Chao1指數(shù)越大，該樣本物種數(shù)越多；Shannon指數(shù)越大，群落多樣性越高。從表1可以看出，辣椒根際土壤(T)細(xì)菌的Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)均為最高，表明在不同的栽培介質(zhì)中，土壤栽培的根際土壤細(xì)菌群落豐富度和多樣性大于栽培基質(zhì)。施用哈茨木霉后處理(T)的細(xì)菌類群的Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)較未施用哈茨木霉(CK)分別提高了16.87%和6.48%，真菌類群(包括其他真核生物)分別提高了17.36%、42.33%，說明施用哈茨木霉后，栽培基質(zhì)中的微生物群落多樣性和物種數(shù)量均有不同幅度的升高。

圖 2 表明，栽培土壤(T)、施用哈茨木霉的栽培基質(zhì)(T)、對照(CK)共有的細(xì)菌 OTUs 數(shù)量為402，T、CK、T特有的 OTUs 數(shù)量分別為639、49、144，可見土壤的細(xì)菌OTUs 數(shù)量最多，哈茨木霉處理后的栽培基質(zhì)細(xì)菌OTUs 數(shù)量高于對照；3種不同處理共有真菌的 OTUs 數(shù)量為117，而T、CK、T特有的真菌OTUs 數(shù)量分別為92、28、29，栽培土壤(T)的真菌群落的 OTUs數(shù)量仍為最高，哈茨木霉處理后的栽培基質(zhì)(T)真菌OTUs數(shù)量略高于對照(CK)。

T、CK和T這3種處理根際土壤中共有24門64綱108目215科378屬細(xì)菌，其中T為21門59綱96目184科295屬，CK為20門51綱86目176科293屬，T為21門55綱95目194科333屬。在細(xì)菌的門、綱、目、科、屬水平，栽培土壤(T)均表現(xiàn)較高。施用哈茨木霉(T)后細(xì)菌類群高于對照(CK)，分別增加了1門、4綱、9目、18科、40屬。各處理細(xì)菌群落在門分類水平上具有較高的多樣性，相對豐度位于前8的分別為變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、酸桿菌門(Acidobacteria)、浮霉菌門(Planctomycetes)、綠彎菌門(Chloroflexi)、疣微菌門(Verrucomicrobia)，其他類群的相對豐度占比為19.81%。在T中變形菌門、擬桿菌門、酸桿菌門為優(yōu)勢菌群，相對豐度分別為 31.55%、22.00%、15.47%；在CK中變形菌門、放線菌門、厚壁菌門為優(yōu)勢菌群，相對豐度分別為 33.79%、22.63%、9.11%；在T中變形菌門、擬桿菌門、厚壁菌門為優(yōu)勢菌群，相對豐度分別為 35.05%、27.68%、16.99%。施用哈茨木霉后，優(yōu)勢菌群中變形菌門、厚壁菌門的相對豐度分別增加了3.73%、86.50%(圖3)。

表1 哈茨木霉處理后辣椒根際土壤細(xì)菌、真菌群落多樣性指數(shù)

圖2 不同處理辣椒根際土壤細(xì)菌(A)和真菌(B)群落的OTUs韋恩圖Fig.2 Venn diagrams of OTUs of bacterial (A) and fungal (B) communities in the rhizosphere soil of pepper under different treatments

圖3 不同處理辣椒根際土壤細(xì)菌群落在門水平上的相對豐度Fig.3 Relative abundance of bacterial communities in the rhizosphere soil of pepper under different treatments at the phylum level

T、CK和T這3種處理根際土壤中共有4門8綱12目14科16屬17種真菌，其中在真菌的門、綱、目、科水平均相同；在屬水平上，T最少，為13屬，CK和T均為16屬；在種水平上，T最少，為12種，CK和T均為17種。施用哈茨木霉(T)真菌類群和對照(CK)數(shù)量無變化。各處理真菌群落在門分類水平上具有較高的多樣性，相對豐度位于前4的土壤真菌群落分別為子囊菌門(Ascomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)、毛霉門(Mucoromycota)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)。其中CK中相對豐度子囊菌門占59.54%，壺菌門、毛霉門、擔(dān)子菌門分別占0.52%、4.85%、0.28%；T中相對豐度子囊菌門占42.20%，壺菌門、毛霉門、擔(dān)子菌門分別占3.88%、0.30%、4.11%。施用哈茨木霉后，優(yōu)勢菌群有增有減，子囊菌門和毛霉門相對豐度分別減少了29.12%和93.81%，壺菌門和擔(dān)子菌門相對豐度分別增加了6.5和13.7倍(圖4)。

圖4 不同處理辣椒根際土壤真菌群落在門水平上的相對豐度Fig.4 Relative abundance of fungal communities in the rhizosphere soil of pepper under different treatments at the phylum level

3 討論

土壤微生物能分解土壤中的動植物殘?bào)w，形成有機(jī)質(zhì)，是最豐富最全面的植物營養(yǎng)來源，有益微生物與根系形成互補(bǔ)共生關(guān)系。無土栽培基質(zhì)在使用前都經(jīng)過高溫滅菌，基質(zhì)中含有微生物很少，但在作物栽培過程中，許多微生物會通過各種途徑進(jìn)入基質(zhì)。在該研究中，溫室大棚中原有栽培土壤中微生物群落不論是細(xì)菌還是真菌群落的豐富度和多樣性均高于栽培基質(zhì)，在施用哈茨木霉后，栽培基質(zhì)中的微生物群落多樣性呈現(xiàn)顯著提升，說明微生物菌劑可對基質(zhì)的改良起到較好的促進(jìn)作用。近年來，微生物菌劑的應(yīng)用越來越廣泛，多種微生物制劑在作物上取得了較好的效果，施用微生物菌肥和菌劑能促進(jìn)農(nóng)作物生長，增加產(chǎn)量，提高品質(zhì)，增加有益菌豐度，減少病原菌豐度，改變土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，改善土壤微環(huán)境。也有研究表明，微生物菌劑對土壤微生物群落多樣性的影響并不明顯，但顯著改變了土壤微生物群落組成，土壤微生物群落通過影響土壤碳、磷循環(huán)的微生物酶活性，從而間接地影響作物產(chǎn)量。

施用微生物菌劑對土壤細(xì)菌群落和真菌群落會產(chǎn)生不同的影響。據(jù)報(bào)道，微生物菌劑的添加對草莓土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了顯著影響，增加了厚壁菌門細(xì)菌的相對豐度，但對真菌的作用不明顯。不同的微生物菌劑對土壤微生物群落影響也不同，施用枯草芽孢桿菌()后，華重樓根際土壤細(xì)菌豐富度和多樣性顯著下降，而解淀粉芽孢桿菌()對細(xì)菌豐富度和多樣性無顯著影響，2種微生物菌劑均對根際土壤中真菌數(shù)量的影響不顯著。長枝木霉處理會增加根際玉米土壤細(xì)菌群落數(shù)量，但會減少真菌群落數(shù)量。施入木霉制劑后，茉莉根圍土壤中細(xì)菌和真菌的數(shù)量顯著提高。在該研究中，施用哈茨木霉后，基質(zhì)細(xì)菌類群較對照分別增加了1門、4綱、9目、18科、40屬，優(yōu)勢菌群中變形菌門、厚壁菌門的相對豐度分別增加了3.73%、86.50%；基質(zhì)真菌類群中優(yōu)勢菌群中子囊菌門和毛霉門相對豐度分別減少了29.12%和93.81%，壺菌門和擔(dān)子菌門相對豐度分別增加了6.5和13.7倍，但在屬和種的水平上基本沒有變化，這與前期相關(guān)學(xué)者的研究結(jié)果基本一致。施用微生物菌劑，可以通過調(diào)節(jié)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和組成，使其中功能菌和激發(fā)的關(guān)鍵微生物來增加作物產(chǎn)量，同時(shí)還能夠提高根際土壤微生物群落代謝能力，促進(jìn)土壤微生物群落對碳源的整體利用，增強(qiáng)代謝活性，提高作物品質(zhì)、改善土壤肥力。因此，未來微生物菌劑在基質(zhì)改良、綠色生產(chǎn)中有廣泛的應(yīng)用前景。

4 結(jié)論

該試驗(yàn)通過研究栽培土壤與栽培基質(zhì)之間微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性差異，以及施用微生物菌劑后對栽培基質(zhì)微生物群落的影響，發(fā)現(xiàn)農(nóng)田栽培土壤的根際土壤細(xì)菌和真菌群落豐富度和多樣性高于栽培基質(zhì)，微生物菌劑的施用顯著提升了栽培基質(zhì)細(xì)菌類群，但對栽培基質(zhì)的真菌類群影響較小。這些結(jié)果為認(rèn)識無土栽培基質(zhì)種植帶來的根際微生態(tài)問題提供了新的視角，可為戈壁農(nóng)業(yè)科學(xué)種植農(nóng)作物、高質(zhì)量持續(xù)發(fā)展提供理論依據(jù)。