劉 歡，吳 薇

(安康學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生物科技學(xué)院，陜西安康 725000)

魔芋(Durieu)屬于天南星科魔芋屬多年生草本植物，含有多種人體必需的微量元素，廣泛應(yīng)用于食品、藥品、農(nóng)業(yè)化工等領(lǐng)域，具有很好的保健功效。陜西是全國(guó)四大魔芋主產(chǎn)省份之一，安康魔芋已經(jīng)被評(píng)為中國(guó)國(guó)家地理標(biāo)志產(chǎn)品。近年來(lái)，隨著魔芋種植面積不斷擴(kuò)大，品種逐漸增多，被稱為“植物癌癥”的各種病毒病逐漸成為制約魔芋產(chǎn)業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵因素。

國(guó)內(nèi)魔芋產(chǎn)區(qū)真菌、細(xì)菌和病毒病害發(fā)生較為普遍，相對(duì)于真菌、細(xì)菌病害，病毒病害的研究薄弱。由于魔芋以無(wú)性繁殖為主，病毒易通過(guò)種芋遠(yuǎn)距離傳播，制約魔芋產(chǎn)業(yè)持續(xù)健康發(fā)展。芋花葉病毒(Dasheen mosaic virus，DsMV)是天南星科植物最重要的病毒病原之一。DsMV主要在天南星科的大田作物、藥用植物以及花卉上侵染為害。其侵染作物后可引起系統(tǒng)癥狀或隱癥現(xiàn)象。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，被DsMV侵染的天南星科作物，產(chǎn)量損失能達(dá)到60%左右。

DsMV是馬鈴薯Y病毒屬()成員，基因組為正義單鏈RNA(+ssRNA)，全長(zhǎng)約10 kb，僅編碼一個(gè)大的多聚蛋白，通過(guò)自身編碼的蛋白酶將多聚蛋白加工成多個(gè)具有功能的蛋白，CP蛋白位于多聚蛋白的末端。目前已公布的DsMV基因組信息多來(lái)自芋頭和馬蹄蓮，而DsMV魔芋分離物基因組信息卻鮮見(jiàn)報(bào)道，或者僅有部分基因序列信息。筆者克隆了DsMV安康魔芋分離物完整的基因，并對(duì)其進(jìn)行了分子特性分析，旨在為建立可靠的病毒分子檢測(cè)方法提供重要信息，并為后續(xù)研究其分子致病機(jī)制打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

感染DsMV的魔芋葉片采集于安康市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，其葉片癥狀表現(xiàn)為嚴(yán)重的黃化、畸形和卷葉。取其新鮮葉片保存于安康學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生物科技學(xué)院分子遺傳實(shí)驗(yàn)室-80 ℃超低溫冰箱備用。

魔芋葉片基因組RNA提取與反轉(zhuǎn)錄。取0.1 g葉片，加入液氮進(jìn)行研磨，迅速轉(zhuǎn)入1.5 mL無(wú)酶離心管中，按照北京康為世紀(jì)的 Omni Plant RNA Kit試劑盒提取說(shuō)明書(shū)操作提取RNA。以RNA為模板，合成cDNA，反應(yīng)總體系為25 μL，包含RNA模板3.0 μL，Oligo D(18)T(TaKaRa，10 μmol/L) 1.0 μL，5×Reaction Buffer 5.0 μL，dNTPs(100 mmol/L each)2.0 μL，M-MLV(Promega)1.0 μL，RiboLock RNase Inhibitor 0.5 μL，RNA-Free Water 12.5 μL。

基因擴(kuò)增與檢測(cè)。根據(jù) GenBank 中登錄的 DsMV基因組序列，使用 mega 6.0 進(jìn)行多重比對(duì)，在基因保守區(qū)域應(yīng)用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增完整的引物CP-F(5′- GCACCATATATTGCTGAAAC -3′)，CP-R(5′-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-3′)，引物由西安擎科公司合成。RT-PCR反應(yīng)體系：cDNA模板2 μL，CP-F引物2 μL，CP-R引物2 μL，PrimeSTAR? Max DNA Polymerase(TaKaRa)25 μL，ddHO 19 μL。PCR反應(yīng)程序：98 ℃變性10 s，52 ℃退火15 s，72 ℃延伸15 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。PCR結(jié)束后，取5 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)。

PCR產(chǎn)物測(cè)序與分析。利用DNA回收純化試劑盒對(duì)RT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收純化，將回收產(chǎn)物與pGEM-T Easy Vector進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α，提取質(zhì)粒送至西安擎科生物公司測(cè)序。使用Vector NTI Advance V11.5.2軟件中的ContigExpress程序，將測(cè)序得到的ABI文件導(dǎo)入，去除NIb和3′-UTR基因序列，獲得完整的序列。從GenBank獲得DsMV不同分離物基因序列，使用MEGA 6.0中的ClustalW算法進(jìn)行多重比對(duì)，采用Neighbor-Joining(NJ)法，將Bootstrap Replications設(shè)置為1 000，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

使用CP-F和CP-R引物，以cDNA為模板，PCR擴(kuò)增得到約1.3 kb的單一條帶(圖1)，與預(yù)期擴(kuò)增到的基因片段大小吻合。

注：M.DS 2000 DNA Marker；1.使用CP-F/R擴(kuò)增健康魔芋葉片樣品；2.使用CP-F/R擴(kuò)增受DsMV侵染的魔芋葉片樣品 Note：M.DS 2000 DNA Marker；1.Amplify healthy Amorphophallus rivieri leaf samples with CP-F/R；2.Use CP-F/R to amplify Amorphophallus rivieri leaf samples infected with DsMV圖1 DsMV cp基因RT-PCR擴(kuò)增Fig.1 RT-PCR amplification of DsMV cp gene

序列經(jīng)過(guò)測(cè)序后拼接，使用ContigExpress程序去除NIb和3′-UTR基因序列，最終得到的DsMV魔芋分離物基因全長(zhǎng)為903 bp，將完整的DsMV序列上傳至GenBank 并獲得ID號(hào)(Access number：ON003977)。

該研究測(cè)定了侵染安康魔芋DsMV的cp核苷酸序列，序列比對(duì)結(jié)果表明，DsMV安康魔芋分離物變異較大，GenBank中所有參與比對(duì)的序列與該研究獲得的DsMV安康魔芋分離物序列的覆蓋度僅72%～80%，一致性為80.30%～87.98%(圖2)。

圖2 比對(duì)序列與目標(biāo)序列的覆蓋度Fig.2 Coverage of the compared sequence and the target sequence

在GenBank上獲得的DsMV分離物信息見(jiàn)表1，與該研究得到的序列聯(lián)合分析。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，DsMV基因可分為3個(gè)組(組I、組II和組III)(圖3)。已公布的DsMV基因多聚集在組I中，這些分離物寄主均是天南星科植物，且分布范圍廣，從進(jìn)化樹(shù)來(lái)看，它們并沒(méi)有寄主特異性，且與寄主地理位置沒(méi)有明顯聯(lián)系；組II中僅有來(lái)自中國(guó)芋頭的一個(gè)分離物；該研究獲得的DsMV 安康魔芋分離物單獨(dú)歸于組III。

3 小結(jié)與討論

DsMV自然狀態(tài)下主要侵染天南星科植物，20世紀(jì)60年代美國(guó)學(xué)者在芋頭中發(fā)現(xiàn)該病毒，之后日本、越南、新西蘭等國(guó)家相繼發(fā)現(xiàn)DsMV侵染不同寄主植物。我國(guó)學(xué)者在20世紀(jì)90年代在馬蹄蓮中通過(guò)血清學(xué)和電子顯微鏡檢測(cè)到DsMV。隨后國(guó)內(nèi)學(xué)者在芋頭、半夏和白附子中相繼發(fā)現(xiàn)DsMV。由于天南星科植物多數(shù)依靠無(wú)性繁殖，病毒主要通過(guò)種苗傳播，亦可通過(guò)蚜蟲(chóng)或機(jī)械摩擦傳播。而我國(guó)是天南星科植物種植大國(guó)，陜西安康嵐皋縣魔芋已經(jīng)被評(píng)為中國(guó)國(guó)家地理標(biāo)志產(chǎn)品。隨著魔芋種植面積增加，加之魔芋常年進(jìn)行無(wú)性繁殖，易導(dǎo)致病毒積累、種性退化，豐產(chǎn)性和品質(zhì)均難以保證。而目前魔芋病毒病的研究?jī)H僅停留在病原鑒定、田間調(diào)查、組織病變和RT-PCR檢測(cè)層面，魔芋中DsMV發(fā)生情況和分子特征卻鮮見(jiàn)報(bào)道。

表1 從NCBI中獲得的DsMV cp序列信息

圖3 DsMV cp基因核苷酸序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of DsMV cp gene nucleotide sequence construction

該研究克隆了侵染安康魔芋的DsMV基因，并對(duì)其進(jìn)行分子特征分析，表明其為完整的DsMV魔芋分離物基因序列，全長(zhǎng)為903 bp，推導(dǎo)編碼的外殼蛋白由301個(gè)氨基酸組成。從結(jié)果看來(lái)，前150 bp序列未參與比對(duì)，可見(jiàn)其堿基序列差異較大，DsMV魔芋分離物與其他寄主分離物之間存在很大的分子變異。由于GenBank中DsMV魔芋分離物序列極少，通過(guò)其他寄主分離物聯(lián)合分析，初步判斷DsMV沒(méi)有明顯的寄主?；院偷乩砦恢孟嚓P(guān)性。

該研究結(jié)果為后續(xù)DsMV魔芋分離物的分子特征和病害流行學(xué)綜合研究奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)為魔芋抗病毒育種、建立更可靠的DsMV分子檢測(cè)技術(shù)、全基因組測(cè)定和致病機(jī)制的研究提供參考。