胡馨月，孫悅，張慧，呂萍，李晶，梁成罡

·論著·

利拉魯肽中長鏈脂肪酸——棕櫚酰谷氨酸殘留量的檢測方法研究

胡馨月，孫悅，張慧，呂萍，李晶，梁成罡

102629 北京，中國食品藥品檢定研究院激素室/國家衛(wèi)生健康委員會生物技術產(chǎn)品檢定方法及其標準化重點實驗室/國家藥品監(jiān)督管理局化學藥品質量研究與評價重點實驗室

建立超高效液相-高分辨質譜法測定利拉魯肽中的長鏈脂肪酸——棕櫚酰谷氨酸殘留量檢測方法，為長效脂肪酸修飾型胰島素和胰高糖素樣肽-1 類似物的脂肪酸殘留量檢測提供思路。色譜柱ACQUITY UPLC peptide BEH C4（2.1 mm × 150 mm，2.7 μm）；流動相 A 為甲酸/水（1:1000，/），流動相 B 為甲酸/乙腈（1:1000，/），梯度洗脫：0 ～10 min，35% ～ 95% B；10 ～ 10.5 min，95% ～ 35% B；10.5 ～ 15 min，35% B。流速 0.3 ml/min，柱溫 50 ℃，樣品盤溫度 25 ℃，檢測波長 214 nm，進樣體積 2 μl。利用超高效液相色譜質譜聯(lián)用技術（UPLC-MS），在正離子電噴霧離子化（ESI+）選擇性離子檢測（SIM）模式下（檢測離子分子式為 C21H39NO5，[M+H+] m/z 386.2901），測定利拉魯肽中棕櫚酰谷氨酸的殘留量。該方法專屬性強，棕櫚酰谷氨酸與利拉魯肽分離度良好，棕櫚酰谷氨酸在0.0125 ～ 2 μg/ml 的范圍內(nèi)峰面積與濃度有良好的線性關系（= 1.000），方法平均回收率為 98.2%（= 9），RSD% 為 3.7%。經(jīng)方法學驗證，本法能準確測定利拉魯肽中棕櫚酰谷氨酸殘留量，方法精密度、重復性、準確度和耐用性良好，并且為類似產(chǎn)品的脂肪酸殘留量檢測提供一定的借鑒和數(shù)據(jù)支持。

利拉魯肽； 液質聯(lián)用； 工藝相關雜質； 棕櫚酰谷氨酸； 高分辨質譜； 選擇性離子檢測

胰島素類和胰高糖素樣肽-1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）類藥物是糖尿病治療的主要藥物，兩者雖作用機制不同，但均可發(fā)揮良好的降糖作用，是控制 2 型糖尿病的有效藥物。天然的胰島素和 GLP-1 的半衰期很短[1-3]，患者給藥頻繁，依從性較差。隨著 DNA 重組技術的發(fā)展，可以通過改變其天然結構使藥物緩慢地吸收和分布，達到較長的半衰期，減少患者給藥次數(shù)。其中，經(jīng)基因工程表達和化學修飾，得到一類脂肪酸修飾型的胰島素類似物（如德谷胰島素和地特胰島素）和 GLP-1 的類似物（如利拉魯肽和司美格魯肽），這類產(chǎn)品是在序列中某個氨基酸側鏈上（如賴氨酸）增加脂肪酸基團，該結構的改變提高了藥物與白蛋白的結合能力，延長了在血漿中的存留時間，達到長效的目的。在生產(chǎn)過程中，長鏈脂肪酸（或帶有活性基團）為過量投料，雖經(jīng)過一系列的純化步驟，但是其仍有殘留。根據(jù)2020 版《中國藥典》四部通則、ICH Q3A 指導原則以及2020 版《中國藥典》三部人用重組 DNA 蛋白制品總論[4]的相關要求，需要對其殘留量進行檢測與控制，以確保產(chǎn)品的純度和質量。

利拉魯肽為脂肪酸修飾型的 GLP-1 類似物，氨基酸序列與天然 GLP-1 分子僅有一個氨基酸的差異，即 34 位賴氨酸被精氨酸取代，在 26 位賴氨酸上增加一個谷氨酸介導的 16 碳棕櫚酰脂肪酸側鏈[5-6]（圖 1），其半衰期延長至 13 h[7-8]。脂肪酸修飾工藝復雜，多數(shù)利拉魯肽生產(chǎn)工藝中，化學修飾部分實際投料為棕櫚酰谷氨酸活性酯，但多數(shù)活性酯成分極其不穩(wěn)定，最終可能以工藝相關雜質棕櫚酰谷氨酸的形式存在于終產(chǎn)品中。根據(jù)已上市同類產(chǎn)品的注冊標準，有部分企業(yè)將該項目納入到注冊標準中。棕櫚酰谷氨酸為長鏈脂肪族二羧酸，疏水性強，紫外吸收較弱，殘留量低，建立一套專屬性強、靈敏度高的檢測方法十分必要。本研究以利拉魯肽中的長鏈脂肪酸——棕櫚酰谷氨酸殘留量檢測為例，通過液質聯(lián)用技術的選擇性離子檢測（selected ion monitor，SIM）模式[9-10]，建立了專屬性好、準確度高、線性范圍寬、耐用性強的棕櫚酰谷氨酸殘留檢查方法，提高了利拉魯肽的質量控制水平，并且為其他類似產(chǎn)品的長鏈脂肪酸殘留提供借鑒。

圖 1 利拉魯肽和棕櫚酰谷氨酸的結構式

Figure 1 Structural formulas for liraglutide and N-palmitoyl-L-glutamic acid

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 Orbitrap Exploris 480 質譜儀和 Xcalibur 數(shù)據(jù)處理軟件為美國 ThermoFisher 公司產(chǎn)品。

1.1.2 材料 棕櫚酰谷氨酸對照品為中檢院激素室留樣，含量 96.0%；利拉魯肽供試品為中檢院激素室留樣，來源于企業(yè) A、B、C，共 7 批，分別標號 A1、A2、A3、B1、C1、C2、C3；LC-MS 級甲酸和乙腈為美國 Fisher Scientific 公司產(chǎn)品；氨水（純度> 99.0%）為美國 Sigma 公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 液質分析方法

1.2.1.1 液相色譜條件 色譜柱ACQUITY UPLC peptide BEH C4（2.1 mm × 150 mm，2.7 μm）；流動相 A 為甲酸/水（1:1000，/），流動相 B 為甲酸/乙腈（1:1000，/），梯度洗脫：0 ～ 10 min，35% ～ 95% B；10 ～ 10.5 min，95% ～ 35% B；10.5 ～ 15 min，35% B。流速 0.3 ml/min，柱溫 50 ℃，樣品盤溫度 25 ℃，檢測波長 214 nm，進樣體積 2 μl。

1.2.1.2 質譜條件 采用 ESI+電噴霧電離源，在正離子模式下進行質譜檢測分析。毛細管電壓 3.8 kV，源溫度 350 ℃，鞘氣 35 Arb，輔助氣10 Arb，離子傳輸管溫度 320 ℃，正離子噴霧電壓 3800 V，數(shù)據(jù)檢測模式為選擇性離子檢測（SIM），一級分辨率為 60000 @m/z 200，檢測離子分子式為C21H39NO5，[M+H+] m/z 386.2901，其余設置默認值。1.2.1.3 數(shù)據(jù)處理 Xcalibur 軟件進行數(shù)據(jù)采集和定量處理，設置提取產(chǎn)物離子 m/z 386.2890，設置偏差 5 ppm，高斯平滑數(shù)值 7，保留時間6.28 min。

1.2.2 溶液配制

1.2.2.1 稀釋溶劑氨水/水（1:1000，/）的制備 量取 1000 ml 超純水，加入 0.1 ml 氨水，混勻。

1.2.2.2 供試品與對照品的制備

⑴棕櫚酰谷氨酸對照品的制備

對照品貯備液 1：取 N-十六?；?L-谷氨酸對照品約 10 mg，置 50 ml 量瓶中，加溶劑適量，超聲約 2 min 溶解，用溶劑稀釋至刻度，搖勻，精密量取 1 ml，置 10 ml 量瓶中，用溶劑稀釋至刻度，搖勻，作為對照品貯備液。取對照品儲備液適量分別配制濃度為 2（0.5%）、1.2（0.3%）、0.8 μg/ml（0.2%）三個點，然后自 0.4 μg/ml（0.1%）點起由上一個濃度點進行 1 倍稀釋，分別配制0.2（0.05%）、0.1（0.025%）、0.05（0.0125%）、0.025（0.00625%）和 0.0125 μg/ml（0.003125%），共9 個點，每個濃度進樣 2 針。

⑵利拉魯肽供試品溶液的制備

取供試品約 10 mg，置 25 ml 量瓶中，加稀釋溶劑適量，振搖使溶解，用溶劑稀釋至刻度，搖勻。

⑶精密度和重復性樣品制備

取供試品 A2 溶液作為精密度考察溶液，重復進樣 6 針；人員 A 和人員 B 分別在不同日期平行配制 6 份供試品 A2 溶液，每份重復進樣 2 針。

⑷線性范圍樣品制備

按照1.2.2.2 ⑴項下配制對照品系列線性溶液：2（0.5%）、1.2（0.3%）、0.8（0.2%）、0.4（0.1%）、0.2（0.05%）、0.1（0.025%）、0.05（0.0125%）、0.025（0.00625%）和0.0125 μg/ml（0.003125%）。

⑸準確度樣品制備

稱取20 mg供試品C1 置于25 ml 容量瓶中，加稀釋溶劑適量，振搖使溶解，用溶劑稀釋至刻度，搖勻。與2.4、0.8 和0.2 μg/ml 的對照品溶液等體積混合，加標至棕櫚酰谷氨酸終濃度為1.2（0.3%）、0.4（0.1%）和0.1 μg/ml（0.025%）3 個濃度水平，每個濃度水平平行配制3 份，另單獨取供試品C1 約10 mg，置25 ml 量瓶中，加稀釋溶劑適量，振搖使溶解，用溶劑稀釋至刻度，搖勻，配制1 份。

1.2.3 計算方法

標準曲線法：y = ax + b

x：棕櫚酰谷氨酸實測濃度（μg/ml）；y：峰面積；b：標準曲線截距；a：標準曲線斜率。

含量（%）公式如下：含量（%）=[棕櫚酰谷氨酸實測濃度（μg/ml）/利拉魯肽濃度（μg/ml）] × 100%

2 結果

2.1 色譜柱與梯度選擇

棕櫚酰谷氨酸為 16 個碳的脂肪酸，具有較強的疏水性。本研究選擇保留性能相對弱的 C4 色譜柱，經(jīng)方法優(yōu)化，0 ～ 10 min 中，B 相 35% ～ 95% 中利拉魯肽和棕櫚酰谷氨酸依次洗脫。對比紫外色譜圖（214 nm）和 SIM 圖（m/z 386.2890），利拉魯肽保留時間約為 4.09 min（圖 2A），棕櫚酰谷氨酸的保留時間約為 6.28 min（圖 2B），結果表明，利拉魯肽與棕櫚酰谷氨酸分離度良好。

2.2 質譜 SIM 模式選擇和定量方法

采用數(shù)據(jù)依賴采集（MS）模式，一級分辨率為 60000 @m/z 200，對供試品A2 溶液進行一級質譜采集，棕櫚酰谷氨酸理論質譜圖和實測質譜圖如圖 3 所示，實測分子離子峰 m/z 386.2890，主要同位素峰相對豐度比與理論圖譜一致。選擇 SIM 模式下采集，檢測離子分子式為 C21H39NO5，m/z 386.2901（+H），一級分辨率 60000，提取離子 m/z 386.2890，可以得到單峰，無干擾，且信號強度為e7，強度較高，可滿足定量分析要求。選擇標準曲線法定量，系統(tǒng)適用性規(guī)定相關系數(shù)應≥ 0.990。

2.3 方法學驗證

2.3.1 專屬性 分別將氨水/水（1:1000，/）、對照品溶液、供試品溶液、加標溶液依次進樣。氨水/水對測定無干擾，且利拉魯肽與棕櫚酰谷氨酸峰分離度良好。結果表明，方法專屬性良好。

2.3.2 精密度測定 供試品 A2 重復進樣 6 針，含量（%）平均值為 0.12%，RSD% 為0.31%，人員 A 平行配制供試品 A2 共 6 份，含量（%）平均值為 0.12%，RSD% 為 2.2%；人員 B 平行配制供試品 A2 共 6 份，含量（%）平均值為 0.11%，RSD% 為 4.6%；人員 A 與人員 B 測定的平均含量為 0.12%，RSD% 為 4.5%。以上結果表明，方法精密度良好。

2.3.3 線性和準確度測定

2.3.3.1 線性與范圍 分別取濃度約為 2、1.2、0.8、0.4、0.2、0.1、0.05、0.025 和 0.0125 μg/ml 的對照品系列線性溶液進樣，每個濃度進樣 2 針，以測得的棕櫚酰谷氨酸峰面積平均響應值為縱坐標，以棕櫚酰谷氨酸濃度作為橫坐標繪制線性回歸曲線，線性方程為y = 219 959 080.85x + 2 493 292.39，2= 1.00，= 1.000（圖 4）。樣品在 0.0125 ～2 μg/ml 范圍內(nèi)峰面積與濃度線性良好。線性范圍濃度最低點0.0124 ng/ml 為該方法定量下限（lower limit of quantitation，LLOQ）。

2.3.3.2 準確度 按照1.2.2.2 ⑸項下方法，加標至棕櫚酰谷氨酸為 1.2（0.3%）、0.4（0.1%）、0.1 μg/ml（0.025%），每個濃度平行配制 3 份，供試品 C1 配制 1 份。如表 1 所示，代入標準曲線計算，供試品溶液 C1 未檢出棕櫚酰谷氨酸，測得棕櫚酰谷氨酸的平均加樣回收率為 98.2%，RSD% 為 3.7%（= 9）。

2.3.4 耐用性 改變流速至 0.4 ml/min，線性回歸方程為 y = 184 372 213.45x + 3 270 487.20，2= 1.00，= 1.000，供試品 A2 測定值為0.11%，改變正離子噴霧電壓至 3900 V，線性回歸方程為y =213 186 726.58x + 3 017 086.87，2= 1.00，= 1.000，供試品 A2 測定值為 0.11%。結果表明，方法耐用性良好。

2.3.5 溶液穩(wěn)定性 樣品放置在 25 ℃下，分別于 0、3、6、9、12、18 和 24 h 對供試品 A2 進行測定，標準曲線法計算，含量（%）均為 0.12%，峰面積 RSD% 為 1.0%，方法穩(wěn)定性良好（表 2）。

2.4 樣品測定

按照1.2.2.2 ⑵項下供試品配制方法，對三家企業(yè)的 7 批利拉魯肽原料進行棕櫚酰谷氨酸含量（%）測定，結果見表3。

圖 2 供試品的紫外色譜圖（A）和 SIM 色譜圖（B）

Figure 2 UV chromatograms (A) and SIM chromatograms (B) of the samples

圖 3 棕櫚酰谷氨酸理論質譜圖（A）和實測一級質譜圖（B）

Figure 3 Theoretical mass spectrometry (A) and measured first-order mass spectrometry (B) of N-palmitoyl-L-glutamic acid

3 討論

藥物中雜質的常規(guī)檢測方法包括化學法、光譜法、色譜法等。這些方法的靈敏度只需要滿足雜質的最低報告限度（單日最大劑量≤ 2 g，0.05%；單日最大劑量> 2 g，0.03%）即可[11]。但在藥物中的殘留量可能遠低于報告限度，常規(guī)雜質分析方法檢測靈敏度低、耗時長，難以滿足其檢測需求。隨著質譜技術的發(fā)展，色譜技術（如液相色譜、氣相色譜等）聯(lián)用質譜檢測器具有高靈敏度和高分辨率[12]。本研究即采用液質聯(lián)用的定量方法，選擇 SIM 的相對定量技術，選取一級分子離子 m/z，標準曲線法定量，系統(tǒng)適用性規(guī)定相關系數(shù)≥ 0.990。本方法具有較高的靈敏度，棕櫚酰谷氨酸在 0.0125 ～ 2 μg/ml 范圍內(nèi)峰面積與濃度線性良好。由于生產(chǎn)過程中棕櫚酰谷氨酸（酯）投料比和純化工藝不同，不同企業(yè)的棕櫚酰谷氨酸殘留量也各不相同。采用本研究建立的方法對三家企業(yè)不同批號的棕櫚酰谷氨酸殘留量進行測定，發(fā)現(xiàn)不同企業(yè)的棕櫚酰谷氨酸殘留有明顯的差異。部分批次原料有超出確證閾值（單日最大劑量≤2 g，0.15%；單日最大劑量> 2 g，0.05%）的風險，超出確證閾值的雜質均應基于其生物安全性評估數(shù)據(jù)，確定控制限度。為保證提高利拉魯肽的純度、質量和有效性，企業(yè)可根據(jù)自身純化工藝、分析成本等方面考量，需考慮將棕櫚酰谷氨酸殘留降至較低水平。

圖 4 對照品系列線性溶液與峰面積擬合曲線

Figure 4 Curve fitting between linear solution and peak area of reference substance series

表 1 三個濃度水平的加標回收率（n = 9）

表 2 穩(wěn)定性測定

表 3 三家企業(yè)棕櫚酰谷氨酸含量結果（%）

注：“/”未檢出。

Note: “/” not detected.

本研究方法同時也為類似產(chǎn)品的脂肪酸側鏈的殘留量檢測提供了一定的思路，脂肪酸側鏈一般具有疏水性較強、紫外吸收較弱等共性特征，這對方法靈敏度提出了一定挑戰(zhàn)。選擇液質聯(lián)用的定量方法，若在一級 SIM 模式下，專屬性及靈敏度均良好，可直接采用該模式定量，本研究工作提供的數(shù)據(jù)和方法可作為參考。另外，也可以選擇多反應監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）模式，選擇定量離子對進行相對定量。

綜上所述，本研究建立的液質聯(lián)用法測定棕櫚酰谷氨酸殘留量，精密度、準確度和專屬性較高，可作為利拉魯肽生產(chǎn)過程中棕櫚酰谷氨酸殘留量的質控方法，用于過程控制及終產(chǎn)品放行控制。隨著深入的研究，該方法具有更廣泛的適用性，可以為類似產(chǎn)品的脂肪酸殘留量檢測提供借鑒和數(shù)據(jù)支持。

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Establishment of a method for determination of N-palmitoyl-L-glutamic acid residue in liraglutide

HU Xin-yue, SUN Yue, ZHANG Hui, LYU Ping, LI Jing, LIANG Cheng-gang

Author Affiliation: Division of Hormone, National Institutes for Food and Drug Control, NHC Key Laboratory of Research on Quality and Standardization of Biotech Products, NMPA Key Laboratory for Quality Research and Evaluation of Chemical Drugs, Beijing 102629, China

To establish a method for the determination of long chain fatty acid N-palmitoyl-L-glutamic acid residue in liraglutide by UPLC-MS. The results provide ideas for the residues of fatty acid in long-acting fatty acid modified insulin and GLP-1 analogues.ACQUITY UPLC peptide BEH C4 (2.1 mm × 150 mm, 2.7 μm), mobile phase A was formic acid/water (1:1000,/), mobile phase B was formic acid/acetonitrile (1:1000,/). Gradient elution: 0 - 10 min, 35% - 95% B; 10 - 10.5 min, 95% - 35% B; 10.5 - 15 min, 35% B. The flow rate was 0.3 ml/min, the column temperature was 50 ℃, the sample tray temperature was 25 ℃, the detection wavelength was 214 nm, and the injection volume was 2 μl. The UPLC-HRMS was used to establish the identification of N-palmitoyl-L-glutamic residue. Selected ion monitorwas carried out by ESI+scanning and quantification ion m/z 386.2901 (C21H39NO5, [M+H+] 386.2901).This method was highly exclusive. The separation of N-palmitoyl-L-glutamic acid and liraglutide was good. The linearity between peak area and concentration of N-palmitoyl-L-glutamic acid was achieved in the range of 0.0125- 2 μg/ml (= 1.000). The average recoveries of N-palmitoyl-L-glutamic acid was 98.2% (= 9, RSD% = 3.7%).This method is suitable for the determination of N-palmitoyl-L-glutamic acid residue of liraglutide with better accuracy, repeatability, precision and durability, and provides reference and data support for the detection of fatty acid residues in similar products.

liraglutide; liquid mass combination; process-related impurities; N-palmitoyl-L-glutamic acid; high resolution mass spectrometry; selected ion monitor

LIANG Cheng-gang, Email: liangchenggang@nifdc.org.cn; LI Jing, Email: li_jing@nifdc.org.cn

10.3969/j.issn.1673-713X.2022.05.003

中國食品藥品檢定研究院中青年發(fā)展研究基金（2022A3）

梁成罡，Email：liangchenggang@nifdc.org.cn；李晶，Email：li_jing@nifdc.org.cn

2022-06-07