●張馨文 劉麗萍 ※※

（1.黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心 黑龍江 哈爾濱 150500；2.黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院黑龍江省普通高校分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 黑龍江 哈爾濱 150080）

1 蒲公英概述

蒲公英（Taraxacum mongolicumHand.-Mazz）是我國(guó)重要的觀賞植物和食藥用材料，蒲公英為菊科多年生草本植物，頭狀花序，種子為由白色冠毛組成的細(xì)絨毛，成熟后會(huì)隨風(fēng)飄到各處進(jìn)而開(kāi)花、生根。人們也習(xí)慣于把蒲公英屬草本植物統(tǒng)稱為蒲公英。蒲公英的生命力很強(qiáng)，多生于坡地、草叢、路邊、岸邊沙地上和田野間，為常見(jiàn)的野生植物。蒲公英的適應(yīng)性范圍很廣，即抗寒又耐熱、抗酸堿等，能在各種類型的土壤中正常生長(zhǎng)發(fā)育。

2 蒲公英的食用價(jià)值

蒲公英的植株中富含蒲公英醇、蒲公英素、膽堿、有機(jī)酸、菊糖、黃酮素等各種營(yíng)養(yǎng)元素，而蒲公英根富含蛋白質(zhì)、油脂、氨基酸、維生素等物質(zhì)。蒲公英可以生食、炒食或作湯，是藥食并用的植物。還可以以蒲公英提取物和水果等為原料制成酸奶、冰糖梨汁、果酒等風(fēng)味飲品，既能消暑解渴，又可以預(yù)防疾病。

3 蒲公英的藥用價(jià)值

蒲公英的藥用價(jià)值及經(jīng)濟(jì)價(jià)值都較高，其根莖、葉均有保健作用。在臨床上，蒲公英根一般用來(lái)治咽疼痛、疔瘡腫毒、濕熱黃疸和熱淋澀疼等病癥。將蒲公英根部掐斷后會(huì)流出類似于白色奶汁狀的乳汁，因此蒲公英別名奶汁草，蒲公英的乳汁管分泌的汁液含有豐富的蛋白質(zhì)及礦物質(zhì)，具有清熱去火、消炎解毒、降低膽固醇、通便等功效，具有很好的應(yīng)用前景和研究?jī)r(jià)值。同時(shí)，蒲公英對(duì)消化不良、膽管疾病、脾臟和肝臟疾病以及炎癥性疾病也有治療作用。此外，蒲公英中的黃酮類化合物能夠抑制人乳腺惡性腫瘤的增殖。適量地添加蒲公英提取物能促進(jìn)魚(yú)類的白細(xì)胞增加[1-3]。

4 石蠟切片的概述

石蠟切片是目前組織學(xué)常規(guī)制片技術(shù)中較為廣泛的方法，該方法可以直接觀測(cè)到正常細(xì)胞組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)。本試驗(yàn)制作并觀察蒲公英根部的橫切面和縱切面，查閱相關(guān)石蠟切片的研究，未見(jiàn)蒲公英石蠟切片的乳汁管結(jié)構(gòu)方面的研究。

5 蒲公英石蠟切片的制作

5.1 試驗(yàn)材料與試劑

5.1.1 試驗(yàn)材料蒲公英根尖，試劑主要有石蠟、乙醇、二甲苯、番紅/固綠染色液、明膠、甲醛、甘油、苯酚。

5.1.2 器具主要有石蠟切片機(jī)、組織脫水機(jī)、展片臺(tái)、恒溫箱、染色缸、載玻片、蓋玻片、燒杯、量筒等。

5.2 取材

試驗(yàn)所用蒲公英于哈爾濱市南崗區(qū)學(xué)府路和學(xué)府三道街取材，取材時(shí)動(dòng)作應(yīng)快、輕且用力均勻，可借助解剖鏡切取所需試驗(yàn)材料。

5.3 固定

對(duì)切好的蒲公英根組織加以固定，固定應(yīng)及時(shí)，根組織離體后，越快固定越好。固定液的選擇應(yīng)遵循貫穿力強(qiáng)，使細(xì)胞迅速死亡，將原生質(zhì)全部凝固且不引起任何變形的原則，與此同時(shí)提高折光率，而且不妨礙正常組織結(jié)構(gòu)。固定液的用量為物料容積的20～50倍，不然物料中的水會(huì)稀釋固定液的含量，減低固化效率[4-6]。本試驗(yàn)使用FAA固定液，F(xiàn)AA固定液是一種常見(jiàn)的固定液，其兼有保存劑的功能。將蒲公英的根橫切面與根縱切面在FAA固化液中固定24 h后充分水洗，去掉留在組織內(nèi)的固化液以及結(jié)晶沉淀，避免影響后期的染色效果。

5.4 脫水與透明

水與透明劑之間不可互溶，只有脫去水分后，透明劑方可進(jìn)入組織切片。在脫水處理時(shí)，要注意確定脫水反應(yīng)梯度和每一個(gè)脫水反應(yīng)的時(shí)間，一定要完全脫水，但同時(shí)又不可過(guò)量，因脫水時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)使組織變脆、萎縮。脫水反應(yīng)的具體操作步驟：采用50%、70%、85%、95%、100%的各級(jí)乙醇溶液系列脫水反應(yīng)各40～60 min，可保證脫水透徹，還可以用自動(dòng)組織脫水機(jī)進(jìn)行快速脫水[7]。

二甲苯也是最常見(jiàn)的透明劑，能夠很好地與石蠟互溶，同時(shí)它還具有作用速度快、澄清能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，將脫水后的蒲公英的根橫切面與根縱切面先在純酒精和二甲苯的等比容積的混合物中停留約1 h，而后進(jìn)入純二甲苯中停留約1 h后，再更換純二甲苯2次。

5.5 浸蠟與包埋

浸蠟時(shí)以石蠟代替透明劑，使石蠟滲透到植物組織中而起支持作用。浸蠟一般在恒溫箱中進(jìn)行，恒溫箱溫度約為60℃，將已經(jīng)透明的蒲公英根橫切面與根部縱切面用鑷子分別取出，放入蠟杯內(nèi)，然后再將碎石蠟（熔點(diǎn)48～50℃）放至蠟杯約2/3處，加蓋后置于60℃溫箱中，并放置約24 h后進(jìn)行溶蠟。24 h后揭去蠟杯的蓋子，將溫箱溫度調(diào)至56℃并保存約5 d，使其透明劑完全揮發(fā)。超前備好包埋法所用紙箱，將經(jīng)過(guò)浸蠟的蒲公英根連同溶好的石蠟一同注入紙箱，之后立即注入冷水[8]，使之迅速凝結(jié)成蠟塊。使用半自動(dòng)包埋機(jī)可以大大節(jié)省包埋時(shí)間，提高工作效率。待石蠟全部凝結(jié)（約30 min）后，即可取出使用。

5.6 切片并粘片

切割時(shí)的蠟塊要均勻、平整，因?yàn)榄h(huán)境溫度太高，切割時(shí)易于黏著在刀片上，可通過(guò)冰塊降溫來(lái)降低切割機(jī)的溫度[9]。把蠟塊在切割機(jī)上定位后，調(diào)節(jié)切距至合適程度，然后旋轉(zhuǎn)調(diào)節(jié)器，切割厚度控制在5～10 μm，完成切割。切好后就立即開(kāi)始粘片，用粘片劑將蠟片牢附在載玻片上。具體做法：在載玻片上先涂粘片劑，再滴蒸餾水，最后放上蠟片，用濾紙片吸收多余的水后把載玻片放置在40～60℃的展片臺(tái)上，烤干[10]。本試驗(yàn)所使用的粘片劑為蛋清與甘油1∶1混合制成。

5.7 脫蠟、復(fù)水與染色

晾干后的材質(zhì)切片必須經(jīng)脫蠟和復(fù)水才能在水溶性染液中完成染色。脫蠟、復(fù)水和染色的總體步驟：二甲苯→二甲苯∶酒精（1∶1）→100%乙醇→95%乙醇→85%乙醇→番紅（4 h以上）→95%乙醇→固綠（迅速）→95%乙醇（迅速）→100%乙醇→二甲苯∶酒精（1∶1）→二甲苯[11]。

上述過(guò)程每一步需要5～10 min，已標(biāo)注具體時(shí)間的除外。染色劑一般為1%番紅（95%乙醇配制）和0.1%固綠（95%乙醇配制），在其中的1%番紅染色液中10 min，用自來(lái)水沖洗除去浮色，用蒸餾水清洗，50%乙醇5 min，70%乙醇脫水5 min，0.5%固綠復(fù)染不超過(guò)25 s，二甲苯透明5 min。

5.8 封片

在二甲苯中拿出透明好的蒲公英根的橫切面和根縱切面切片后，在載玻片中滴入少許的（1～2滴）加拿大樹(shù)膠，讓它逐漸地往外溢，用鑷子把潔凈蓋玻片傾倒下放，等整張蓋玻片的內(nèi)表面部接觸到樹(shù)膠后，再用鑷子輕蓋壓玻片，以趕出切片中的氣泡，要使樹(shù)膠層盡量薄而平整，在封片時(shí)也要小心切勿形成氣泡。將封好的切片置于60℃溫箱中，干燥一夜后進(jìn)行鏡檢并將合格的切片貼上標(biāo)簽，然后永久保存。

6 結(jié)果與分析

將制好的蒲公英根橫切面和縱切面于顯微鏡下觀察，觀察發(fā)現(xiàn)蒲公英根橫切面如圖1所示，橫切：木質(zhì)部小，射線明顯，乳汁管豐富，導(dǎo)管較大，為排列著的棕色細(xì)胞，根的橫切面清晰可見(jiàn)外圈磚紅色為乳汁管的橫截面，這也在一定程度上證明了蒲公英具有發(fā)達(dá)的乳汁管結(jié)構(gòu)；對(duì)蒲公英的根縱切面顯微觀察，如圖2所示，這是一個(gè)具有代表意義的典型乳汁管的石蠟切片，乳汁管呈簡(jiǎn)單的管狀排列，有螺紋，其內(nèi)部含有乳汁。植物乳汁管主要由一條或多條細(xì)長(zhǎng)分支的乳汁細(xì)胞所組成，試驗(yàn)通過(guò)對(duì)蒲公英的根縱切面的制作獲得了蒲公英乳汁管的切片，觀察到了蒲公英分泌乳汁的證據(jù)，蒲公英乳汁管分泌乳汁的功能與作用有待進(jìn)一步深入研究。

圖2 蒲公英的根縱切面——乳汁管