張欣 李俊平 王瑞元

1 南京體育學(xué)院運(yùn)動健康科學(xué)系（南京210014）

2 北京體育大學(xué)運(yùn)動人體科學(xué)學(xué)院（北京100084）

運(yùn)動性骨骼肌損傷是運(yùn)動過程中常見的傷害之一。大負(fù)荷運(yùn)動尤其是離心運(yùn)動后，骨骼肌纖維結(jié)構(gòu)和代謝功能發(fā)生損傷性改變，并伴有肌肉僵硬和肌力下降，最終影響人體的運(yùn)動能力[1，2]。有研究發(fā)現(xiàn)，針刺在骨骼肌損傷的治療過程中療效顯著[3-5]，但機(jī)理尚未清晰。自噬在骨骼肌損傷細(xì)胞中發(fā)揮重要作用，合理的自噬水平對保持肌肉質(zhì)量和維持肌纖維的完整性具有重要意義[6]，Omi/HtrA2 可通過下游HS1 相關(guān)蛋白X-1（HS1-associated protein X-1，Hax-1）-Beclin1 途徑參與自噬[7]，針刺是否可以通過Omi/HtrA2 影響自噬進(jìn)而促進(jìn)骨骼肌修復(fù)有待探討。本研究采用大負(fù)荷離心運(yùn)動誘導(dǎo)大鼠骨骼肌損傷模型，給予大鼠大負(fù)荷離心運(yùn)動和針刺兩種干預(yù)方式，使用透射電子顯微鏡觀察運(yùn)動后骨骼肌細(xì)胞的自噬情況，同時(shí)使用Western Blot 觀察大鼠骨骼肌Omi/HtrA2、Hax-1 與Beclin1 蛋白表達(dá)變化，探究針刺在骨骼肌細(xì)胞自噬中的作用，進(jìn)而從細(xì)胞自噬的角度探究針刺改善運(yùn)動性骨骼肌損傷的機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

健康雄性8周齡Sprague-Dawley（SD）大鼠128只，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，體重221.77 ± 7.32 g。飼養(yǎng)條件為12 h 光照/12 h 黑暗晝夜光交替，室內(nèi)溫度20℃～26℃，相對濕度40%～70%，自由飲水飲食（北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供）。于北京體育大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物房訓(xùn)練，大鼠適應(yīng)性訓(xùn)練前在屏障式動物房正常生長適應(yīng)環(huán)境3天。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物分組與干預(yù)方案

將128 只實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為四組：對照組（Control，C 組）（n=8）、針刺組（Acupuncture，A 組）（n=40）、運(yùn)動組（Exercise，E組）（n=40）、運(yùn)動針刺組（EA組，運(yùn)動后即刻沿大鼠小腿比目魚肌縱向針灸針斜刺）（n=40）。每組根據(jù)干預(yù)后不同時(shí)間點(diǎn)又分為即刻、12 h、24 h、48 h和72 h組。具體分組情況見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)動物分組

運(yùn)動方案：采用運(yùn)動生理學(xué)骨骼肌實(shí)驗(yàn)室經(jīng)典離心運(yùn)動損傷模型（參照Armstrong 的離心運(yùn)動模型）[8]。使用動物跑臺進(jìn)行運(yùn)動干預(yù)，所有參與運(yùn)動的大鼠在適應(yīng)性喂養(yǎng)3天后進(jìn)行3天的適應(yīng)性跑臺訓(xùn)練：第1天跑臺坡度0°，16 m/min，5 min；第2 天跑臺坡度0°，16 m/min，10 min；第3 天休息。第4 天正式實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)干預(yù)方式為一次持續(xù)性下坡跑，跑臺坡度為-16°，速度為16 m/min，運(yùn)動時(shí)間為90 min。

針刺方案：用直徑0.25 mm 的針灸針沿大鼠小腿比目魚肌的縱向，從遠(yuǎn)端，進(jìn)針角度約30°斜刺，穿過小腿比目魚肌肌腹，針刺大鼠雙腿比目魚肌，留針2 min。

1.3 實(shí)驗(yàn)標(biāo)本取樣

實(shí)驗(yàn)大鼠分別在安靜和針刺或運(yùn)動干預(yù)后即刻、12 h、24 h、48 h 和72 h 時(shí)分批處死并取材。所有大鼠取材前先稱體重，按體重注射10%的水合氯醛于大鼠腹腔內(nèi)；麻醉成功后開腹，腹腔靜脈抽血處死。分離并剪取比目魚肌，將得到的比目魚肌置于冰浴中的錫紙上，小心去除兩側(cè)肌腱和結(jié)締組織。取材過程中，盡量避免肌肉牽拉。把處理后的比目魚肌肌腹切成2段，其中一段大小為l mm×1 mm×3 mm，立即投入4℃預(yù)冷的Pon-812環(huán)氧樹脂包埋，4℃保存，為透射電子顯微鏡觀察做準(zhǔn)備；另一段用錫紙包裹并小心裝入凍存管，投入液氮速凍，之后放于-80℃冰箱保存，以備Western Blot蛋白測定。

1.4 測試指標(biāo)及方法

1.4.1 透射電子顯微鏡觀察骨骼肌自噬體的變化

（1）戊二醛固定：將包埋好的比目魚肌切成小塊，放入2.5%的戊二醛固定液，4℃保存2 h；（2）鋨酸固定：0.2 mol/L 的PBS 漂洗3 次，放入1%的鋨酸固定液，4℃固定2 h；（3）酒精脫水：繼續(xù)用0.2 mol/L 的PBS 液漂洗3 次，每次10 min，徹底洗干凈組織上的固定液，然后將組織依次放入50%、70%、90%的乙醇10 min，繼續(xù)放入100%乙醇2 次，每次15 min；（4）置換：在室溫條件下，將組織放入環(huán)氧丙烷兩次，每次15 min，繼續(xù)依次放入環(huán)氧丙烷和樹脂1∶1 的混合液中浸透1 h，環(huán)氧丙烷與樹脂1∶4 的混合液中浸透1 h，純樹脂浸透2 h；（5）純樹脂包埋：注入包埋劑，烤箱聚合固定；（6）修塊：確定切配方向，解剖鏡下修整包埋樣本塊；（7）制備切片：將樣本切成0.5～1 μm的半薄切片后染色、定位，繼續(xù)用超薄切片機(jī)切成50～70 nm的超薄切片，醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛雙重電子染色15～30 min；（8）JEM-1400透射電鏡觀察。

1.4.2 Western Blot方法測定相關(guān)蛋白含量

（1）骨骼肌組織蛋白提?。悍Q取比目魚肌組織，1 mg∶10 μl比例加入裂解液，低溫條件下剪碎、研磨、勻漿，以14000 rpm 離心10 min，取上清液4℃暫存，BCA蛋白定量試劑盒測定并調(diào)整樣品蛋白濃度，確保統(tǒng)一上樣量，4∶1 比例加入5×樣品緩沖液，煮沸10 min；（2）SDS- PAGE 凝膠電泳按配方配膠；（3）上樣:加樣15 μl/孔，濃度4 μg/μl；（4）電泳: 濃縮膠電壓80 V，分離膠電壓120 V；（5）轉(zhuǎn)膜：恒流300 mA，轉(zhuǎn)膜90 min；（6）封閉：5% BSA室溫封閉2 h；（7）一抗孵育：用封閉液稀釋一抗（GAPDH：1∶2000，Omi/HtrA2：1∶500，Hax-1：1∶1000，Beclin1：1∶1000），將膜置于其中室溫孵育1 h ，然后置于4℃過夜；（8）洗膜：TBST 洗膜3次，每次10 min；（9）二抗孵育：用封閉液稀釋二抗（羊抗兔IgG 1∶10000，羊抗小鼠IgG：1∶10000），室溫孵育1 h；（10）洗膜：TBST 洗膜3 次，每次10 min；（11）凝膠成像：膜上滴加發(fā)光液，于BIO-RAD 的凝膠成像系統(tǒng)Chemi DocTMXRS曝光成像，用Image J軟件分析圖片，記錄各組蛋白條帶灰度值，并將其與GAPDH條帶灰度值的比值均值進(jìn)行組間比較。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0 分析數(shù)據(jù)，所得數(shù)據(jù)均采用平均值± 標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。對處理方式（運(yùn)動、針刺）和時(shí)相因素（0 h、12 h、24 h、48 h、72 h）采用雙因素方差分析（Two-way ANOVA）檢驗(yàn)。若處理方式的主效應(yīng)顯著，則進(jìn)一步執(zhí)行對照組、針刺組、運(yùn)動組、運(yùn)動針刺組等組間的事后多重檢驗(yàn)。各因素內(nèi)的各個(gè)亞組比較采用單因素方差分析。Omi/HtrA2、Hax-1和Beclin1兩兩蛋白之間用Pearson 相關(guān)性分析法。顯著性水平設(shè)為P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 骨骼肌細(xì)胞自噬體電鏡觀察

如圖1 所示，A 組針刺干預(yù)后即刻和12 h，骨骼肌細(xì)胞形態(tài)未見明顯改變，視野所見肌原纖維排列整齊，線粒體均勻分布，Z線M線清晰，線粒體基膜下密集排布，未見明顯的自噬體出現(xiàn)。針刺干預(yù)后24 h，線粒體形態(tài)稍有腫脹，電鏡下嵴結(jié)構(gòu)突出，視野中均未出現(xiàn)自噬體異常形成和分布，針刺干預(yù)后48 h 和72 h，視野范圍內(nèi)均未見明顯異常。

圖1 高倍電鏡圖顯示針刺后大鼠骨骼肌肌原纖維結(jié)構(gòu)和細(xì)胞器

如圖2 所示，E 組運(yùn)動后即刻，大鼠骨骼肌肌原纖維出現(xiàn)明顯的牽拉性損傷，牽拉部位肌小節(jié)破壞嚴(yán)重，線粒體結(jié)構(gòu)出現(xiàn)異常，腫大并向肌膜下聚集，自噬體不明顯。運(yùn)動后12 h，大鼠骨骼肌肌原纖維損傷程度并未發(fā)生明顯改善，肌漿網(wǎng)腫脹管腔變大，出現(xiàn)明顯空泡化，三聯(lián)體有移位現(xiàn)象。肌原纖維間和肌膜下方均能找到內(nèi)含線粒體、核糖體等細(xì)胞器的自噬體，且數(shù)量相對較多。運(yùn)動后24 h，大鼠骨骼肌肌原纖維損傷部位肌小節(jié)逐漸恢復(fù)，線粒體向Z線處聚集，肌膜下或肌原纖維間自噬小泡多以自噬溶酶體的形式出現(xiàn)。運(yùn)動后48 h 和72 h，肌小節(jié)排列規(guī)整，Z 線清晰，線粒體規(guī)則排列在Z先兩側(cè)，視野范圍內(nèi)未見明顯自噬現(xiàn)象。

圖2 高倍電鏡圖顯示運(yùn)動后大鼠骨骼肌肌原纖維結(jié)構(gòu)和細(xì)胞器

如圖3所示，EA組干預(yù)后即刻，大鼠骨骼肌肌原纖維出現(xiàn)明顯的牽拉性損傷，牽拉部位肌小節(jié)破壞嚴(yán)重，線粒體結(jié)構(gòu)出現(xiàn)異常，腫大并向肌膜下聚集，自噬體不明顯。干預(yù)后12 h，大鼠骨骼肌肌原纖維損傷程度并未發(fā)生明顯改善，肌原纖維間和肌膜下方均未能找到內(nèi)含線粒體、核糖體等細(xì)胞器的自噬體。干預(yù)后24 h，大鼠骨骼肌肌原纖維損傷部位肌小節(jié)未見完全恢復(fù)，肌膜下或肌原纖維間未有自噬體出現(xiàn)。干預(yù)后48 h直至72 h，電鏡視野下依然觀察不到自噬體存在，肌原纖維及其周邊的細(xì)胞器均與對照組比較無明顯差異。

圖3 高倍電鏡圖顯示運(yùn)動和針刺干預(yù)后大鼠骨骼肌肌原纖維結(jié)構(gòu)和細(xì)胞器

2.2 不同干預(yù)后Omi/HtrA2、Hax-1 和Beclin1 蛋白表達(dá)變化

以對照組為基礎(chǔ)值，本實(shí)驗(yàn)測得大鼠在不同干預(yù)后Omi/HtrA2、Hax-1和Beclin1的變化如圖4、表2-4所示。

表2 不同干預(yù)后Omi/HtrA2蛋白表達(dá)量（%C組）

圖4 不同干預(yù)后Omi/HtrA2、Hax-1和Beclin1的相對蛋白表達(dá)量變化

通過雙因素方差分析對處理因素（運(yùn)動、針刺）進(jìn)行主效應(yīng)檢驗(yàn)，結(jié)果顯示A 組無顯著影響（P＞0.01）。以對照組為基礎(chǔ)值，A組各時(shí)間點(diǎn)Omi/HtrA2、Hax-1和Beclin1 蛋白含量均未發(fā)生明顯變化，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

以對照組為基礎(chǔ)值，E 組一次大負(fù)荷離心運(yùn)動后Omi/HtrA2蛋白表達(dá)迅速升高（P＜0.01），在12小時(shí)達(dá)到峰值，隨后在運(yùn)動后24小時(shí)、48小時(shí)逐漸下降，運(yùn)動后72 小時(shí)下降至與對照組無顯著性差異。與Omi/HtrA2蛋白含量變化相反，一次大負(fù)荷離心運(yùn)動后即刻，Hax-1 蛋白含量不升反降，在運(yùn)動后12 小時(shí)降至最低（P＜0.01），運(yùn)動后24 小時(shí)、48 小時(shí)數(shù)值均低于基礎(chǔ)值（P＜0.05），直至運(yùn)動后72 小時(shí)恢復(fù)至基礎(chǔ)水平（P＞0.05）。運(yùn)動后即刻，自噬蛋白Beclin1表達(dá)顯著升高（P＜0.05），在運(yùn)動后12 小時(shí)和24 小時(shí)達(dá)到峰值（P＜0.01，兩時(shí)間點(diǎn)間沒有顯著性差異），運(yùn)動后72 小時(shí)逐漸恢復(fù)至與基礎(chǔ)值無顯著性差異。E 組Omi/HtrA2 和Hax-1 蛋白變化趨勢的相關(guān)性分析結(jié)果為兩者呈負(fù)相關(guān)性（r=-0.928，P＜0.05）；Hax-1和Beclin1蛋白變化趨勢相關(guān)性分析結(jié)果為兩者呈負(fù)相關(guān)性（r=-0.975，P＜0.01）。

以對照組為基礎(chǔ)值，EA 組干預(yù)后即刻，Omi/HtrA2迅速升高，12 小時(shí)、24 小時(shí)和48 小時(shí)均與對照組相比有顯著性差異，其中12 小時(shí)時(shí)間點(diǎn)出現(xiàn)最高值（P＜0.01）；與Omi/HtrA2 蛋白含量變化相反，Hax-1 蛋白含量不升反降（P＜0.05），在干預(yù)后12小時(shí)達(dá)到最低值，干預(yù)后24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)數(shù)值均低于基礎(chǔ)值（P＜0.05）；骨骼肌自噬蛋白Beclin1 表達(dá)在運(yùn)動針刺后即刻、12小時(shí)、24小時(shí)和48小時(shí)顯著升高（P＜0.05），在干預(yù)后12小時(shí)達(dá)到最高值（P＜0.01），干預(yù)后72小時(shí)逐漸恢復(fù)至與基礎(chǔ)值無顯著性差異。

值得注意的是，通過雙因素方差分析對處理因素（運(yùn)動、針刺）進(jìn)行主效應(yīng)檢驗(yàn)，骨骼肌自噬蛋白Omi/HtrA2 和Beclin1 表達(dá)水平的結(jié)果顯示存在顯著影響（P＜0.01）。事后多重檢驗(yàn)表明，A組與對照組相比無顯著性差異（P＞0.05）；E組高于對照組（P＜0.05）；EA組明顯高于對照組和A 組（P＜0.05），但顯著低于E 組（P＜0.05）。Hax-1 蛋白含量則略有不同，E 組低于對照組（P＜0.05）；EA組明顯低于對照組和A組（P＜0.05），但顯著高于E組（P＜0.05）。

表3 不同干預(yù)后Hax-1蛋白表達(dá)量（%C組）

表4 不同干預(yù)后Beclin1蛋白表達(dá)量（%C組）

3 分析與討論

3.1 運(yùn)動對大鼠骨骼肌細(xì)胞自噬的影響

越來越多的證據(jù)表明，適當(dāng)、科學(xué)的運(yùn)動可以誘導(dǎo)自噬或優(yōu)化自噬的功能狀態(tài)，在骨骼肌修復(fù)過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[9-10]。有研究報(bào)道，受試小鼠急性劇烈運(yùn)動后2～7天，受損肌纖維自噬現(xiàn)象明顯[11]，溶酶體的生化功能最為活躍[12]；亦有研究報(bào)道，大鼠在跑臺急性運(yùn)動30 分鐘后，自噬蛋白微管相關(guān)蛋白輕鏈3（LC3-Ⅱ）即刻升高，運(yùn)動后3小時(shí)恢復(fù)至基礎(chǔ)水平[13]。本研究給予大鼠一次大負(fù)荷離心運(yùn)動干預(yù)，發(fā)現(xiàn)隨著時(shí)間的變化，自噬蛋白Beclin1 表達(dá)量在運(yùn)動后即刻、12 小時(shí)、24 小時(shí)和48 小時(shí)均顯著高于對照組。電鏡下觀察各組骨骼肌細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)和細(xì)胞器，發(fā)現(xiàn)運(yùn)動后即刻，骨骼肌肌小節(jié)出現(xiàn)損傷，大量線粒體向肌膜聚集，肌原纖維間的線粒體出現(xiàn)嚴(yán)重的結(jié)構(gòu)異常，肌原纖維損傷部位Z線消失，細(xì)胞器雜亂無序，肌漿網(wǎng)被嚴(yán)重破壞；運(yùn)動后12小時(shí)，完整視野下肌原纖維間自噬體正在形成，觀測明顯；運(yùn)動后24 小時(shí)，自噬小泡多以自噬溶酶體的形式出現(xiàn)；運(yùn)動后48 小時(shí)，完整視野下自噬體很難捕捉。這說明一次大負(fù)荷離心運(yùn)動成功誘導(dǎo)了大鼠骨骼肌自噬，且自噬水平可能與運(yùn)動干預(yù)的方式和負(fù)荷有關(guān)。另外，Beclin1蛋白表達(dá)峰值出現(xiàn)在運(yùn)動后12小時(shí)和24 小時(shí)，且兩時(shí)間點(diǎn)數(shù)值無顯著性差異，提示一次大負(fù)荷運(yùn)動后12小時(shí)是研究自噬的關(guān)鍵時(shí)間點(diǎn)。

關(guān)于大鼠骨骼肌細(xì)胞的自噬機(jī)制的研究較多，其中Omi/HtrA2-Hax1-Beclin1是2010年以來發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞自噬信號通路[7]。離體實(shí)驗(yàn)證實(shí)Omi/HtrA2位于自噬核心蛋白Beclin1 的上游參與自噬調(diào)節(jié)，Omi/HtrA2 通過切割Bcl-2家族相關(guān)蛋白Hax-1，解除其對Beclin1的抑制，最終誘導(dǎo)自噬[6]。在運(yùn)動誘導(dǎo)的骨骼肌自噬過程中，Omi/HtrA2-Hax-Beclin1 同樣存在并發(fā)揮作用[14]。本研究結(jié)果驗(yàn)證，運(yùn)動干預(yù)引起Omi/HtrA2蛋白表達(dá)變化的過程中，Hax-1 和Omi/HtrA2、Beclin1 均呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)性表達(dá)。值得注意的是，自噬在細(xì)胞中有雙重作用，既可以發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用又可以發(fā)揮細(xì)胞損傷作用，主要取決于應(yīng)激條件的不同[15]。

3.2 針刺影響運(yùn)動性骨骼肌細(xì)胞自噬的可能機(jī)制

在細(xì)胞營養(yǎng)缺乏或細(xì)胞損傷修復(fù)的過程中，自噬可以降解細(xì)胞內(nèi)大分子有用物質(zhì)和細(xì)胞器，釋放分解產(chǎn)物，為細(xì)胞提供能量或用于合成構(gòu)建物質(zhì)，援助細(xì)胞生存。正常情況下，自噬過程會在機(jī)體度過危機(jī)后適時(shí)停止，否則自噬泡非特異性捕獲胞漿成分的特性會導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生不可逆的損傷，直至引起細(xì)胞死亡[16]。已知針刺可以增強(qiáng)損傷骨骼肌細(xì)胞的修復(fù)能力，降低損傷水平，有效緩解運(yùn)動訓(xùn)練造成的骨骼肌損傷異常[17]，有研究學(xué)者對此作了針刺干預(yù)的機(jī)制研究，發(fā)現(xiàn)針刺之所以能促進(jìn)損傷骨骼肌修復(fù)，主要在于其對骨骼肌蛋白分解和合成代謝的雙向調(diào)節(jié)作用[18]。但是針刺對自噬的影響機(jī)制目前尚未明晰。

本研究在大鼠一次大強(qiáng)度離心運(yùn)動誘導(dǎo)骨骼肌損傷后連續(xù)監(jiān)測自噬蛋白Beclin1，運(yùn)動后72小時(shí)自噬消失，同時(shí)給予一次大強(qiáng)度離心運(yùn)動后針刺干預(yù)，自噬現(xiàn)象則會明顯降低，同時(shí)伴有損傷骨骼肌超微結(jié)構(gòu)修復(fù)，說明針刺可緩解損傷骨骼肌細(xì)胞自噬，促進(jìn)修復(fù)。為明確針刺促進(jìn)損傷骨骼肌的修復(fù)機(jī)制，本研究觀察單一針刺后大鼠骨骼肌細(xì)胞Omi/HtrA2-Hax1-Beclin1通路蛋白表達(dá)的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，針刺并未影響健康大鼠的骨骼肌相關(guān)蛋白表達(dá)，雖然電鏡下線粒體形態(tài)稍有腫脹，但電鏡視野中未出現(xiàn)自噬體異常形成和分布，推測針刺可能對健康大鼠骨骼肌細(xì)胞有局部性輕微影響，且可能與細(xì)胞內(nèi)部平衡調(diào)節(jié)有關(guān)。繼續(xù)追加運(yùn)動后針刺干預(yù)實(shí)驗(yàn)，Omi/HtrA2 與自噬蛋白Beclin1 表達(dá)量均有改善性下降，Hax-1蛋白表達(dá)量改善性提高，該結(jié)論與運(yùn)動誘導(dǎo)骨骼肌自噬的Omi/HtrA2-Hax-Beclin1 通路變化趨勢一致[14]。提示針刺可能通過Omi/HtrA2- Hax-1- Beclin1 信號通路緩解一次大負(fù)荷離心運(yùn)動誘導(dǎo)的自噬。

4 結(jié)論

一次大強(qiáng)度離心運(yùn)動可造成骨骼肌超微結(jié)構(gòu)變化，誘導(dǎo)骨骼肌細(xì)胞自噬增強(qiáng)；一次大負(fù)荷運(yùn)動后進(jìn)行針刺干預(yù)，細(xì)胞的自噬水平明顯降低。其作用機(jī)制可能為：一次大強(qiáng)度離心運(yùn)動刺激Omi/HtrA2蛋白表達(dá)激活，增強(qiáng)自噬反應(yīng)；針刺可通過Omi/HtrA2- Hax-1-Beclin1 信號通路緩解一次大負(fù)荷離心運(yùn)動誘導(dǎo)的自噬。