殷 勇，王雪雅，彭世清，白立偉，史勛祝，楊秋燕，杜 雄，何建文*

(1.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 辣椒研究所，貴州 貴陽(yáng) 550006；2.麻江縣明洋食品有限公司，貴州 麻江 556000；3.沿河縣和平街道辦事處，貴州 沿河 565300)

山蒼子(Litseacubeba)屬于樟科木姜子屬的小喬木，也叫賽樟樹(shù)、山雞椒、木姜子等。山蒼子精油是一種復(fù)雜的混合物，主要成分為萜烯和萜類化合物[1-3]。由于檸檬醛含量最高，山蒼子精油通常可用于提取檸檬醛，提取出來(lái)的檸檬醛又可用來(lái)合成紫羅蘭酮類、維生素等[4-6]。山蒼子具有類似檸檬味的香氣，風(fēng)味純正，獨(dú)特，同時(shí)含有鋅、硒等微量元素，是一種對(duì)健康有益的食物。山蒼子既可鮮食，又可提出山蒼子油后加工制成調(diào)味品[7-9]，具有良好的食用品質(zhì)及安全性。

超臨界CO2提取法最能夠保持山蒼子精油的原生特性，超臨界CO2流體的萃取溫度與室溫接近(35～40 ℃)，且在避光條件下進(jìn)行，特別利于對(duì)濕、熱、光等敏感的物質(zhì)以及芳香性物質(zhì)的提取[10-13]。揮發(fā)油類成分極性較小，沸點(diǎn)較低，易溶于CO2超臨界流體，又由于大多數(shù)揮發(fā)性油性質(zhì)不穩(wěn)定，在常規(guī)的水蒸氣蒸餾條件下易造成揮發(fā)油的分解或氧化，且回收率較低[14-15]。而超臨界CO2流體可以克服蒸餾法缺點(diǎn)，所得的產(chǎn)品回收率高、品質(zhì)好，故對(duì)揮發(fā)性油的提取效果具有其他技術(shù)不可比擬的優(yōu)勢(shì)[16]。避免了溶劑提取法、蒸餾法中精餾加熱所造成的油脂氧化、酸敗和有機(jī)溶劑殘留等問(wèn)題，克服了壓榨法精制過(guò)程中造成的芳香油揮發(fā)、色澤變暗等缺點(diǎn)。本文就超臨界CO2流體技術(shù)對(duì)山蒼子油的提取工藝進(jìn)行了研究，對(duì)開(kāi)發(fā)超臨界CO2提取山蒼子油工藝及利用山蒼子油具有一定的參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

山蒼子：采自貴州省畢節(jié)市赫章縣，新鮮、成熟、無(wú)腐爛，去雜質(zhì)，40 ℃烘干粉碎成20、40、60、80目備用。試劑：CO2(純度99.99 %)；無(wú)水硫酸鈉(分析純)；無(wú)水乙醇(色譜純)。儀器設(shè)備：ASI超臨界萃取儀，SFE-2(美國(guó) Applied SeParations Inc)；低溫恒溫槽，SDC-6(南京寧凱儀器有限公司)；萬(wàn)能粉碎機(jī)，F(xiàn)W80(永康市紅太陽(yáng)機(jī)電有限公司)；電熱鼓風(fēng)干燥箱，DHG-9240A(上海煜南儀器有限公司)；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，Trace ISQ(美國(guó)Thermo Fisher公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1超臨界CO2萃取工藝流程

超臨界CO2萃取工藝流程如圖1所示。

圖1 超臨界CO2萃取工藝流程圖Fig.1 Flow chart of supercritical CO2 extraction process

1.2.2山蒼子油提取率的計(jì)算[17]

取10 g山蒼子粉末置于萃取釜中，按照CO2超臨界流體萃取儀操作流程，最后將收集瓶中所得的山蒼子油進(jìn)行準(zhǔn)確稱量(g)。

山蒼子提取率=(山蒼子油質(zhì)量/山蒼子原料質(zhì)量)×100%

1.2.3單因素試驗(yàn)

分別考察萃取壓力、溫度、時(shí)間、顆粒粒度及CO2流量對(duì)山蒼子油提取率的影響，以較優(yōu)條件為基數(shù)[18]，設(shè)計(jì)變量取值，進(jìn)一步優(yōu)化條件。

設(shè)置試驗(yàn)萃取壓力為20 Mpa，CO2流量為7.5 L/h，取10 g過(guò)40目篩的山蒼子粉末，在溫度40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃下萃取30 min。

設(shè)置萃取溫度50 ℃，CO2流量7.5 L/h，取10 g過(guò)40目篩的山蒼子粉末，萃取壓力設(shè)置為20 Mpa、30 Mpa、40 Mpa、50 Mpa萃取30 min。

設(shè)置萃取溫度50 ℃，壓力40 Mpa，取10 g過(guò)40目篩的山蒼子粉末，將CO2流量設(shè)置為2.5 L/h、5 L/h、7.5 L/h、10 L/h下萃取30 min。

設(shè)置萃取溫度50 ℃，壓力40 Mpa，CO2流量為7.5 L/h，取10 g過(guò)20、40、60、80目篩的山蒼子粉末萃取30 min。

設(shè)置萃取溫度50 ℃，壓力40 Mpa，CO2流量為7.5 L/h，取10 g山蒼子粉末，分別在15 min、30 min、45 min、60 min進(jìn)行萃取。

1.2.4正交試驗(yàn)

依據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行正交試驗(yàn)，以山蒼子油提取率為指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，最終確定超臨界CO2流體萃取山蒼子油的最佳工藝條件。

1.2.5驗(yàn)證試驗(yàn)

按照正交試驗(yàn)優(yōu)化得出的操作條件進(jìn)行超臨界CO2流體萃取山蒼子油試驗(yàn)，平行試驗(yàn)3次，考察最佳條件的可靠性和穩(wěn)定性。

1.2.6氣相色譜條件和質(zhì)譜條件[19]

色譜柱為HP5MS石英毛細(xì)管柱(30 mm×0.25 mm×0.25 μm，5%苯基95%甲基聚硅氧烷)；程序升溫：柱初始溫度50 ℃，保持2 min，以3 ℃/min的速度升溫至120 ℃，保持2 min，再以15 ℃/min的速度升溫至250 ℃，保持5 min；載氣為高純氦氣，柱前壓50 kPa，流速：1 mL/min；乙醚以1∶10稀釋；進(jìn)樣量：0.1 μL；溶劑延遲：4 min；進(jìn)樣口溫度：220 ℃；分流比1∶40。電離源：EI源；電離電壓：70 eV；質(zhì)量掃描范圍：35-500 m/z；四級(jí)桿溫度：150 ℃；離子源溫度：240 ℃；接口溫度：260 ℃；光電倍增管電壓：1024 V。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采集GC-MS所得到的質(zhì)譜圖，利用NIST譜庫(kù)進(jìn)行檢索分析，同時(shí)結(jié)合有關(guān)文獻(xiàn)[20]的保留指數(shù)對(duì)化合物進(jìn)行定性分析，利用峰面積歸一化法對(duì)色譜峰進(jìn)行歸一化處理，對(duì)各組分進(jìn)行定量分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 超臨界CO2萃取處理山蒼子單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1萃取溫度對(duì)山蒼子油提取率的影響

如圖2所示，山蒼子油提取率隨溫度的升高而增加，當(dāng)溫度上升到50 ℃時(shí)，山蒼子精油提取率達(dá)到最高值，為12.9%，繼續(xù)提高溫度，山蒼子油提取率下降，萃取溫度在40 ℃時(shí)與其余溫度有顯著差異(P<0.05)，其余三個(gè)溫度下沒(méi)有顯著差異(P>0.05)。由此說(shuō)明當(dāng)溫度達(dá)到50 ℃后，繼續(xù)提高萃取溫度對(duì)山蒼子油的提取率影響不大，可見(jiàn)溫度對(duì)超臨界CO2萃取能力的影響具有雙重效應(yīng)，升溫一方面增加了物質(zhì)的擴(kuò)散系數(shù)而利于萃取，另一方面卻因?yàn)榻档土薈O2的密度，使物質(zhì)的溶解度降低而不利于萃取。通過(guò)對(duì)萃取溫度進(jìn)行單因素試驗(yàn)，獲得山蒼子油的最佳萃取溫度為50 ℃。

圖2 溫度對(duì)提取率的影響Fig.2 Effect of temperatures on the extraction rate of L. cubeba

2.1.2萃取壓力對(duì)山蒼子油提取率的影響

由圖3可知，隨著萃取壓力的升高，山蒼子油提取率呈先上升后下降的趨勢(shì)，壓力為40 MPa時(shí)，山蒼子油提取率最高，為13.47%，與其他處理組呈顯著性差異(P<0.05)。當(dāng)萃取壓力升高到50 MPa時(shí)，山蒼子油提取率下降至11.93%。壓力的升高，導(dǎo)致CO2流體密度增大，進(jìn)而影響提取物的溶解度，使山蒼子在流體中的溶解度增大，繼續(xù)升高壓力，導(dǎo)致CO2擴(kuò)散系數(shù)減小，CO2流體溶解度降低，造成CO2流體溶解度大于CO2流體密度，進(jìn)而出現(xiàn)提取率的下降[20]。通過(guò)對(duì)萃取壓力進(jìn)行單因素試驗(yàn)，獲得山蒼子油的最佳萃取壓力為40 MPa。

圖3 壓力對(duì)山蒼子油提取率的影響Fig.3 Effect of pressure on the extraction rate of L. cubeba

2.1.3CO2流量對(duì)山蒼子油提取率的影響

由圖4可知，山蒼子油的提取率隨著CO2流量的增加先升高后下降，CO2流量為2.5 L/h、5 L/h時(shí)，對(duì)山蒼子油的提取率無(wú)顯著性差異(P>0.05)，但與其余處理組呈顯著性差異(P<0.05)。在2.5 L/h時(shí)，由于流速過(guò)慢，傳質(zhì)推動(dòng)力較小，萃取能力不佳，提取率較低，當(dāng)CO2流量在 5 L/h以上時(shí)，山蒼子油的提取率提高得很快，達(dá)到7.5 L/h時(shí)，提取率最高，為13.27%。CO2流量的增加，導(dǎo)致CO2氣體與山蒼子提取物的傳質(zhì)推動(dòng)力增大，使溶劑與提取物的碰撞幾率變大，傳質(zhì)過(guò)程增強(qiáng)，提取率也隨之升高。隨著CO2流量的增加，山蒼子油在山蒼子粉和CO2之間的濃度差逐漸趨近最大濃度差，CO2對(duì)山蒼子油的萃取率不再隨流量的增加而明顯變化。由此得出，萃取山蒼子油最佳CO2流量為7.5 L/h。

圖4 CO2流量對(duì)提取率的影響Fig.4 Effect of CO2 flow on the extraction rate of L. cubeba

2.1.4顆粒粒度對(duì)山蒼子油提取率的影響

由圖5可知，隨著山蒼子顆粒粒度的增大，山蒼子油的提取率呈先上升后下降的趨勢(shì)，各處理組的提取率呈顯著差異(P<0.05)。顆粒粒度20～40目時(shí)，山蒼子油提取率增加較快，當(dāng)顆粒粒度為60目時(shí)，山蒼子油提取率最高，為13.8%，可見(jiàn)隨著山蒼子顆粒粒徑的減小，增大了山蒼子顆粒的表面積，能夠增大與CO2的接觸面積，有利于山蒼子顆粒的溶解，同時(shí)提高了山蒼子細(xì)胞破碎程度，減小了細(xì)胞壁對(duì)山蒼子油的束縛作用及從基質(zhì)中擴(kuò)散出來(lái)的距離，消除了擴(kuò)散障礙，利于萃取過(guò)程的進(jìn)行。當(dāng)山蒼子粒度繼續(xù)減小，有可能會(huì)使山蒼子顆粒隨著流體一起被帶出，也會(huì)形成高密度床層，阻塞溶劑流通通道，使傳質(zhì)速率下降，萃取率隨之受到影響，因而出現(xiàn)提取率下降的現(xiàn)象。通過(guò)對(duì)物料粒徑進(jìn)行單因素試驗(yàn)，獲得山蒼子油提取的物料最佳粒徑為60目。

圖5 顆粒粒度對(duì)山蒼子油提取率的影響Fig.5 Influence of particle size on extraction rate of L. cubeba

2.1.5萃取時(shí)間對(duì)山蒼子油提取率的影響

由圖6可知，隨著時(shí)間的增加，山蒼子油提取率不斷上升，當(dāng)提取時(shí)間為15 min時(shí)，山蒼子油提取率最低，為9.73%，與其余提取時(shí)間呈顯著性差異(P<0.05)；隨著萃取時(shí)間的增加，山蒼子油的提取率上升速率快，到30 min時(shí)，山蒼子油的提取率為12.91%；繼續(xù)增加提取時(shí)間，山蒼子油的提取率變化無(wú)顯著性差異(P>0.05)。原因可能是試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)，CO2流體滲入原料的時(shí)間不足，CO2流體與山蒼子提取物的溶解達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡，需要一定的時(shí)間積累，接近30 min時(shí)，基本達(dá)到穩(wěn)定。由此，獲得山蒼子油最佳提取時(shí)間為30 min。

圖6 萃取時(shí)間對(duì)山蒼子油提取率的影響Fig.6 Influence of extraction time on extraction rate of L. cubeba

2.2 超臨界CO2萃取山蒼子油正交試驗(yàn)結(jié)果分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)得出的各組最優(yōu)條件，即最佳萃取壓力為40 Mpa，最佳CO2流量為7.5 L/h，最佳顆粒粒度為60目，最佳萃取時(shí)間為30 min，采用正交試驗(yàn)方法進(jìn)行設(shè)計(jì)，如表1。

表1 試驗(yàn)正交因素與水平Tab.1 Orthogonal factor and level in experiment

正交試驗(yàn)結(jié)果如表2所示，根據(jù)綜合評(píng)分顯示的極差大小，各因素的影響程度為A>C>B>D，即萃取壓力>顆粒粒度>CO2流量>萃取時(shí)間；試驗(yàn)結(jié)果的方差分析如表3所示，試驗(yàn)各因素均對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有顯著影響(P<0.05)。綜合方差分析、極差分析結(jié)果，得到山蒼子CO2超臨界萃取最佳工藝為A3C3B3D1，即萃取壓力為45 MPa、CO2流量9 L/h，顆粒粒度50目，萃取時(shí)間30 min，萃取溫度50 ℃。

表2 L9 (34)正交試驗(yàn)方案與結(jié)果Tab.2 L9 (34) Orthogonal experimental protocol and results

表3 正交試驗(yàn)方差分析Tab.3 Orthogonal test analysis of variance

按照正交試驗(yàn)得出的最佳工藝，在萃取溫度50 ℃、萃取壓力45 MPa、CO2流量9 L/h，顆粒粒度50目，萃取時(shí)間30 min下進(jìn)行3次重復(fù)操作，得到的山蒼子油平均提取率為14.35%，試驗(yàn)結(jié)果符合預(yù)期，試驗(yàn)穩(wěn)定可靠。

2.3 山蒼子油揮發(fā)性成分分析

經(jīng)提取，山蒼子油樣品的揮發(fā)性成分共發(fā)現(xiàn)36個(gè)組分(表4)，選取占總峰面積91.25%的目標(biāo)色譜峰(圖7)，通過(guò)NIST標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)檢索對(duì)目標(biāo)化合物的可能結(jié)構(gòu)進(jìn)行定性分析，得到以下結(jié)果。

圖7 山蒼子油的總離子流圖Fig.7 The tolal ion chromatogram of L. cubeba oil

表4 山蒼子油的成分分析Tab.4 Analysis of the composition of L. cubeba oil

在不同類別組分的相對(duì)含量分析中，各類組分峰面積之和分別占總峰面積的百分比如下：?jiǎn)屋坪跹苌?8.73%、單萜類化合物18.64%、倍半萜類化合物1.23%、芳香族化合物 1.14%。其中單萜及其含氧衍生物是山蒼子果實(shí)揮發(fā)性成分的主要物質(zhì)，這2類組分的峰面積之和占總峰面積88.84%，含量較多的是α-檸檬醛(38.9%)、β-檸檬醛(21.01%)及檸檬烯(8.16%)。

從單個(gè)組分的相對(duì)含量分析，山蒼子揮發(fā)油中的主要成分為α-檸檬醛、β-檸檬醛、檸檬烯、芳樟醇，4種成分所占比例達(dá)到75.87%，其中檸檬醛含量為65.44%，甲基庚烯酮、芳樟醇的含量比陶能國(guó)等[22]的研究成分高。檸檬醛是一種α-二烯醛，也是一種不飽和醛，呈濃郁檸檬香味，具有抗菌、抗氧化等多種生物活性，主要用于配制檸檬、草莓、蘋果等水果型香精[23]；其次相對(duì)較高的含量物質(zhì)為甲基庚烯酮(5.16%)、香茅醛(2.91%)、香葉醇(1.76%)、環(huán)己烯(1.43%)。山蒼子提取油具有辛香、木香及隱約的檸檬香氣[24]，由表4的分析結(jié)果可知，對(duì)香氣貢獻(xiàn)較大的化合物除上述含量較高的8種外，主要還有甲酸香葉酯、異戊酸香葉酯、氧化芳樟醇、月桂酸甲酯、香茅醛、馬鞭草烯酮等。其中α -檸檬醛、β-檸檬醛、香茅醛等是檸檬香氣的主要來(lái)源；α-松油醇甲酸香葉酯、異戊酸香葉酯、月桂酸等是辛香、脂蠟味、草本樣香氣的主要來(lái)源，芳樟醇、α -松油醇、β-石竹烯、乙酸香葉酯等是木香的主要來(lái)源[25]。

3 結(jié)論與討論

山蒼子油具有較好的芳香特性，也是我國(guó)重要的食用香料，并具有顯著的抑菌、祛痰、抗心律失常等作用[26]。目前，獲取山蒼子油多采用水蒸氣蒸餾的方法，用有機(jī)溶劑或壓榨法獲取山蒼子油，工藝均較簡(jiǎn)單、原始、得油率較低，提取的山蒼子油品質(zhì)較差，質(zhì)量不穩(wěn)定。超臨界CO2流體的萃取溫度與室溫接近(35～40 ℃)，且在避光條件下進(jìn)行，特別利于對(duì)濕、熱、光等敏感的物質(zhì)以及芳香性物質(zhì)的提取[27-29]。揮發(fā)油類成分極性較小，沸點(diǎn)較低，易溶于CO2超臨界流體，又由于大多數(shù)揮發(fā)性油性質(zhì)不穩(wěn)定，在常規(guī)的水蒸氣蒸餾條件下易造成揮發(fā)油的分解或氧化，且回收率較低[30-31]。選取超臨界CO2提取法最能夠保持山蒼子精油的原生特性的萃取方法，可以最大程度保護(hù)山蒼子油的品質(zhì)。本研究通過(guò)單因素及正交試驗(yàn)，得到超臨界CO2提取的最佳工藝為萃取溫度50 ℃、萃取壓力45 MPa、CO2流量9 L/h、顆粒粒度50目、萃取時(shí)間30 min，在此條件下山蒼子油提取率最高為14.35%。比目前常用的高壓蒸氣蒸餾技術(shù)提取山蒼子油的提取率高2.6倍[32]，比超聲輔助減壓蒸餾技術(shù)的提取率高出2倍[33]，比水蒸氣蒸餾法的提取率高3.7倍[34]，因此超臨界 CO2萃取山蒼子油具有工藝簡(jiǎn)單、操作方便、得油率高等傳統(tǒng)工藝不可比擬的優(yōu)點(diǎn)。

通過(guò)GC-MS分析發(fā)現(xiàn)，山蒼子油有36個(gè)不同組分，其中主要成分為α-檸檬醛、β-檸檬醛、檸檬烯、芳樟醇，4種成分所占比例達(dá)到75.87%，檸檬醛成分高達(dá)65%以上。結(jié)果同何金明等[35]的研究相似，通過(guò)對(duì)山蒼子油各主要成分含量的分析，可知山蒼子油的特征風(fēng)味是由多種芳香物質(zhì)綜合而來(lái)，其中主要成分檸檬醛，是山蒼子油風(fēng)味的主要呈味物質(zhì)，檸檬醛含量對(duì)山蒼子品質(zhì)有正相關(guān)關(guān)系，在食品加工、天然香料及綜合利用等方面開(kāi)發(fā)利用山蒼子資源提供了科學(xué)依據(jù)。