曹 芳，王宇峰，于春梅，夏西洋，高亭亭，戴秀亮

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬常州市婦幼保健院生殖中心，江蘇 常州 213000)

胚胎發(fā)育潛能直接影響人類輔助生殖技術(shù)的臨床結(jié)局。目前，主要以形態(tài)學(xué)評分評估胚胎質(zhì)量，具有主觀性，預(yù)測妊娠結(jié)局的價(jià)值有限，因此，探索能更客觀地評價(jià)胚胎發(fā)育潛能，更準(zhǔn)確地選擇優(yōu)質(zhì)胚胎，從而提高臨床妊娠率是胚胎學(xué)家需要攻克的難點(diǎn)。胚胎在其形態(tài)發(fā)生改變之前已發(fā)生了代謝產(chǎn)物的變化，而培養(yǎng)基是胚胎在體外的直接生存環(huán)境，培養(yǎng)基中代謝物質(zhì)變化可能與胚胎質(zhì)量有關(guān)。本研究探討了利用拉曼光譜技術(shù)對培養(yǎng)基代謝物質(zhì)分析是否與胚胎生殖潛力相關(guān)，從而尋找一種新的客觀評價(jià)胚胎質(zhì)量的方法。

1 資料與方法

1.1研究對象 收集2019年86例體外受精/卵細(xì)胞漿內(nèi)單精子注射周期中第3天(D3)卵裂期胚胎培養(yǎng)液，其中D3優(yōu)質(zhì)卵裂胚形成優(yōu)質(zhì)囊胚27例，D3優(yōu)質(zhì)卵裂胚未形成囊胚29例，D3次級(jí)卵裂胚未形成囊胚30例。

1.2方法

1.2.1胚胎培養(yǎng)及分級(jí) 人絨毛膜促性腺激素日48 h后常規(guī)消毒取卵，在體外受精微滴中授精過夜，去除受精卵顆粒細(xì)胞后轉(zhuǎn)移至G1培養(yǎng)液滴，記錄第1天(D1)原核情況，D3將準(zhǔn)備繼續(xù)進(jìn)行囊胚培養(yǎng)的卵裂胚轉(zhuǎn)移至G2培養(yǎng)液滴。根據(jù)胚胎形態(tài)學(xué)評分標(biāo)準(zhǔn)對卵裂期胚胎進(jìn)行分級(jí)，Ⅰ、Ⅱ級(jí)為優(yōu)質(zhì)卵裂胚；Ⅲ級(jí)為次級(jí)卵裂胚，Ⅳ級(jí)為廢棄胚胎。用序貫培養(yǎng)法將卵裂期胚胎繼續(xù)培養(yǎng)至第6天后根據(jù)卵裂胚繼續(xù)培養(yǎng)是否形成囊胚，以及形成的囊胚根據(jù)評分標(biāo)準(zhǔn)分為優(yōu)質(zhì)囊胚(內(nèi)細(xì)胞團(tuán)及滋養(yǎng)細(xì)胞均為B級(jí)以上)和次級(jí)囊胚(內(nèi)細(xì)胞團(tuán)或滋養(yǎng)細(xì)胞為C級(jí))。

1.2.2檢測拉曼光譜數(shù)據(jù) 將保存在-80 ℃冰箱中的待測培養(yǎng)基樣品在25 ℃下解凍，平衡30 min，去除表面的礦物油，利用320 mW功率的拉曼光譜系統(tǒng)(Basecare Raman200，中國)收集拉曼光譜，激光波長785 nm，光斑大小為100 μm。取7 μL胚胎培養(yǎng)基滴落在覆蓋一層薄金膜(100 nm)的石英玻璃片上。在標(biāo)準(zhǔn)模式下單次檢測曝光時(shí)間為20 s，累計(jì)3次，最終拉曼信號(hào)通過電荷耦合器件相機(jī)收集、處理。

1.2.3拉曼光譜數(shù)據(jù)的處理與分析 獲取原始光譜后首先扣除暗電流貢獻(xiàn)的環(huán)境噪聲信號(hào)，再選取600～1 800 cm-1波段數(shù)據(jù)作為生物指紋區(qū)，然后進(jìn)行基線校正去除部分由基底及背景熒光貢獻(xiàn)的干擾信號(hào)，采用主成分分析(PCA)，最后對所有樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理，統(tǒng)一數(shù)據(jù)規(guī)格。使用R軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，使用ggplot2和ggpubur繪制分析結(jié)果。

2 結(jié) 果

86例卵裂胚培養(yǎng)液樣本中56例優(yōu)質(zhì)卵裂胚與30例次級(jí)卵裂胚之間的信號(hào)存在明顯差異，具有明確的聚類現(xiàn)象。見圖1。27例D3優(yōu)質(zhì)卵裂胚形成囊胚與30例 D3次級(jí)卵裂胚未形成囊胚之間的信號(hào)存在明顯差異，具有明確的聚類現(xiàn)象。見圖2。27例D3優(yōu)質(zhì)卵裂胚形成囊胚與29例D3優(yōu)級(jí)卵裂胚未形成囊胚之間的信號(hào)存在明顯差異，具有明確的聚類現(xiàn)象。見圖3。分類準(zhǔn)確性可達(dá)到85%以上。29例D3優(yōu)質(zhì)卵裂胚未形成囊胚與30例D3次質(zhì)卵裂胚未形成囊胚之間的信號(hào)沒有明顯差異。見圖4。分類準(zhǔn)確性只有57%。

圖1 優(yōu)質(zhì)卵裂胚與次級(jí)卵裂胚的信號(hào)PCA

圖2 優(yōu)質(zhì)卵裂胚形成囊胚與次級(jí)卵裂胚未形成囊胚的信號(hào)PCA

圖3 優(yōu)質(zhì)卵裂胚形成囊胚與優(yōu)級(jí)卵裂胚未形成囊胚的信號(hào)PCA

圖4 優(yōu)質(zhì)卵裂胚未形成囊胚與次級(jí)卵裂胚未形成囊胚的信號(hào)PCA

3 討 論

目前，主要根據(jù)形態(tài)學(xué)(卵裂球數(shù)量、碎片、多核、空泡和卵裂球均一性)結(jié)合卵裂率(受精卵的卵裂速度)選擇卵裂期胚胎[1-2]。盡管這些評估系統(tǒng)對胚胎無損傷，操作簡便，但易受胚胎觀察人員主觀因素的影響，一定程度上制約了胚胎質(zhì)量評估的可重復(fù)性。為選擇具有更高發(fā)育潛能的胚胎，胚胎學(xué)家建立了蛋白質(zhì)組學(xué)、呼吸速率測量等[3-5]評估胚胎存活能力和發(fā)育潛力的非侵入性方法，但因檢測費(fèi)用、技術(shù)人員培訓(xùn)或不能快速提供結(jié)果等原因均未得到廣泛應(yīng)用。氨基酸在早期胚胎發(fā)育中具有多種作用，其消耗和生產(chǎn)氨基酸的方式取決于發(fā)育階段。胚胎的細(xì)胞基因組在不同轉(zhuǎn)錄狀態(tài)下表達(dá)不同的蛋白分子，調(diào)控影響胚胎發(fā)育潛能[6-7]。有研究表明，不同發(fā)育時(shí)期胚胎分泌蛋白譜有著顯著的不同：在胚胎發(fā)育的最初24 h內(nèi)培養(yǎng)液中分泌蛋白主要是母系來源蛋白；而D3胚胎由于合子基因組的激活，在培養(yǎng)液中產(chǎn)生大量的胚胎特異分泌蛋白。

拉曼光譜屬于散射光譜范疇，是光與物質(zhì)相互作用而產(chǎn)生的。單色光入射到某一介質(zhì)大多數(shù)產(chǎn)生瑞利散射；另有極少數(shù)散射光傳播方向及光波頻率發(fā)生了改變，這樣的散射被稱為拉曼散射[8]。有研究發(fā)現(xiàn)，通過不同材料的介質(zhì)，由于散射層面的結(jié)構(gòu)不同、分子基團(tuán)對散射光頻率產(chǎn)生不同影響，從而可通過散射光特點(diǎn)對物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析[9-10]。由于拉曼光譜技術(shù)在物質(zhì)檢測方面具有高效、簡便、樣本量少、重復(fù)性高等特點(diǎn)已被廣泛用于生物制藥、醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)等領(lǐng)域，成為疾病檢測和診斷的重要手段[11-13]。

不同發(fā)育潛力胚胎的培養(yǎng)液接受激光照射后會(huì)產(chǎn)生不同的拉曼光譜位移和譜帶強(qiáng)度。在輔助生殖技術(shù)領(lǐng)域中很少有學(xué)者使用拉曼光譜技術(shù)研究胚胎形態(tài)和胚胎質(zhì)量之間的相關(guān)性。受精后胚胎應(yīng)用單一培養(yǎng)法，每個(gè)微滴體積約25 μL，本研究利用拉曼光譜技術(shù)檢測樣本需求量極微，具有無創(chuàng)的特點(diǎn)，對傳統(tǒng)體外受精中的廢介質(zhì)進(jìn)行分析，通過胚胎培養(yǎng)液的變化快速優(yōu)選胚胎。本研究對86例樣本分別進(jìn)行9次不同點(diǎn)測試，共獲得774組樣本信號(hào)。為消除隨機(jī)誤差信號(hào)和宇宙高能離子對拉曼光譜信號(hào)的干擾，對每例樣本的9次重復(fù)信號(hào)進(jìn)行合并、平均，共得到86例平均光譜組。其中56例優(yōu)質(zhì)胚胎與30例次級(jí)胚胎之間的信號(hào)存在明顯差異，具有顯著的分類聚合現(xiàn)象，且基于拉曼光譜技術(shù)的評估方法與體外受精過程中胚胎D3的形態(tài)學(xué)評分結(jié)果相一致?？赡軝C(jī)制是發(fā)育至D3的優(yōu)質(zhì)胚胎和次級(jí)胚胎存在代謝差異，胚胎發(fā)育過程中不斷發(fā)生新陳代謝，通過自分泌作用改變周圍生存環(huán)境。29例優(yōu)質(zhì)卵裂胚未形成囊胚組及30例次級(jí)卵裂胚未形成囊胚組信號(hào)也存在明顯差異，具有明確的聚類現(xiàn)象，說明這種拉曼光譜之間的差異與囊胚形成能力無明顯相關(guān)。由于次級(jí)卵裂胚形成的囊胚數(shù)量較少，將在后續(xù)研究中比較優(yōu)質(zhì)卵裂胚形成囊胚及次級(jí)卵裂胚形成囊胚的差異，進(jìn)一步證實(shí)卵裂期胚胎拉曼光譜是否與囊胚形成能力有關(guān)。

拉曼光譜學(xué)是基于分子振動(dòng)信息，提供了豐富的分子結(jié)構(gòu)和組成信息，而不造成任何損害[14-15]。另外，拉曼光譜學(xué)特別適用于水樣，而且該技術(shù)取材微量，檢測方便，本研究只用了幾分鐘和7 μL的樣本量檢測參數(shù)，為卵裂期胚胎提供了一種新的簡單、客觀、實(shí)時(shí)、無創(chuàng)的評估胚胎方法，結(jié)合形態(tài)學(xué)評估方法可更有效地選擇胚胎，也可用于評估不同培養(yǎng)基的培養(yǎng)效果、不同患者周期胚胎質(zhì)量的比較等。尤其是對卵巢功能低下等獲卵少的患者，能更準(zhǔn)確地在D3卵裂期利用拉曼光譜篩選出發(fā)育潛能優(yōu)良的胚胎進(jìn)行移植，縮短體外培養(yǎng)時(shí)間，提高卵子利用率，改善試管嬰兒的臨床妊娠結(jié)局并減少多胎妊娠。