諶 赟，石沁祎，蔡 毅，戴 婷，劉 敏

（1.武漢市第六醫(yī)院，湖北 武漢 430000；2.黃石市陽新縣人民醫(yī)院，湖北 黃石 435299）

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是導(dǎo)致心血管疾病的主要原因之一，多發(fā)于高血壓、高血脂、吸煙和老年人群，近年來隨著人們生活方式的改變和人口老齡化的發(fā)展，AS發(fā)病率逐年升高［1-2］。AS發(fā)病機制復(fù)雜，目前還未完全清楚，其中由Ross［3］首次提出的“動脈粥樣硬化內(nèi)皮損傷學(xué)說”受到學(xué)術(shù)界廣泛認可，此學(xué)說指出，血管內(nèi)皮功能障礙始終存在于AS疾病中，血管內(nèi)皮損傷會加重AS。因此，研究內(nèi)皮細胞的損傷機制并探索改善損傷的藥物對AS的治療有著重要意義。亞精胺（spermidine，SPD）是一種多胺，廣泛存在于生物體內(nèi)［4］，對內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的維持具有重要作用［5］。SPD具有多種生理作用，參與調(diào)節(jié)多種生物學(xué)過程，主要包括自噬、細胞凋亡、細胞增殖、抗炎和抗氧化等，而SPD調(diào)控的諸多生理過程通常與SPD誘導(dǎo)細胞自噬有關(guān)［6］。自噬是細胞清除損傷細胞器和蛋白質(zhì)等物質(zhì)的機制之一，普遍存在于真核細胞生物中，對維持細胞的代謝平衡具有重要作用［7］。參與自噬調(diào)控的蛋白眾多，其中腺苷酸激活蛋白激酶-哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（adenylate activated protein kinase/mammalian target of Rapamycin，AMPK/mTOR）信號通路是調(diào)節(jié)自噬的重要途徑［8］，研究表明，SPD能夠通過調(diào)節(jié)自噬延緩AS和血管衰老［9-10］，但其分子機制仍不明確。本研究以人臍靜脈內(nèi)皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）為研究對象，利用脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)HUVEC構(gòu)建內(nèi)皮細胞損傷模型，探究SPD對內(nèi)皮細胞損傷模型的影響，并進一步探究SPD的抗AS作用是否與AMPK-mTOR信號通路有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 試劑和主要儀器

SPD、LPS、AMPK抑制劑多索霉素（dorsomorphin，Dor）和AMPK激活劑阿卡地新（acadesine，Aicar）（中國阿拉丁公司）；PBS、0.25%胰蛋白酶、CCK8試劑盒、抗熒光衰減封片劑（含DAPI）、Triton X-100、5%BSA封閉液、十二烷基硫酸鈉、TEMED、過硫酸銨、Tween-20、RIPA（強）組織細胞快速裂解液和BCA蛋白濃度測定試劑盒（中國Solarbio公司）；AnnexinⅤ-FITC/PI凋亡檢測試劑盒（美國BD公司）；甲醛（國藥集團）；一抗：兔抗人微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-Ⅰ（microtubule-associated protein 1 light chain 3-Ⅰ，LC3-Ⅰ）、LC3-Ⅱ、核孔糖蛋白62（nucleopore glycoprotein 62，P62）、GAPDH、AMPK、m-TOR、P70核糖體蛋白S6激酶（P70 ribosomal protein S6 kinase，P70S6K）、真核細胞翻譯起始因子4E結(jié)合蛋白1（eukaryotic cell translation initiation factor 4E-binding protein 1，4EBP1）單抗、熒光基團488標記的山羊抗兔IgG（二抗）和辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG（二抗）（中國Bioswamp公司）；兔抗人磷酸化AMPK（p-AMPK）、p-mTOR、p-4EBP1單抗（英國Abcam公司）；兔抗人p-P70S6K單抗（美國CST公司）；蛋白質(zhì)Marker（美國Helix公司）；PVDF轉(zhuǎn)移膜、化學(xué)發(fā)光試劑（美國Millipore公司）；原代內(nèi)皮細胞培養(yǎng)體系（中國iCell公司）。

超凈工作臺（蘇州智凈凈化設(shè)備有限公司；型號：SW-CJ-1D）；生物安全柜（美國Spantech公司；型號：BSC-1300IIB2）；CO2恒溫培養(yǎng)箱、移液器（美國Thermo公司；型號分別為311和F3）；倒置熒光顯微鏡（德國Leica公司；型號：DMIL LED）；流式細胞儀（中國艾森生物；型號：NovoCyte）；電泳儀（美國BIO-RAD公司；型號：mini protean 3 cell）；酶標儀（芬蘭雷勃公司；型號：MK3）；高速冷凍離心機（杭州奧盛儀器有限公司；型號：iCEN-24k）；全自動化學(xué)發(fā)光分析儀（上海天能科技有限公司；型號：Tanon-5200）。

1.2 細胞培養(yǎng)

HUVEC來源于中國科學(xué)院上海細胞庫。HUVEC在含10%滅活胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素雙抗的DMEM完全培養(yǎng)基中，置37℃、5% CO2、飽和濕度的孵箱內(nèi)培養(yǎng)。HUVEC用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基1∶2傳代培養(yǎng)。待細胞呈對數(shù)生長時即開始實驗。

1.3 CCK8法檢測HUVEC細胞存活率

收集細胞懸液，接種到96孔板中，過夜培養(yǎng)使細胞貼壁。分別加入不同濃度SPD（0，10，100，1000和2500 μmol·L-1）處理1，2和3 h后，加LPS 1 mg·L-1孵育24 h，每孔加入10 μL CCK8溶液，孵育1 h。酶標儀檢測450 nm波長處各孔的吸光度（A450nm）值。確定后續(xù)實驗SPD濃度和時間為100 μmol·L-1，3 h。

另取培養(yǎng)的細胞，SPD（0，50，100和200 μmol·L-1）預(yù)處理 3 h，加 LPS 1 mg·L-1孵育 24 h，以含有10% CCK8的新鮮培養(yǎng)基為空白組，檢測細胞存活率。細胞存活率（%）=（藥物組A450nm-空白組A450nm）/（細胞對照組A450nm-空白組A450nm）×100%。

1.4 細胞分組和處理

HUVEC分成7組，細胞對照組、模型組、模型+SPD（100 μmol·L-1預(yù)處理 3 h）組、模型+Dor（10 μmol·L-1預(yù)處理 1 h）組、模型+SPD+Dor（SPD 100 μmol·L-1預(yù)處理 3 h，Dor 10 μmol·L-1預(yù)處理1 h）組、模型+Aicar（0.5 mmol·L-1預(yù)處理1.5 h）組、模型+SPD+Aicar（SPD 100 μmol·L-1預(yù)處理 3 h，Aicar 0.5 mmol·L-1預(yù)處理1.5 h）［11］，藥物預(yù)處理后，模型組和用藥組分別加LPS1mg·L-1共同孵育24h［12］。

1.5 流式檢測細胞凋亡

取1.4分組處理的細胞，400×g，4℃離心5 min，棄上清后加入1 mL預(yù)冷的PBS，吹打混勻，400×g，4℃離心5 min，棄上清后將細胞重懸于200 μL PBS，加入 10 μL AnnexinⅤ-FITC和 10 μL PI，輕輕混勻，4℃避光孵育30 min，最后加入300 μL PBS，隨即進行流式檢測。使用NovoExpress分析軟件進行分析檢測細胞凋亡率。

1.6 免疫熒光檢測自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅰ，LC3-Ⅱ和P62表達水平

取1.4分組處理的細胞接種于12孔板，PBS清洗2次；加入1 mL 4%多聚甲醛室溫固定30 min，PBS清洗2次；加入1 mL 0.5%Triton X-100室溫通透20 min，PBS清洗2次；加入1 mL 5%BSA，37℃封閉1 h，棄封閉液；分別加入一抗（1∶200）LC3-Ⅰ，LC3-Ⅱ和P62，4℃孵育過夜，PBS清洗2次；按1∶200稀釋二抗，37℃孵育1 h，PBS清洗2次；加入300 μL抗熒光淬滅封片液（含DAPI），熒光顯微鏡觀察拍照，Image J軟件統(tǒng)計細胞熒光強度，表示蛋白表達水平。

1.7 Western印跡法檢測細胞自噬相關(guān)蛋白表達水平和AMPK-mTOR通路相關(guān)蛋白磷酸化水平

取1.4分組處理的細胞，吸去培養(yǎng)液，適量預(yù)冷的1×PBS洗滌2次，吸去PBS，按每1×106細胞加入裂解液（含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑）200 μL，4℃充分裂解細胞，將細胞刮入1.5 mL EP管中，4℃，12 000×g離心10 min，取上清，BCA試劑盒檢測蛋白濃度并定量。每孔上樣量為20 μg蛋白，將樣品于10%SDS-PAGE電泳，電轉(zhuǎn)至PVDF膜。5%脫脂奶粉室溫封閉4℃過夜，分別加入一抗（1∶1000），室溫孵育 1 h。洗膜 3次后，加二抗（1∶10 000），室溫孵育1 h。洗膜3次后，將膜放置在暗室中，將ECL發(fā)光液A和B等量混勻，加在膜正面與之充分接觸，最后將膜置于全自動化學(xué)發(fā)光分析儀中檢測，通過TANON GIS軟件讀取相關(guān)條帶積分吸光度值，以目標蛋白與內(nèi)參蛋白積分吸光度值比值表示蛋白的表達水平，以磷酸化蛋白條帶與其總蛋白條帶積分吸光度比值表示蛋白磷酸化水平。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗結(jié)果數(shù)據(jù)以±s表示，采用SPSS 25.0分析。多組間比較使用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SPD預(yù)處理對LPS誘導(dǎo)的HUVEC存活率的影響

CCK8法檢測結(jié)果（表1）顯示，與細胞對照組比較，模型組的細胞存活率顯著降低（P＜0.01）；與模型組相比，模型+SPD 50，100和200 μmol·L-1組細胞存活率顯著升高（P＜0.01），且SPD濃度越高細胞存活率越高。

Tab.1 Effect of spermidine（SPD）on cell viability of human umbilical vein endothelial cells （HUVECs）injured by lipopolysaccharide（LPS）by CCK8 assay

2.2 SPD預(yù)處理對LPS誘導(dǎo)的HUVEC凋亡率的影響

流式檢測細胞凋亡的結(jié)果見圖1，與細胞對照組相比，模型組細胞凋亡率顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，模型+SPD組和模型+Aicar組細胞凋亡率顯著降低（P＜0.01），模型+Dor組細胞凋亡率顯著升高（P＜0.01）；與模型+Dor組相比，模型+SPD+Dor組細胞凋亡率顯著降低（P＜0.01）；與模型+Aicar組相比，模型+SPD+Aicar組細胞凋亡率顯著降低（P＜0.01），提示SPD能顯著降低LPS誘導(dǎo)的內(nèi)皮損傷細胞凋亡率。

Fig.1 Effect of SPD on apoptosis rate of HUVECs injured by LPS by flow cytometry.HUVECs were pretreated with SPD 100 μmol·L-1for 3 h，dorsomorphin（Dor）10 μmol·L-1for 1 h，acadesine（Aicar）0.5 mmol·L-1for 1.5 h，then LPS 1 mg·L-1was added and co-incubated for 24 h.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with cell control group ；##P＜0.01，compared with model group；△△P＜0.01，compared with model+Dor group；▲▲P＜0.01，compared with model+Aicar group.

2.3 SPD預(yù)處理對LPS誘導(dǎo)的HUVEC自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅰ，LC3-Ⅱ和P62表達影響

2.3.1 免疫熒光法

免疫熒光結(jié)果見圖2，與細胞對照組相比，模型組LC3-Ⅰ和P62蛋白熒光強度升高（P＜0.01），LC3-Ⅱ蛋白熒光強度降低（P＜0.01）；與模型組相比，模型+SPD組和模型+Aicar組LC3-Ⅰ和P62蛋白熒光強度降低（P＜0.01），LC3-Ⅱ蛋白熒光強度升高（P＜0.01），模型+Dor組，LC3-Ⅰ和P62熒光強度升高（P＜0.01），LC3-Ⅱ熒光強度變化不明顯；與模型+Dor組相比，模型+SPD+Dor組LC3-I和P62蛋白熒光強度顯著降低（P＜0.01），LC3-Ⅱ蛋白熒光強度升高（P＜0.01）；與模型+Aicar組相比，模型+SPD+Aicar組LC3-I蛋白熒光強度顯著降低（P＜0.01），而LC3-Ⅱ和P62蛋白熒光強度變化不明顯。

Fig.2 Effect of SPD on autophagy of HUVECs injured by LPS by immunofluorescence assay.See Fig.1 for the cell treatment.B was the semi-quantitative result of A.LC3：microtubule-associated protein 1 light chain 3.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with cell control group；##P＜0.01，compared with model group；△△P＜0.01，compared with model+Dor group；▲▲P＜0.01，compared with model+Aicar group.

2.3.2 Western印跡法

Western印跡結(jié)果見圖3，與細胞對照組相比，模型組LC3-Ⅰ和P62蛋白表達顯著升高（P＜0.01），LC3-Ⅱ蛋白表達水平顯著降低（P＜0.01）；與模型組相比，模型+SPD組和模型+Aicar組LC3-Ⅰ和P62蛋白表達水平顯著降低（P＜0.01），LC3-Ⅱ蛋白表達水平顯著升高（P＜0.01），模型+Dor組，LC3-Ⅰ蛋白表達水平顯著升高（P＜0.01），LC3-Ⅱ蛋白表達水平顯著降低（P＜0.01），P62蛋白表達水平升高，但無統(tǒng)計學(xué)差異；與模型+Dor組和模型+Aicar組相比，模型+SPD+Dor組和模型+SPD+Aicar組LC3-Ⅰ和P62蛋白表達水平顯著降低（P＜0.01），LC3-Ⅱ蛋白表達水平顯著升高（P＜0.01）。提示SPD能夠通過調(diào)控自噬相關(guān)蛋白的表達促進LPS誘導(dǎo)的HUVEC自噬。

Fig.3 Effect of SPD on autophagy related protein expressions of HUVECs injured by LPS by Western blotting.See Fig.1 for the cell treatment.B was the semi-quantitative result of A.IA：integral absorbance.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with cell control group；##P＜0.01，compared with model group；△△P＜0.01，compared with model+Dor group；▲▲P＜0.01，compared with model+Aicar group.

2.4 SPD預(yù)處理對LPS誘導(dǎo)的HUVEC AMPK/mTOR通路相關(guān)蛋白磷酸化的影響

結(jié)果如圖4所示，與細胞對照組相比，模型組AMPK蛋白磷酸化水平顯著降低（P＜0.01），mTOR，P70S6K和4EBP1蛋白磷酸化水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，模型+SPD組和模型+Aicar組的AMPK蛋白磷酸化水平顯著升高（P＜0.01），mTOR，P70S6K和4EBP1蛋白磷酸化水平顯著降低（P＜0.01），模型+Dor組趨勢與之相反；與模型+Dor組相比，模型+SPD+Dor組AMPK蛋白磷酸化水平顯著升高（P＜0.01），mTOR，P70S6K和4EBP1蛋白磷酸化水平顯著降低（P＜0.01）；與模型+Aicar組相比，模型+SPD+Aicar組AMPK蛋白磷酸化水平無統(tǒng)計學(xué)差異，mTOR和4EBP1蛋白磷酸化水平顯著降低（P＜0.05），P70S6K蛋白磷酸化水平無統(tǒng)計學(xué)差異。提示SPD能調(diào)控LPS誘導(dǎo)損傷的HUVEC中AMPK/mTOR通路相關(guān)蛋白的磷酸化。

Fig.4 Effect of SPD on phosphorylation of adenylate activated protein kinase/mammalian target of Rapamycin（AMPK/mTOR）pathway related protein of HUVECs injured by LPS by Western blotting.See Fig.1 for the cell treatment.B1-B4 were the semi-quantitative results of A.P70S6K：P70 ribosomal protein S6 kinase.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with cell control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with model group；△△P＜0.01，compared with model+Dor group，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01，compared with model+Aicar group.

3 討論

本研究結(jié)果表明，SPD能夠提高內(nèi)皮損傷細胞的存活率，顯著降低細胞的凋亡率，提示SPD對LPS誘導(dǎo)的HUVEC細胞具有保護作用。

自噬的動態(tài)過程叫自噬流，只有自噬流通暢，細胞自噬才會正常進行，否則將會產(chǎn)生清除障礙，引起細胞損傷［13］。LC3和P62在細胞自噬的過程中有著重要的作用［14］。P62可以與泛素蛋白結(jié)合，并在自噬的過程中被降解，自噬流通暢時，P62表達水平較低［15］。本研究結(jié)果表明，LPS誘導(dǎo)的HUVEC中LC3-Ⅰ和P62表達上調(diào)，LC3-Ⅱ表達下調(diào)，表明LPS處理使HUVEC的自噬流發(fā)生異常。而SPD干預(yù)后，自噬標志蛋白向相反趨勢變化，說明SPD可使HUVEC自噬流通暢，促進HUVEC發(fā)生自噬。

AMPK/mTOR信號通路是調(diào)節(jié)細胞自噬的關(guān)鍵通路，當細胞受到刺激時AMPK發(fā)生磷酸化，使下游mTOR的磷酸化被抑制，進而促進自噬的發(fā)生［16］。P70S6K，4EBP1為mTOR的下游因子。研究報道，SPD能夠通過AMPK/mTOR通路調(diào)節(jié)自噬保護肝細胞［17］和心肌細胞［18］等細胞的損傷。本研究Western印跡結(jié)果顯示，SPD能夠上調(diào)p-AMPK并下調(diào)m-TOR，p-P70S6K和p-4EBP1的表達，表明SPD能夠促進AMPK激活發(fā)生磷酸化，并抑制下游因子的磷酸化，促進自噬發(fā)生；加入AMPK抑制劑Dor和AMPK激活劑Aicar，Dor組與SPD組趨勢相反，而Aicar組與SPD組趨勢相同，促進AMPK磷酸化。表明SPD能促進LPS誘導(dǎo)損傷的HUVEC中AMPK磷酸化，抑制m-TOR及下游因子磷酸化，通過激活A(yù)MPK/mTOR通路促進自噬。

綜上所述，SPD預(yù)處理可改善LPS誘導(dǎo)的HUVEC損傷，降低細胞凋亡率，促進細胞自噬，其機制可能與激活A(yù)MPK-mTOR信號通路有關(guān)。