鄭張軍 張金星 張?chǎng)?/p>

膽管癌是一種比較少見(jiàn)的消化道惡性腫瘤，主要來(lái)源于內(nèi)肝膽管上皮細(xì)胞，其發(fā)病率逐年升高，因早期膽管癌不易發(fā)現(xiàn)，且容易轉(zhuǎn)移與侵襲周圍器官，故了解此病的轉(zhuǎn)移機(jī)制進(jìn)行早期干預(yù)對(duì)提高該病治療效果具有重要意義[1]。研究表明，膽管癌的發(fā)生發(fā)展與肝內(nèi)膽管結(jié)石有著密切關(guān)系[2]。隨著對(duì)膽管癌的不斷研究發(fā)現(xiàn)，此病的發(fā)展與多種細(xì)胞的因子異常表達(dá)相關(guān)，細(xì)胞間黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)是介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞之間、細(xì)胞與細(xì)胞間質(zhì)之間相互黏附并參與細(xì)胞間通訊的細(xì)胞膜表面分子，在腫瘤的黏附于轉(zhuǎn)移中起著重要作用[3]?；|(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)在多種惡性腫瘤中表達(dá)增強(qiáng)，與惡性腫瘤的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[4]。核轉(zhuǎn)錄因子(nuclear transcription factor，NF-κB)存在于細(xì)胞質(zhì)中，在介導(dǎo)持續(xù)炎癥與腫瘤關(guān)系中起著重要作用[5]。髓源性抑制細(xì)胞(myeloid-derived suppressor cells,MDSC)在多種腦腫瘤中表達(dá)增加，正常的外周血單個(gè)細(xì)胞接觸膽管癌細(xì)胞后可呈現(xiàn)出MDSC特性且數(shù)量增加。基于上述研究背景，在本文研究中進(jìn)一步驗(yàn)證ICAM-1、MMP-9、NF-κB在膽管癌中的表達(dá)，并分析其與外周血免疫抑制細(xì)胞的相關(guān)性，為臨床上膽管癌的診治提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019年12月至2020年12月我院收治的60例膽管癌患者作為膽管癌組，男32例，女28例；年齡45～78歲，平均年齡(58.43±16.50)歲；腫瘤直徑：>5 cm 15例，2～5 cm 24例，<2 cm 21例；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期19例，Ⅲ期27例，Ⅳ期14例；高分化31例，中低分化29例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移28例；肌層浸潤(rùn)深度：無(wú)肌層浸潤(rùn)或者淺肌層浸潤(rùn)(<1/2)24例，深肌層浸潤(rùn)(≥1/2)36例。同期選取60例于我院體檢的健康人作為健康組，男30例，女30例；年齡46～79歲，平均年齡(59.38±16.50)歲。2組性別比、年齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本次研究所有研究對(duì)象知情同意，且簽署了知情同意書。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn)：膽管癌組患者符合《肝內(nèi)膽管癌外科治療中國(guó)專家共識(shí)(2020版)》[6]中對(duì)膽管癌患者的診斷標(biāo)準(zhǔn)；患者近3個(gè)月未使用過(guò)免疫抑制劑；臨床資料完整。健康組無(wú)膽管癌疾病，體檢正常。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn)：溝通障礙者；對(duì)本次研究不配合者；精神障礙者。

1.3 方法

1.3.1 ICAM-1、MMP-9、NF-κB檢測(cè)方法:取癌組織、癌旁組織制備為組織勻漿，采用ELISA法測(cè)定ICAM-1、MMP-9、NF-κB表達(dá)水平。將試劑放于18℃～25℃的室溫中待用，于反應(yīng)板每個(gè)孔加入100 μl標(biāo)準(zhǔn)品和樣品，室溫靜置25 h或者保持4℃輕微搖晃過(guò)夜，之后棄去孔中液體，用1×Wash Sohltion進(jìn)行洗滌4次，每孔加入300 μl Wash bufer,后再全部清洗一次，最后一次清洗將孔中液體全部清除。每個(gè)孔加入100 μl提前準(zhǔn)備好的1×Detation Antibody，室溫下輕微搖晃1 h，之后棄去孔中液體，重復(fù)之前清洗方式，每個(gè)孔加入100 μl提前準(zhǔn)備好的Streptavidin solution，室溫下輕微搖晃45 min，之后棄去孔中液體，重復(fù)之前清洗方式，清洗過(guò)后每個(gè)孔加入100 μl TMB One-Step Substrate Reagent(Itern H)，室溫下輕微搖晃30 min，之后在每個(gè)孔加入50 μl Stop Solution(Iterm I),立即在450 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)，查出ICAM-1、MMP-9、NF-κB表達(dá)水平。采用免疫組化檢測(cè)膽管癌組織、癌旁組織標(biāo)本ICAM-1、MMP-9、NF-κB表達(dá)情況，將采集到的組織用PBS沖洗后放入4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液內(nèi)固定12 h，脫水、透明、包埋后制作5～7 μm組織切片，將組織塊放入50℃溫水中展開(kāi)，用處理干凈的載玻片撈片，放入68℃恒溫箱內(nèi)烘烤2 h，在二甲苯中脫蠟浸泡25 min，之后浸在梯度乙醇各2 min，再用PBS沖洗2～3次，每次持續(xù)5 min。用80%甲醇孵育10 min，再用PBS沖洗2～3次，每次持續(xù)5 min。之后放入0.01 mmol/L枸櫞酸緩沖液中煮沸，自然冷卻>20 min，之后用冷水沖洗加快冷卻至室溫，再用PBS沖洗2～3次，每次持續(xù)5 min。加入正常山羊血清封閉液，室溫孵育20 min，甩去多余液體。滴加一抗50 μl，室溫靜置1 h，取出后37℃復(fù)溫45 min，用PBS沖洗2～3次，每次持續(xù)5 min。滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗40～50 μl，室溫靜置1 h，用PBS沖洗2～3次，每次持續(xù)5 min。之后滴加SP，室溫孵育30 min，用PBS沖洗2～3次，每次持續(xù)5 min。加入DAB顯色5～10 min，顯微鏡下掌握染色程度，用自來(lái)水沖洗10 min終止反應(yīng)。加入蘇木素給予復(fù)染，鹽酸乙醇分化后，使用自來(lái)水沖洗10～15 min，采用梯度乙醇進(jìn)行脫水，用二甲苯?jīng)_洗片2～3次一直到透明，采用中性樹(shù)脂封片處理，顯微鏡下觀察免疫組化染色情況。根據(jù)染色程度和染色細(xì)胞百分比進(jìn)行評(píng)估：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<10%為(-)，10%～26%為(+)，25%～75%為(++)，>75%為(+++)。

1.3.2 外周血免疫抑制細(xì)胞檢測(cè):流式細(xì)胞儀檢測(cè)免疫抑制細(xì)胞表達(dá)，分別采集2組空腹靜脈血3 ml，加入100 μl抗凝全血，裂解后用不同熒光標(biāo)記外周血免疫抑制細(xì)胞表面CD14+、CD11b+、HLA-DR-MDSC表達(dá)情況，選擇HLA-DR-的細(xì)胞群為MDSC。

2 結(jié)果

2.1 ICAM-1、MMP-9、NF-κB在癌組織、癌旁組織中的表達(dá) 與癌旁組織相比，癌組織中ICAM-1、MMP-9、NF-κB表達(dá)均升高(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 ICAM-1、MMP-9、NF-κB在癌組織、癌旁組織中的表達(dá)

2.2 ICAM-1、MMP-9、NF-κB與膽管癌演進(jìn)的關(guān)系 ICAM-1、MMP-9、NF-κB表達(dá)水平與膽管癌患者腫瘤直徑無(wú)關(guān)，與TNM分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)深度表達(dá)相關(guān)，Ⅲ期、Ⅳ期、中低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、≥1/2肌層浸潤(rùn)膽管癌患者ICAM-1、MMP-9、NF-κB表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 ICAM-1、MMP-9、NF-κB與膽管癌演進(jìn)的關(guān)系

2.3 外周血免疫抑制細(xì)胞在健康組、膽管癌組中的表達(dá) 膽管癌組外周血中MDSC比例高于健康健康組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 外周血免疫抑制細(xì)胞在健康組、膽管癌組中的表達(dá)

2.4 ICAM-1、MMP-9、NF-κB與外周血免疫抑制細(xì)胞相關(guān)性分析 ICAM-1、MMP-9、NF-κB、外周血免疫抑制細(xì)胞之間相關(guān)性分析，ICAM-1、MDSC之間呈正相關(guān)(r=0.597，P=0.001)，MMP-9、MDSC之間呈正相關(guān)r=0.585，P=0.001)，NF-κB、MDSC之間呈正相關(guān)(r=0.596，P=0.001)。見(jiàn)圖1。

圖1 ICAM-1、MMP-9、NF-κB與外周血免疫抑制細(xì)胞之間相關(guān)性分析

2.5 ROC曲線分析ICAM-1、MMP-9、NF-κB、MDSC對(duì)膽管癌的診斷價(jià)值 ROC曲線顯示，與ICAM-1、MMP-9、NF-κB、MDSC單項(xiàng)診斷相比，四項(xiàng)聯(lián)合對(duì)膽管癌的預(yù)測(cè)價(jià)值較高(P<0.05)。見(jiàn)表4，圖2。

表4 ROC曲線分析ICAM-1、MMP-9、NF-κB、MDSC對(duì)膽管癌的預(yù)測(cè)價(jià)值

圖2 ICAM-1、MMP-9、NF-κB、MDSC診斷膽管癌的ROC曲線

3 討論

膽管癌是一種惡性的消化系統(tǒng)腫瘤，臨床癥狀并不明顯，故發(fā)現(xiàn)時(shí)多為晚期，目前膽管癌發(fā)病機(jī)制尚不明確，其與肝膽管結(jié)石有著密切聯(lián)系，我國(guó)的肝膽結(jié)石患者約有10%的概率發(fā)生膽管癌[7]。研究顯示，膽管內(nèi)結(jié)石反復(fù)刺激膽管壁、膽泥淤積及細(xì)菌感染反復(fù)引起膽管上皮損傷及增生修復(fù)，導(dǎo)致膽管上皮的不典型增生，誘發(fā)膽管癌[8,9]。

ICAM-1是免疫球蛋白超家族成員，在免疫復(fù)合物的形成、抗原特異細(xì)胞毒性T細(xì)胞的識(shí)別、靶細(xì)胞的溶解中起著重要作用[10]。研究顯示，ICAM-1表達(dá)于腫瘤細(xì)胞表面利于免疫效應(yīng)的識(shí)別與腫瘤細(xì)胞的殺滅，腫瘤細(xì)胞及其他細(xì)胞產(chǎn)生的可溶性ICAM-1可有效阻斷細(xì)胞毒性細(xì)胞黏附，抑制殺滅腫瘤細(xì)胞效應(yīng)[11,12]。本文研究發(fā)現(xiàn)，膽管癌組織中ICAM-1水平高于癌旁組織，且隨之疾病的演進(jìn)不斷升高，其原因可能為ICAM-1介導(dǎo)白細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞黏附，導(dǎo)致原發(fā)細(xì)胞分離與癌細(xì)胞間黏附能力下降，此結(jié)果提示ICAM-1可能參與膽管癌的演進(jìn)。

MMP-9是蛋白水解酶家族重要的一員，是由巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞合成分泌，可降解和破壞彈性纖維及纖維粘連蛋白，促進(jìn)腫瘤的惡性演變，加強(qiáng)腫瘤細(xì)胞黏附能力，參與血管的形成，促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移[13]。MMP-9在腫瘤組織中活性異常增高，對(duì)腫瘤浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移起重要作用。臨床研究表明，MMP-9的表達(dá)與腫瘤的病理分級(jí)與浸潤(rùn)有關(guān)，病理分級(jí)越高其表達(dá)越高，MMP-9在腫瘤中的高表達(dá)，是由某些生長(zhǎng)因子的作用，MMP-9可降低腫瘤細(xì)胞之間的黏附性，提高其浸潤(rùn)與游走能力，導(dǎo)致惡性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移[14,15]。在本文研究中，膽管癌組織中MMP-9水平異常表達(dá)，且高于癌旁組織，表達(dá)水平與浸潤(rùn)深度顯著相關(guān)，隨著淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移增加，陽(yáng)性表達(dá)率升高。

NF-κB是細(xì)胞內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄因子，靜息狀態(tài)下以同源或異源二聚體的形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，細(xì)胞受到細(xì)菌感染等外源性刺激時(shí)與抑制蛋白剝離，進(jìn)入細(xì)胞核其調(diào)控作用[16]。研究表明，NF-κB是連接炎癥與腫瘤的中介因子，炎性因子形成的局部環(huán)境可促進(jìn)NF-κB釋放，過(guò)表達(dá)NF-κB可激活炎性因子的合成，形成惡性循環(huán)，使膽管上皮細(xì)胞發(fā)展成癌變[17,18]。本文研究結(jié)果表明，NF-κB在膽管癌中表達(dá)水平高于癌旁組織，且在疾病演進(jìn)過(guò)程中的表達(dá)升高加劇，此結(jié)果提示著NF-κB與膽管癌病情存在一定聯(lián)系。

MDSC可以限制腫瘤免疫的治療效果，并參與腫瘤的免疫逃逸[19]。臨床研究顯示，CD14+的MDSC在多種實(shí)體腫瘤中表達(dá)升高，腫瘤可誘導(dǎo)MDSC引起的免疫抑制促進(jìn)自身的免疫逃逸，去除腫瘤復(fù)合條件后外周血中MDSC比例下降，MDSC在多種腫瘤患者中表達(dá)增加，并與腫瘤的臨床分期有關(guān)[20,21]。本文進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，外周血免疫抑制細(xì)胞與ICAM-1、MMP-9、NF-κB表達(dá)水平呈正相關(guān)，且ICAM-1、MMP-9、NF-κB與外周血免疫抑制細(xì)胞聯(lián)合檢測(cè)可提高膽管癌的預(yù)測(cè)價(jià)值。

另外本文采用分析ICAM-1、MMP-9、NF-κB是否與膽管癌發(fā)生相關(guān)、ICAM-1、MMP-9、NF-κB與外周血免疫抑制細(xì)胞的關(guān)系，Logistic回歸分析顯示，ICAM-1、MMP-9、NF-κB與外周血免疫抑制細(xì)胞為膽管癌發(fā)生的危險(xiǎn)因素，且ROC曲線顯示，四項(xiàng)聯(lián)合預(yù)測(cè)膽管癌的價(jià)值明顯高于單項(xiàng)預(yù)測(cè)，提示著，臨床上可根據(jù)上述指標(biāo)表達(dá)情況早期評(píng)估此病。雖然本文發(fā)現(xiàn)四者與膽管癌相關(guān)，參與疾病演進(jìn)，但并未深入分析其作用機(jī)制，因此還需后續(xù)研究進(jìn)一步明確其參與演進(jìn)的具體作用機(jī)制，為臨床上此病的研究提供新方向。

綜上所述，本文研究發(fā)現(xiàn)，膽管癌組織中ICAM-1、MMP-9、NF-κB表達(dá)升高，隨著疾病的演進(jìn)，表達(dá)升高加劇，參與疾病的演進(jìn)，臨床上可根據(jù)其表達(dá)預(yù)測(cè)此病。