魏春華 ， 何 樂 ， 徐 葉 ， 林志鋒 ， 劉 辰 ， 柳開隆 ， 楊小燕 ， 劉建奎

(1. 龍巖學院生命科學學院 ， 福建 龍巖 364000 ； 2. 福建省家畜傳染病防治與生物技術重點實驗室 ， 福建 龍巖 364000 ； 3. 福建農(nóng)林大學動物科技學院 ， 福建 福州 350002)

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的一種危害世界養(yǎng)豬業(yè)的重要傳染性疾病，主要引起母豬的繁殖障礙及仔豬呼吸道疾病[1-2]。PRRS最早于1987年在美國報道[3]，隨后該病迅速蔓延至其他養(yǎng)豬業(yè)國家，造成了巨大的經(jīng)濟損失，1996年郭寶清等證實PRRS在我國存在，隨后迅速傳播至各個省份，成為我國規(guī)?；B(yǎng)豬場的主要疫病之一[4]。2006年暴發(fā)的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus,HP-PRRSV)給我國養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失[5]。2012年我國出現(xiàn)新的流行毒株，因其與流行于美國的NADC30同源性高，且存在與NADC30相同的不連續(xù)131個氨基酸缺失，因此將該類毒株命名為類NADC30 PRRSV，流行病學調查表明，類NADC30毒株已成為國內豬場流行的優(yōu)勢毒株[6-10]。由于類NADC30毒株基因組的高度變異性且與不同類型的毒株發(fā)生了重組，導致現(xiàn)有的商品化疫苗不能對其產(chǎn)生良好的免疫保護，我國PRRS防控面臨新的挑戰(zhàn)[11-17]。

根據(jù)其抗原性和病毒基因組的差異，PRRSV分為2個基因型：PRRSV-1(歐洲型)和PRRSV-2(北美型)。PRRSV基因組全長為15 kb左右，含有至少10個開放閱讀框(Open reading frame,ORF)，即ORF1a、ORF1b、ORF2a、ORF2b、ORF3、ORF4、ORF5a和ORF5～7。基于Shi等建立的PRRSV基因分型標準，PRRSV-2分為9個譜系(Lineage)[18]。目前，我國豬場主要流行的毒株為譜系1(類NADC30毒株)、譜系3(類QYYZ毒株)、譜系5(類VR2332毒株)和譜系8(類JXA1毒株和類CH-1a毒株)。由于PRRSV變異快，毒株多樣化，其基因組常常會出現(xiàn)重組現(xiàn)象，因此有必要監(jiān)測PRRSV流行動態(tài)，同時監(jiān)控新毒株的出現(xiàn)。本試驗在福建省某規(guī)?；i場臨床病料中分離得到2個基因組發(fā)生高度變異和重組的PRRSV，為了進一步了解毒株的分子遺傳特征，對分離毒株全基因組測序并使用分子生物學軟件對其進行遺傳演化分析和重組分析，以期為PRRS的防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品來源及細胞 2017—2018年采集某規(guī)模化豬場臨床癥狀為體溫升高、食欲不佳，伴有嚴重呼吸系統(tǒng)癥狀的疑似PRRSV感染豬的血液、肺臟、淋巴結等組織樣品，置于-80 ℃冰箱保存。穩(wěn)定高效表達豬CD163的MARC-145細胞(MARC-145CD163)由福建省家畜傳染病防治與生物技術重點實驗室構建并保存。

1.2 主要試劑 RNA提取試劑盒和普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，均購自天根生化科技有限公司；pEASY-Blunt Simple Cloning Vector，購自北京全式金生物技術有限公司；Superscript Ⅲ reverse transcriptase和Platinum?pfx DNA polymerase，均購自Invitrogen公司；山羊抗鼠IgG熒光抗體(FITC標記)，購自美國Sigma公司；PRRSV熒光定量RT-PCR檢測試劑盒，購自青島立見生物科技有限公司；PRRSV N 蛋白單克隆抗體(MAb)由福建省家畜傳染病防治與生物技術重點實驗室制備并保存。

1.3 病毒分離 將無菌采集的病豬肺臟、淋巴結等組織樣品剪碎，按1∶10的質量體積比加入DMEM溶液充分研磨，加入10%雙抗，反復凍融 3次，12 000 r/min離心10 min，上清液用0.22 μm濾器過濾，-80 ℃保存?zhèn)溆?。血液樣品?jīng)8 000 r/min離心10 min，取上清用0.22 μm濾器過濾，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

將過濾后的病料上清液和血清混合，分別接種于長滿單層的MARC-145CD163細胞和MARC-145細胞，PBS洗滌后加入適量的DMEM維持溶液，37 ℃ 5% CO2條件下培養(yǎng)，每天觀察細胞病變(Cytopathic effect，CPE)。當CPE達到80%左右收毒，反復凍融3次，3 000 r/min 離心10 min后取上清，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 間接免疫熒光法(Indirect immunofluorescence assay，IFA)檢測 將PRRSV接種于6孔培養(yǎng)板中長成單層的MARC-145CD163細胞(每孔放1張細胞爬片)，37 ℃吸附1 h，PBS洗滌3次后，加入3 mL MARC-145CD163細胞DMEM維持液，培養(yǎng)48 h。利用4%多聚甲醛固定，PBS洗滌3次后每孔加入200 μL PRRSV N蛋白鼠源MAb(1∶800)，37 ℃孵育1 h，PBS洗滌后加入FITC標記的山羊抗小鼠IgG(1∶1 600)孵育1 h，PBS洗滌后以中性樹脂封片，于激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。

1.5 PRRSV全基因組質粒的構建 參照參考文獻[19]的方法，根據(jù)VR2332、CH-1a、JXA1、NADC30、QYYZ、GM2毒株的序列設計5對重疊基因片段簡并引物，用于擴增PRRSV全基因組序列。按照RNA提取試劑盒操作說明書進行病毒液RNA提取，以制備的cDNA為模板進行PRRSV全基因各片段PCR擴增，反應結束用1%瓊脂糖凝膠鑒定。將回收純化的PCR產(chǎn)物連接到pEASY-Blunt Simple Cloning Vector上轉化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，陽性重組菌液送往北京睿博興科生物技術有限公司測序。

1.6 基因組遺傳變異分析及重組分析 運用生物學軟件DNASTAR 7.0和MEGA 6.0對分離毒株全基因組測序結果進行拼接，分析其基因組特性并構建遺傳進化樹。使用Simplot 3.5.1軟件[參數(shù)設置：核苷酸替代模型為Kimura-2-Parameter，核苷酸轉換(Transition)和顛換(Transversion)速率比(T/t)為2.0，Window為200 bp，Step為20 bp]和重組分析軟件Recombination Detection Program v.4.24(RDP 4.24)中的7種重組算法(RDP、GENECONV、BOOTSCAN、Max Chi、Chimaera、SISCAN和3Seq)對可能的重組事件進行檢測和分析。

2 結果

2.1 PRRSV的分離 將過濾后的病料上清液和血清混合，接種于MARC-145CD163細胞4 d后，可產(chǎn)生細胞聚集成叢、變圓等典型CPE。對分離獲得的病毒用PRRSV N蛋白單抗進行檢測，結果顯示被感染的細胞可以被抗PRRSV的特異性單抗所識別，呈現(xiàn)特異性的綠色熒光，而未感染的對照細胞無特異性綠色熒光，結果顯示成功分離到2株PRRSV(圖1)，將2株PRRSV分別命名為FJDJQ-2017(GenBank登錄號：MG011719)和FJDJQ-2018(GenBank登錄號：MN862433)。而將過濾后的病料上清液和血清混合，接種到MARC-145細胞，傳至8代，沒有CPE產(chǎn)生，IFA鑒定結果為陰性。

圖1 分離株PRRSV在MARC-145CD163細胞的間接免疫熒光鑒定Fig.1 IFA identification of PRRSV isolate in MARC-145CD163 cells

2.2 2株PRRSV的全基因組特征分析 2個PRRSV基因組長度(去除polyA后)均為15 016 bp，基因組之間的核苷酸同源性僅為85.8%，與譜系1的代表毒株NADC30、FJZ03和CHsx1401的核苷酸同源性為87.8%～92.7%，與譜系3的代表毒株QYYZ、GM2和FJFS的核苷酸同源性為82.8%～84.8%，與譜系5的代表毒株VR2332、BJ-4和RespPRRS MLV的核苷酸同源性為84.9%～85.1%，與譜系8的代表毒株JXA1、HuN4、TJ和CH-1a的核苷酸同源性為83.4%～84.9%，而與歐洲代表毒株LV同源性較低，僅為60.2%～60.5%。

為了進一步了解FJDJQ-2017和FJDJQ-2018毒株的基因組特性，將2個毒株與參考毒株NADC30、FJZ03、QYYZ、FJFS、VR2332、BJ-4、JXA1和HuN4進行序列比對。2個毒株ORF1a基因核苷酸序列長度為7 119 bp，編碼2 372 aa，其核苷酸同源性為83.7%，與參考毒株的核苷酸同源性為77.9%～93.5%。ORF1a基因編碼的非結構蛋白Nsp1～Nsp8中變異程度較大的是Nsp1β和Nsp2，變異程度較小的是Nsp1α和Nsp6。2個毒株ORF1b基因核苷酸序列長度為4 374 bp，編碼1 458 aa，相對ORF1a基因較保守，其核苷酸同源性為89.3%，與參考毒株的核苷酸同源性為85.2%～95.1%。與VR2332和CH-1a相比，F(xiàn)JDJQ-2017和FJDJQ-2018毒株的Nsp2基因在aa 322～432、aa 483和aa 504～522處存在不連續(xù)131 aa(111+1+19)的缺失，缺失模式與NADC30相同。

ORF2～ORF7基因編碼PRRSV的結構蛋白，氨基酸序列同源性分析表明，GP3和GP5蛋白變異最大。GP5蛋白中Q13和R151與PRRSV毒力相關，與VR2332毒株相比，F(xiàn)JDJQ-2017和FJDJQ-2018均存在R151K突變。與VR2332毒株相比，在中和表位(aa37～45)FJDJQ-2017與譜系3代表毒株均存在H38Y和L39S的突變。此外，與其他代表毒株相比，F(xiàn)JDJQ-2017與譜系3代表毒株存在幾處獨有的氨基酸突變：F25S、H38Y、L39S、A92S、L117F、A128V、L152I和R199H(圖2)。

圖2 PRRSV GP5氨基酸序列分析Fig.2 Alignment of the amino acid sequences of GP5 in PRRSV灰色區(qū)域：預測的抗原區(qū)域；黑色框：譜系3 PRRSV和 FJDJQ-2017毒株GP5蛋白重要氨基酸變異位點Grey area：Predicted antigenic regions；Black box:Important amino acid changes between lineage 3 PRRSV and FJDJQ-2017 strain in GP5

2.3 遺傳進化分析 為進一步了解所分離2株PRRSV的遺傳情況，將2株PRRSV 全基因組和ORF5基因分別與國內外代表毒株構建系統(tǒng)遺傳進化樹?；谌蚪M所構建的遺傳進化樹顯示，F(xiàn)JDJQ-2017和FJDJQ-2018同屬于譜系1的進化分支，為類NADC30毒株(圖3A)。基于ORF5基因構建的遺傳進化樹顯示，F(xiàn)JDJQ-2018屬于譜系1的進化分支，為類NADC30毒株，而FJDJQ-2017屬于譜系3的進化分支，為類QYYZ毒株(圖3B)，表明FJDJQ-2017可能為重組毒株。

圖3 分離株與參考毒株全基因組(A)和ORF 5基因(B)的系統(tǒng)進化樹分析Fig.3 Phylogenetic tree analysis of PRRSV isolated and reference strains based on the complete sequences (A) and ORF 5 gene (B)●：本試驗分離株；下同●:The strains isolated in this study. The same as below

2.4 重組分析 為了解2個毒株的重組情況，使用SimPlot 3.5.1軟件和RDP 4.24軟件進行重組分析，結果顯示FJDJQ-2017毒株和FJDJQ-2018毒株均由3個譜系毒株重組而來，其中FJDJQ-2017分離株是以類NADC30毒株為主要親本毒，以類QYYZ毒株和類VR2332毒株為次要親本毒發(fā)生重組而來；而FJDJQ-2018毒株是以類NADC30毒株為主要親本毒，以類QYYZ毒株和類JXA1毒株為次要親本毒發(fā)生重組而來。FJDJQ-2017基因組中檢測到4個可靠的重組斷裂點，分別位于ORF2(nt 12 200)、ORF3(nt 13 168)、ORF4(nt 13 519)和ORF7(nt 15 080)基因中，4個斷裂點將其分為5個基因區(qū)域，A (nt 1～12 200)、B(nt 12 201～13 168)、C(nt 13 169～13 519)、D(nt 13 520～15 080)和E(nt 15 081～15 521)。通過分段構建遺傳進化樹的方法進一步驗證重組事件，結果顯示，A和E基因區(qū)域位于類NADC30毒株分支，B和D基因區(qū)域位于類QYYZ毒株分支，而C基因區(qū)域位于類VR2332毒株分支，由此證實FJDJQ-2017是由3個譜系(譜系1、 3和譜系5)重組而來的變異毒株(圖4)。

圖4 FJDJQ-2017分離株全基因組重組分析Fig.4 Recombination analysis of FJDJQ-2017 isolate based on whole genomeA:FJDJQ-2017分離株全長基因重組分析； B:FJDJQ-2017分離株不同基因區(qū)域進化樹分析A:Recombination analysis of FJDJQ-2017 isolate full-length genome; B:Phylogenetic tree analysis based on different gene regions of FJDJQ-2017 isolate

FJDJQ-2018基因組存在6個斷裂點，分別存在ORF1a[nt 1 290(Nsp1β)、nt 4 197(Nsp2)、nt 7 002(Nsp7)和 nt 7 330(Nsp7)]和ORF1b[(nt 8 781(Nsp9)和nt 9 728(Nsp9)]中，6個斷裂點將其分為7個基因區(qū)域，A(nt 1～1 290)、B(nt 1 291～4 197)、C(nt 4 198～7 002)、D(nt 7 003～7 330)、E(nt 7 331～8 781)、F(nt 8 782～9 728)和G(nt 9 729～15 080)，通過分段構建遺傳進化樹的方法進一步驗證重組事件，結果顯示，A和E基因區(qū)域位于類JXA1毒株分支，B、D和G基因區(qū)域位于類NADC30毒株分支，而C和F基因區(qū)域位于類QYYZ毒株分支，由此表明FJDJQ-2018是由3個譜系(譜系1、 3和譜系8)重組而來的變異毒株(圖5)。

圖5 FJDJQ-2018分離株全基因組重組分析Fig.5 Recombination analysis of FJDJQ-2018 isolate based on whole genomeA:FJDJQ-2018分離株全長基因重組分析； B:FJDJQ-2018分離株不同基因區(qū)域進化樹分析A:Recombination analysis of FJDJQ-2018 isolate full-length genome; B:Phylogenetic tree analysis based on different gene regions of FJDJQ-2018 isolate

3 討論

豬繁殖與呼吸綜合征病毒是單股正鏈有囊膜的RNA病毒，主要引起仔豬呼吸道癥狀以及懷孕母豬的繁殖障礙。自1987年以來，PRRS每年給世界養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失[3，5]。2012年以來流行的類NADC30毒株,使PRRSV更加復雜多樣，其典型特征是易與其他毒株發(fā)生重組[6-9]。2017—2018年福建某規(guī)?；i場母豬流產(chǎn)癥狀極為嚴重(流產(chǎn)率約為20%)，且有PRRS的部分臨床癥狀。為了查出疫病傳播源頭，本試驗采集流產(chǎn)胎兒的肺臟、腎臟、淋巴結等病料組織和血清進行病毒分離及全基因組擴增，結果證實引起疫病的病原為3個譜系重組的PRRSV。

流行病學調查顯示，2013年之后福建省規(guī)?；i場存在HP-PRRSV、經(jīng)典毒株、類NADC30 PRRSV和疫苗株等多種毒株，加之頻繁的跨省或省內的生豬貿(mào)易，導致豬場存在多個毒株，甚至同一豬體內同時存在2個差異較大的毒株，為病毒的基因重組創(chuàng)造了條件[10,12-17,20]?；蛑亟M是PRRSV進化的重要機制之一，在PRRSV復制能力、毒力、免疫耐受和病原診斷中發(fā)揮重要作用[21-23]。近年來，類NADC30毒株與我國田間毒株發(fā)生了廣泛的重組，包括野毒株(譜系3、5和譜系8毒株) 和疫苗毒衍生株(JXA1 P80)。最近也報道類NADC30毒株與多個譜系的毒株發(fā)生重組，SCcd17和SCN17重組方式為L1+L5+L8，SD17-38、SCcd16和SCya17重組方式為L1+L3+L8，SD重組方式為L1+L8(疫苗株)，而FJLIUY來源于4個譜系間的重組(L1+L3+L5+L8)[24-28]。本試驗在某規(guī)?；i場分離到2株PRRSV，為了明確該毒株的分子特性，對分離株進行了全基因組序列分析。2株PRRSV全基因組核苷酸同源性僅為85.8%，基因組相似性差異比較大，與美洲型代表毒株苷酸同源性為82.8%～92.7%?；贜sp2基因分析顯示，2個毒株均含有131(111+1+19) aa的不連續(xù)缺失，具有類NADC30毒株的特征，表明其屬于譜系1毒株?；赑RRSV全長基因組構建的遺傳進化樹也表明2個毒株屬于譜系1，基于ORF5基因的進化樹分析表明FJDJQ-2017屬于譜系3，而FJDJQ-2018屬于譜系1?；蛑亟M分析證實，F(xiàn)JDJQ-2017分離株和FJDJQ-2018分離株均為3個譜系毒株重組而來，即FJDJQ-2017分離株是以類NADC30毒株為主要親本毒作為病毒骨架，以類QYYZ毒株和類VR2332毒株為次要親本毒發(fā)生重組而來的變異毒株；而FJDJQ-2018分離株是以類NADC30毒株為主要親本毒作為病毒骨架，以類QYYZ毒株和類JXA1毒株為次要親本毒發(fā)生重組而來的變異毒株。不同的重組模式是否會導致毒株的致病性發(fā)生改變還需進一步研究。

由于類NADC30 PRRSV的基因序列與國內的毒株差異較大，現(xiàn)有商品化疫苗不能對其產(chǎn)生良好的交叉保護性，導致其在豬場流行[11-17]。不同類型的類NADC30重組毒株頻繁出現(xiàn)，進一步證實PRRSV的遺傳多樣性，導致豬場防控PRRS的形勢更加嚴峻。本試驗分離的2個毒株不能感染MARC-145細胞，這可能與近年來PRRSV的變異導致其細胞嗜性發(fā)生一定改變有關。CD163能有效介導宿主細胞對PRRSV的內吞作用，在PRRSV侵入宿主細胞及其復制過程起著重要作用，因此本試驗使用構建的MARC-145CD163細胞，成功分離到2株PRRSV毒株。

目前，PRRSV減毒活疫苗已成為防控PRRS的有效手段。本試驗中2個PRRSV分離株是從商品化的減毒活疫苗免疫過的豬場中分離得到的。序列分析表明，2個毒株(FJDJQ-2017和FJDJQ-2018)與豬場使用疫苗株的核苷酸同源性較低且親緣關系較遠，可能是在長期的免疫壓力下造成了豬場不同譜系的PRRSV發(fā)生了基因重組，產(chǎn)生了新的變異毒株，從而使疫苗產(chǎn)生的抗體失去了對新毒株的免疫保護。鑒于PRRSV毒株存在較高的重組概率，豬場在防控PRRS時不能單純依靠疫苗，更應加強豬場的生物安全措施，尤其在引種時需進行PRRSV抗原和抗體檢測，避免引入新的毒株。