陳晶晶 李佳根 李兆琦 翁旭東

1.舟山旅游與健康職業(yè)學(xué)院 浙江舟山 316022 2.浙江海洋大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院 浙江舟山 316022 3.浙江魚(yú)老大農(nóng)業(yè)科技有限公司 浙江衢州 324400

香鹵魷魚(yú)是水產(chǎn)品加工產(chǎn)業(yè)重要產(chǎn)品，蛋白質(zhì)含量高、營(yíng)養(yǎng)豐富、味鮮味美，深受市場(chǎng)和消費(fèi)者歡迎。而晚期糖基終產(chǎn)物(Advanced Glycation end-products，AGEs)是由蛋白質(zhì)和糖類(lèi)物質(zhì)在較高溫度下，伴隨美拉德反應(yīng)生成的一類(lèi)有害物質(zhì)，可導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)改變，已被證實(shí)AGEs的積累與糖尿病、心腦血管疾病及人體衰老等都有密切關(guān)系[1,2]。因此，如何降低魷魚(yú)中AGEs含量成為當(dāng)前水產(chǎn)休閑食品的研究熱點(diǎn)。

腌制和烘干是香鹵魷魚(yú)加工必備環(huán)節(jié)。受腌制輔料中糖及魷魚(yú)天然蛋白均含量較高的影響，更容易在腌制和烘干過(guò)程中產(chǎn)生AGEs，進(jìn)而給產(chǎn)品帶來(lái)食用安全隱患。目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者針對(duì)AGEs的生成，主要通過(guò)在食品加工中添加必要輔料來(lái)抑制其生成。翁婷[3](2020)等發(fā)現(xiàn)在餅干中添加L-半胱氨酸鹽可有效降低AGEs的生成；夏其樂(lè)[4](2018)等則發(fā)現(xiàn)楊梅多酚可抑制AGEs的產(chǎn)生；吳光杰[5](2007)等則發(fā)現(xiàn)以烏骨雞為原料制備的烏骨雞活性肽對(duì)AGEs的生成反應(yīng)具有較好的抑制效果。但總體而言，國(guó)內(nèi)外已有的關(guān)于AGEs的抑制研究成果中采用的AGEs抑制劑存在成本高、有異味及不符合現(xiàn)行食品添加劑標(biāo)準(zhǔn)等問(wèn)題。因此，基于現(xiàn)有食品加工標(biāo)準(zhǔn)，本文以赤道魷魚(yú)為原料，以紅曲米粉這類(lèi)傳統(tǒng)調(diào)味料為研究對(duì)象，探討了紅曲米粉對(duì)香鹵魷魚(yú)中AGEs的生成抑制效果，以期尋找一種切合生產(chǎn)實(shí)際的方法，為提高魷魚(yú)這類(lèi)大宗休閑食品的安全性提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

紅曲米粉及魷魚(yú)(冰鮮)，購(gòu)于舟山臨城華潤(rùn)萬(wàn)家超市；

商品腌制液，由舟山漁業(yè)公司提供；

鄰苯二胺(o-Phenylenediamine，OPD)、濃鹽酸、三氯乙酸、氫氧化鈉等試劑購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑有限公司，分析純(批號(hào)：210505，220610，220410，210924)；

AGEs標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)：220123)，購(gòu)于上海心語(yǔ)生物科技有限公司；

5-羧甲基糠醛(5-Methylfurfural，HMF)、乙二醛(Glyoxal，GO)、丙酮醛(Methylglyoxal，MGO)等購(gòu)于北京百靈威科技有限公司(批號(hào)：220112，220328，220426)；

高速組織搗碎機(jī)(BILON-DFT-200A，上海比朗)；

真空干燥箱(DZF-6050，上海精宏公司)；

高效液相色譜(1290 Infinity II，美國(guó)安捷倫公司)；

色譜柱(ZORBAX SB C18，4.6×250mm,5μm，美國(guó)安捷倫公司)；

色差儀(YS3060，深圳市三恩時(shí)科技有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 香鹵魷魚(yú)

香鹵魷魚(yú)按中國(guó)水產(chǎn)舟山漁業(yè)公司休閑食品加工廠工藝，具體操作為：魷魚(yú)剝皮后清水洗滌至無(wú)墨水，浸入到舟山漁業(yè)公司提供的腌漬調(diào)味液中浸漬2h(浸漬液溫度60℃)，取出瀝干后于80℃條件烘干3h，即為香鹵魷魚(yú)。浸漬時(shí)分別添加不同紅曲米粉(紅曲米粉經(jīng)粉碎機(jī)處理后，過(guò)100目篩)，紅曲米粉在浸漬液中濃度分別為0%、0.25%、0.50%、0.75%和1.0%。

1.2.2 魷魚(yú)色度測(cè)定

烘干后的魷魚(yú)冷量后，采用色差儀測(cè)定其亮度(L*)、紅度(a*)和黃度(b*)，每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.2.3 HMF測(cè)定

精確稱(chēng)取10g香鹵魷魚(yú)，組織粉碎機(jī)粉碎后取1.0g肉泥轉(zhuǎn)移至盛有20mL蒸餾水的三角瓶中，震蕩均勻后于12 000r/min離心10min，收集上清液，而后再加入20mL蒸餾水重復(fù)離心，重復(fù)收集并合并上清液，0.22μm膜過(guò)濾后進(jìn)行高效液相色譜分析；液相色譜條件為：5%甲醇溶液洗脫30min，進(jìn)樣量20μL，洗脫流速1.0mL/min，柱溫35℃[6]。

1.2.4 GO與MGO測(cè)定

GO與MGO的前處理同HMF。精確量取0.1mL OPD溶液(1.08g OPD溶于10mL甲醇，震蕩混合)，與1mL所得上清液混合，震蕩均勻后置于60℃水浴鍋中避光保溫24h，而后混合液經(jīng)0.22μm膜過(guò)濾后進(jìn)行高效液相色譜分析。液相色譜條件為：采用甲醇梯度洗脫，0～15min(30%～44%)，15～30min(45%～74%)，30～45min(75%)，進(jìn)樣量50μL，洗脫流速1.0mL/min，柱溫35℃[7]。

1.2.5 熒光AGEs測(cè)定

稱(chēng)取10g香鹵魷魚(yú)，組織粉碎后稱(chēng)取1.0g肉泥轉(zhuǎn)移至10mL蒸餾水中，超聲處理15min(超聲功率1 000w)，而后于12 000r/min離心20min，取上清液，經(jīng)0.22μm膜過(guò)濾后重新定容到10mL。再精確量取0.1mL定容液，轉(zhuǎn)移到帶孔黑色平板，并在特定波長(zhǎng)(325/440)下檢測(cè)熒光AGEs[4]。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，運(yùn)用SPSS17.0進(jìn)行顯著性分析，并使用Duncan進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)(p<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅曲米粉對(duì)香鹵魷魚(yú)色度的影響

魷魚(yú)的色澤是影響其商品價(jià)值的重要因素。在腌漬液中添加不同用量的紅曲米粉對(duì)香鹵魷魚(yú)色度的影響見(jiàn)表1和圖1。

表1 不同紅曲米粉對(duì)香鹵魷魚(yú)色度的影響

由表1可以看出，隨著添加量的增大，各組的亮度也隨之增大，但總體增幅較?。欢t度是判斷物體紅綠的指標(biāo)，數(shù)值越大則越偏向紅色。從表1可知，各組的紅度變化極為明顯，1.0%組的紅度達(dá)到26.2，顯著高于其他各組(p<0.01)，這一結(jié)果與圖1對(duì)應(yīng)；而黃度總體變化不大，僅空白組(未添加紅曲米粉)與其他組存在顯著差異(p<0.05)，表明添加紅曲米粉對(duì)魷魚(yú)的色澤有顯著影響。

圖1 不同處理后的香鹵魷魚(yú)色澤(A.0%；B.0.25%；C.0.5%；D.0.75%)

由圖1可知，添加紅曲米粉后，不同劑量的香鹵魷魚(yú)色澤逐漸加深，添加量越大則色澤也越深，其中紅曲米粉添加量1.0%組的魷魚(yú)色澤過(guò)深，且產(chǎn)品外觀偏紅，與產(chǎn)品特征不符，這一組后續(xù)研究中舍棄；而添加量為0.5%的香鹵魷魚(yú)色澤最為誘人。

2.2 紅曲米粉對(duì)香鹵魷魚(yú)HMF的影響

HMF是食品加熱過(guò)程中極易產(chǎn)生的有害物質(zhì)，富含蛋白質(zhì)和還原糖的食品更易產(chǎn)生[8]。圖2是不同紅曲米粉用量對(duì)香鹵魷魚(yú)中HMF含量的影響。

圖2 紅曲米粉添加量對(duì)香鹵魷魚(yú)中HMF的影響

從圖2中可以看出，空白組(0.0%)中HMF含量達(dá)到0.26g/kg，在所有實(shí)驗(yàn)組中含量最高，而紅曲米粉的加入會(huì)降低產(chǎn)品中HMF的含量，表明紅曲米粉具有抑制HMF生成的效果。此外，紅曲米粉對(duì)HMF的抑制效果同添加量呈正相關(guān)，添加量越大，抑制效果越好，但在高劑量條件下(0.50%和0.75%)抑制效果的增加不明顯(p>0.05)。紅曲米是以大米或糯米為原料，經(jīng)紅酵母發(fā)酵制成。紅曲米中富含多種氨基酸，對(duì)人體具有多種生理功效。HMF是美拉德反應(yīng)的產(chǎn)物之一，HMF可以與部分含有巰基的氨基酸通過(guò)Michael加成反應(yīng)結(jié)合，使得HMF由對(duì)人體有害的游離態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)閷?duì)人體無(wú)害的結(jié)合態(tài)；而紅曲米中的蛋白質(zhì)經(jīng)酵母降解后，會(huì)產(chǎn)生部分含有巰基的氨基酸，這可能是紅曲米粉具有降低香鹵魷魚(yú)中HMF含量的原因。

2.3 紅曲米粉對(duì)香鹵魷魚(yú)中GO與MGO的影響

GO與MGO等均為羰基化合物，主要來(lái)源于美拉德反應(yīng)及糖和蛋白質(zhì)的氧化分解，不僅對(duì)人體有害，而且也是AGEs的前體物質(zhì)，可以與蛋白質(zhì)反應(yīng)形成AGEs[9]。表2是不同添加量紅曲米粉對(duì)香鹵魷魚(yú)中GO和MGO的影響。

表2 不同紅曲米粉對(duì)香鹵魷魚(yú)中GO、MGO的影響

從表2中可以看出，同對(duì)照組相比，紅曲米粉添加組中GO和MGO含量顯著低于對(duì)照組(p<0.05)，各添加組之間又呈現(xiàn)一定的劑量效應(yīng)(除0.50%和0.75%，GO)，表明紅曲米粉可有效降低GO和MGO的含量；但同HMF類(lèi)似，隨著添加量的增大，紅曲米粉對(duì)GO和MGO的抑制效果逐漸降低，表現(xiàn)為高劑量條件下，GO和MGO含量顯著不明顯(p>0.05)。GO和MGO是美拉德反應(yīng)的中間產(chǎn)物，能夠不可逆的修飾蛋白質(zhì)并形成AGEs，促使蛋白質(zhì)發(fā)生功能紊亂。有研究表明：多酚類(lèi)物質(zhì)可有效清除這兩類(lèi)物質(zhì)，進(jìn)而能夠抑制AGEs的產(chǎn)生[10～12]。紅曲米粉具有降血脂、降血壓等多種生理工效，主要是其含有的紅曲霉衍生物具備強(qiáng)大的抗氧化特性。張紅林[13](2018)等從古田紅曲米中分離得到亞油酸、亞麻酸，證實(shí)這兩種脂肪酸是古田紅曲米抗氧化特性的主要成分；而胡均亮[14](2017)則發(fā)現(xiàn)普通紅曲米中多酚類(lèi)物質(zhì)是其抗氧化活性的主要貢獻(xiàn)成分，主要包括沒(méi)食子酸、綠原酸。本研究中采用的紅曲米粉同屬普通紅曲米，因此推測(cè)其降低GO和MGO的功效同茶多酚等類(lèi)似，均通過(guò)與GO和MGO的結(jié)合來(lái)降低這兩類(lèi)有害物質(zhì)含量。

2.4 紅曲米粉對(duì)香鹵魷魚(yú)中AGEs的影響

不同紅曲米粉添加量對(duì)香鹵魷魚(yú)中AGEs含量的影響見(jiàn)圖3。

圖3 紅曲米粉添加量對(duì)香鹵魷魚(yú)中AGEs的影響

從圖3中可以看出，隨著紅曲米粉用量的增加，AGEs的熒光值逐漸降低。0.75%的紅曲米粉添加量對(duì)應(yīng)的熒光值比對(duì)照組低18.6%(p<0.05)，表明紅曲米粉對(duì)AGEs的形成有較好的抑制效果；同樣，0.50%的紅曲米粉添加量也有較好的抑制效果，但與0.75%添加量之間無(wú)顯著性差異(p>0.05)。AGEs是已經(jīng)被證實(shí)的對(duì)人體有害的物質(zhì)，其生成途徑較為復(fù)雜，通常認(rèn)為與美拉德反應(yīng)有關(guān)。從前述結(jié)果來(lái)看，紅曲米粉對(duì)HMF、GO及MGO等都有一定的抑制效果，通過(guò)抑制的累加，最終對(duì)AGEs的形成起到了較為明顯抑制。夏其樂(lè)[4](2018)等研究了楊梅多酚提取物對(duì)AGEs的體外抑制效果，發(fā)現(xiàn)濃度為100μg/mL的楊梅多酚提取物對(duì)AGEs的抑制率達(dá)97.6%，是通過(guò)清除AGEs形成的中間體(羥自由基、乙二醛等)來(lái)保護(hù)蛋白質(zhì)，減少蛋白質(zhì)交聯(lián)，最終抑制AGEs的生成。張朝紅[15](2014)等也研究了桑葚花色苷對(duì)AGEs的抑制效果，其抑制濃度也達(dá)到毫克級(jí)別。與這些已有成果不同的是，本研究中紅曲米粉用量較大，達(dá)到克的級(jí)別，而對(duì)AGEs的抑制效果確相對(duì)較弱。這主要是由于本研究未對(duì)紅曲米中的有效成份進(jìn)行提取所導(dǎo)致的；另外，從生產(chǎn)實(shí)際出發(fā)，對(duì)紅曲米中AGEs抑制因子的提取需要較多成本，而單純提高紅曲米用量，又會(huì)對(duì)香鹵魷魚(yú)色澤產(chǎn)生巨大影響。綜合考慮后，確定紅曲米粉的添加量為0.50%為宜。

3 結(jié)論

在香鹵魷魚(yú)腌制過(guò)程中加入適量紅曲米粉具有改善產(chǎn)品外觀色澤和抑制HMF、GO、MGO和AGEs生成的多種功效。其中，紅曲米粉對(duì)多種有害因子的抑制效果呈現(xiàn)一定的劑量效應(yīng)，但在高劑量條件下抑制效果無(wú)顯著差異；紅曲米粉對(duì)HMF等有害因子的抑制可能是通過(guò)紅曲米粉中含有的沒(méi)食子酸、綠原酸等酚類(lèi)物質(zhì)有關(guān)，這些物質(zhì)可與GO等AGEs的前體物質(zhì)結(jié)合，進(jìn)而減少AGEs的形成。從實(shí)際生產(chǎn)角度出發(fā)，綜合確定香鹵魷魚(yú)中紅曲米粉的添加量為0.50%，該添加量能夠有效降低晚期糖基終產(chǎn)物等有害因子含量，同時(shí)在成本上也較為經(jīng)濟(jì)。