胡 蝶，董 騰，薛雅文，寇曉萌，郭佳琳，王 靜，姬 華

（石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆 石河子 832000）

紅棗營養(yǎng)豐富、香甜可口、皮薄肉多，有“樹上糧食”之稱[1]，具有非常高的經(jīng)濟價值和藥用價值[2]。但紅棗成熟比較集中，由于含有大量的水分和豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，極易感染病菌而發(fā)生霉變、腐爛降低品質(zhì)，造成較大的資源浪費、環(huán)境污染和經(jīng)濟損失[3]。黑曲霉和黃曲霉是引起紅棗腐敗變質(zhì)的主要致病霉菌, 對紅棗品質(zhì)及可食用性造成極大的危害。因此，篩選安全、有效的防治措施來控制紅棗采后腐爛病的發(fā)生具有重大的意義。主要研究乳酸鏈球菌素、單寧、殼聚糖、山梨酸鉀、納他霉素、薄荷精油、百里香精油對分離自紅棗的黃曲霉和黑曲霉的抑菌作用。通過抑菌試驗，分析抑制劑對黑曲霉和黃曲霉的抑菌特性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃曲霉 （Aspergillus flavus） 和黑曲霉 （Aspergillus niger） 各1 株，為前期從腐敗紅棗中分離、篩選并鑒定后保存的菌株，保存于-80 ℃冰箱中；乳酸鏈球菌素，洛陽奇泓科技有限公司提供；山梨酸鉀，杭州保圣配料有限公司提供；納他霉素、單寧、殼聚糖、薄荷精油、百里香精油，上海麥克林生化科技有限公司提供。

1.2 儀器與設(shè)備

ZXSD-1160 型全自動生化培養(yǎng)箱，上海智誠儀器有限公司產(chǎn)品；LDZX-30KBS 型立式高壓蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠產(chǎn)品；IX71 型倒置熒光顯微鏡，日本奧林巴斯公司產(chǎn)品；DK-8D 型恒溫水浴鍋，江蘇金壇儀器有限公司產(chǎn)品；995 型超低溫冰箱，美國賽默飛世爾公司產(chǎn)品。

1.3 試驗方法

1.3.1 孢子液的制備

采用Wang L 等人[4]的方法將黑曲霉和黃曲霉活化后在馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA） 培養(yǎng)基上于25 ℃條件下培養(yǎng)7 d，加入0.05%吐溫80 的無菌水，并在培養(yǎng)基表面輕輕攪動，過濾后制成孢子液，用血球計數(shù)板計數(shù)，孢子濃度調(diào)整到106個/ mL，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3.2 牛津杯法

取100 μL 孢子懸浮液，在已滅菌的PDA 培養(yǎng)基上均勻涂布后，放置牛津杯。將乳酸鏈球菌素、單寧、殼聚糖、山梨酸鉀、納他霉素、薄荷精油和百里香精油分別配成1 000 mg/L 和1 000 μL/L 的溶液，溶劑為無水乙醇。取200 μL 配好的溶液加入每個牛津杯中[5]，于28 ℃下培養(yǎng)72 h，測量抑菌圈的直徑，重復(fù)3 次。

1.3.3 最小抑菌濃度的測定

采用瓊脂稀釋法[6]，用無水乙醇將每種抑菌劑稀釋，分別吸取不同量稀釋液加入到已滅菌的冷卻至50 ℃的19 mL PDA 培養(yǎng)基中，制備成帶有不同濃度抑菌劑的培養(yǎng)基，乳酸鏈球菌素的終質(zhì)量濃度為10，50，100，500，1 000 mg/L，薄荷精油和百里香精油的終體積濃度為10，50，100，500，1 000 μL/L，山梨酸鉀、殼聚糖和單寧的終質(zhì)量濃度為1 000，2 000，4 000，8 000，10 000 mg/L，納他霉素的終質(zhì)量濃度為3，4，5，6，7 mg/L，對照組為培養(yǎng)基和無水乙醇，及培養(yǎng)基和抑菌劑。取孢子懸浮液100 μL于平板表面，涂布均勻后，保鮮膜密封，于28 ℃下培養(yǎng)觀察48 h，以完全沒有菌生長的最小濃度作為該抑菌劑的最小抑菌質(zhì)量濃度（MIC）。每個處理重復(fù)3 次。

1.3.4 菌絲生長直徑的測定

在PDA 培養(yǎng)基中分別加入不同量的抑菌劑，使納他霉素的質(zhì)量濃度分別為1，2，3，4，5 mg/L。然后，將100 μL 黑曲霉和黃曲霉的孢子懸浮液接種于PDA 培養(yǎng)基中心，以溶劑為對照。于28 ℃下培養(yǎng)，用十字交叉法測量菌落直徑，每12 h 測1 次，設(shè) 3 個平行試驗[7]。

1.3.5 孢子萌發(fā)抑制率的測定

在馬鈴薯葡萄糖水培養(yǎng)基中分別加入不同量的抑菌劑，使納他霉素的質(zhì)量濃度分別為1，2，3，4，5，6 mg/L。然后將100 μL 黑曲霉和黃曲霉的孢子懸浮液接種于試管中，于28 ℃下培養(yǎng)觀察，以溶劑為對照。直到對照的萌發(fā)率達到95%以上，每個試管隨機觀察100 個孢子，統(tǒng)計孢子萌發(fā)數(shù)，以芽管長度超過孢子最大直徑的一半作為萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)，按公式計算萌發(fā)抑制率[8]。

1.3.6 菌絲形態(tài)的觀察

在PDA 培養(yǎng)基中加入不同量的抑菌劑，使納他霉素質(zhì)量濃度為1 MIC（6 mg/L） 和2 MIC（12 mg/L），接入100 μL 黃曲霉和黑曲霉的孢子液，并設(shè)置空白對照組。取滅菌載玻片，斜插于培養(yǎng)基內(nèi)。于28 ℃下培養(yǎng)7 d，取出用倒置顯微鏡觀察。

1.3.7 紅棗果實的影響

挑選無損傷、大小顏色一致的新鮮紅棗，隨機分成3 組，每組5 個果實。在其表面噴灑75%的酒精進行消毒殺菌。然后用無菌水沖洗后，晾干。用滅過菌的打孔器在紅棗的中部打孔，直徑為3 cm，深度為3 cm。接種100 μL 孢子懸浮液，其中一組噴灑6 mg/L（MIC） 的納他霉素，另一組噴灑5 mg/L（MIC） 的乳酸鏈球菌素。接種后置于塑料盒中，用無菌袋密封，于28 ℃下培養(yǎng)7 d，統(tǒng)計紅棗果實的發(fā)病率。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2019 進行統(tǒng)計分析，得到的結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差，利用Origin 2019進行制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 抑菌圈大小

抑菌劑對黑曲霉和黃曲霉的抑菌效果見表1。

表1 抑菌劑對黑曲霉和黃曲霉的抑菌效果/mm

由表1 可知，乳酸鏈球菌素和納他霉素對紅棗中黑曲霉和黃曲霉具有明顯的抑菌特性，單寧、殼聚糖、山梨酸鉀對黑曲霉和黃曲霉無明顯抑菌特性，薄荷精油和百里香精油有一定的抑菌性。抑菌圈的直徑越大，說明其抑菌效果越好。納他霉素對黃曲霉和黑曲霉的抑菌圈直徑均大于20 mm，表現(xiàn)出高敏感性，乳酸鏈球菌素對黑曲霉的抑菌作用優(yōu)于黃曲霉。

2.2 最小抑菌質(zhì)量濃度

抑菌劑對黑曲霉和黃曲霉的最小抑菌濃度見表2。

表2 抑菌劑對黑曲霉和黃曲霉的最小抑菌濃度

由表2 可知，最小抑菌濃度為山梨酸鉀＞乳酸鏈球菌素＞納他霉素，納他霉素的抑菌效果表現(xiàn)最好。乳酸鏈球菌素對黑曲霉和黃曲霉的最小抑菌質(zhì)量濃度分別為1 000 mg/L 和500 mg/L，納他霉素對黑曲霉和黃曲霉的最小抑菌質(zhì)量濃度分別為5 mg/L和6 mg/L，山梨酸鉀對黑曲霉和黃曲霉的最小抑菌質(zhì)量濃度均為8 000 mg/L，薄荷精油和百里香精油對黑曲霉和黃曲霉的最小抑菌體積濃度同為1 000 μL/L。單寧和殼聚糖在10 000 mg/L 時仍有菌落生長，未測出最小抑菌質(zhì)量濃度。

百里香精油[9]對火龍果中的致病菌層生鐮刀菌和平頭炭疽菌的最小抑菌體積濃度為1 000 μL/L，表現(xiàn)出較強的抑菌性。百里香精油和薄荷精油[10]對獼猴桃中致病菌尖孢炭疽菌和葡萄座腔菌的最小抑菌體積濃度分別為5 000 μL/L 和25 000 μL/L，薄荷精油對葡萄座腔菌有一定的抑菌性，但抑菌濃度相比其他精油較高。500 μL/L 的薄荷精油[11]對鏈格孢霉菌絲生長和孢子萌發(fā)都有較高的抑制作用。納他霉素[5]對柑橘中意大利青霉和指狀青霉都有極強的抑制性，濃度越高，抑菌作用越明顯，兩者的最小抑菌質(zhì)量濃度均為6 mg/L。

2.3 納他霉素對黃曲霉和黑曲霉菌絲生長的抑制作用

不同質(zhì)量濃度納他霉素對黃曲霉和黑曲霉菌絲的抑制作用見圖1。

由圖1 可知，隨著納他霉素質(zhì)量濃度越來越大，對紅棗中黑曲霉和黃曲霉菌絲生長的抑制作用逐漸增強。且隨著時間的增加，仍對黑曲霉和黃曲霉菌絲生長有明顯的抑制效果。低濃度的納他霉素對黑曲霉的抑菌效果優(yōu)于黃曲霉。當(dāng)納他霉素質(zhì)量濃度為5 mg/L時，黑曲霉在第2 天沒有生長。培養(yǎng)7 d 后，菌絲快速生長，黑曲霉和黃曲霉基本都達到最大直徑。

圖1 不同質(zhì)量濃度納他霉素對黃曲霉和黑曲霉菌絲的抑制作用

2.4 納他霉素對黃曲霉和黑曲霉孢子萌發(fā)的抑制作用

納他霉素對黃曲霉和黑曲霉孢子萌發(fā)抑制率見圖2。

由圖2 可知，隨著納他霉素質(zhì)量濃度的增高，黃曲霉孢子萌發(fā)受到明顯抑制，在納他霉素質(zhì)量濃度6 mg/L 時，黃曲霉和黑曲霉的孢子萌發(fā)抑制率均大于90%，且對黑曲霉的抑制效果優(yōu)于黃曲霉。孢子是真菌存在和傳播的重要結(jié)構(gòu)，納他霉素可以顯著抑制黑曲霉和黃曲霉的孢子萌發(fā)，從而抑制其生長繁殖。

圖2 納他霉素對黃曲霉和黑曲霉孢子萌發(fā)抑制率

2.5 納他霉素對黃曲霉和黑曲霉菌絲形態(tài)的影響

納他霉素對黃曲霉和黑曲霉菌絲的影響見圖3。

圖3 納他霉素對黃曲霉和黑曲霉菌絲的影響

抑菌活性物質(zhì)在霉菌的生長過程中，能夠改變菌絲形態(tài)，并且造成菌絲畸形，嚴(yán)重可以導(dǎo)致菌絲斷裂，從而阻礙菌絲的正常生長。由圖3 可知，納他霉素對黃曲霉和黑曲霉菌絲生長形態(tài)存在嚴(yán)重的影響，對照組菌絲光滑順直，結(jié)構(gòu)完整，形態(tài)規(guī)則，隔膜明顯（圖3 A，D）。而經(jīng)過6 mg/L 和12 mg/L納他霉素處理的菌絲發(fā)生了多種形態(tài)變化，菌絲表面粗糙，部分出現(xiàn)皺縮變形，并且出現(xiàn)膨大凸起（圖3 B，E）。相比之下，12 mg/L 處理組的菌絲形態(tài)變化更為劇烈，菌絲表面出現(xiàn)嚴(yán)重褶皺，膨大凸起，整體扭曲變形嚴(yán)重，從而使細胞內(nèi)容物質(zhì)泄漏（圖3 C，F(xiàn)）?？煽闯?，納他霉素處理對黃曲霉和黑曲霉菌絲有損傷作用。

2.6 納他霉素和乳酸鏈球菌素在紅棗中的應(yīng)用

納他霉素和乳酸鏈球菌素對紅棗的抑菌作用見圖4。

圖4 納他霉素和乳酸鏈球菌素對紅棗的抑菌作用

紅棗未噴灑藥劑，有3 個生霉，發(fā)病率為60%，經(jīng)過納他霉素和乳酸鏈球菌素的噴灑，霉菌未能在紅棗上生長，且不影響紅棗的品質(zhì)。因此，可以將納他霉素和乳酸鏈球菌素應(yīng)用于紅棗采后保鮮中。

3 結(jié)論

試驗通過篩選抑制劑，研究不同抑菌劑對紅棗中黑曲霉和黃曲霉的抑菌特性。納他霉素對抑制黃曲霉和黑曲霉菌絲生長和孢子萌發(fā)都有明顯效果。研究發(fā)現(xiàn)，納他霉素對黃曲霉和黑曲霉抑菌效果最好，其次是乳酸鏈球菌素，試驗還表明薄荷精油和百里香精油對黑曲霉和黃曲霉有一定抑制效果，山梨酸鉀的抑菌性較差。

目前，國內(nèi)在黑曲霉和黃曲霉抑菌劑的研究中，對黑曲霉和黃曲霉都有抑菌效果的還有丁香精油[12]、乳酸菌素[13]，對黑曲霉有抑菌效果的還有燕麥中β -葡聚糖、多酚及黃酮[14]、短波紫外線[15]、氣態(tài)植物精油，對黃曲霉有抑菌效果的還有八角茴香[12]、豬毛蒿精油及其活性成分萜品- 4 - 醇。一氧化氮熏蒸可抑制灰棗的黑曲霉病，結(jié)果表明一氧化氮可顯著抑制黑曲霉的生長，延緩了灰棗果實含水率、可溶性固形物、還原糖、可滴定酸和維C 含量的下降，保持果實品質(zhì)。國外對紅棗抑菌的研究中，發(fā)現(xiàn)殼聚糖降低了擴展青霉引起的紅棗青霉病的發(fā)生[4]，納他霉素和殼聚糖的協(xié)同作用，可以防治鏈格孢霉引起的紅棗黑斑??；百里香精油具有抗真菌活性，可延長紅棗的貯藏期。

紅棗霉變主要是由于受濕度和溫度的影響。紅棗過干或者過濕都會影響其口感。在紅棗水分活度一定的情況下，適當(dāng)?shù)夭捎眉t棗保鮮劑與抑菌劑有助于提高紅棗的保質(zhì)期和商品率。納他霉素能夠很好地抑制紅棗中黃曲霉和黑曲霉的生長，可以用于紅棗采后保鮮與病害防治。還可以研究復(fù)配抑菌劑，綜合利用每種抑菌劑的抑菌譜，合理使用抑菌劑含量，達到最好的抑菌特性。研究為紅棗采后、保藏、運輸、銷售的防治腐敗變質(zhì)提供理論依據(jù)。