王乾 黃晨 黃廷銳 孫攀 趙永見,3 施杞,3 王擁軍,3 唐德志,3*

1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院，上海 200032 2.上海中醫(yī)藥大學(xué)脊柱病研究所，上海 200032 3.教育部筋骨理論與治法重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200032

隨著我國交通事業(yè)的蓬勃發(fā)展，交通事故引起的創(chuàng)傷性骨折患者發(fā)病率逐年增高，由于交通事故通常暴力巨大，常導(dǎo)致骨不連和骨缺損等并發(fā)癥[1-3]。這嚴(yán)重影響著患者的肢體功能和術(shù)后康復(fù)。如何提高患者的治愈率，改善患者的功能，成為每位骨科醫(yī)師必須思考的問題。肌肉干細(xì)胞作為間充質(zhì)干細(xì)胞的一員，由于來源廣泛，易于取材且在一定條件下可向成骨細(xì)胞分化，因此逐漸成為骨組織工程研究極具潛力的種子細(xì)胞[4-5]。組蛋白甲基化作為組蛋白密碼的重要組成部分，深刻影響著表觀遺傳學(xué)的調(diào)控[6-7]。而目前組蛋白甲基化酶SUV39H1對(duì)成肌細(xì)胞成骨分化影響的機(jī)制尚不明確。本實(shí)驗(yàn)將含有小鼠SUV39H1基因的慢病毒感染C2C12細(xì)胞，旨在探討外源性SUV39H1基因?qū)MP2誘導(dǎo)的C2C12細(xì)胞成骨分化的影響，從而為進(jìn)一步闡明SUV39H1調(diào)節(jié)成肌細(xì)胞成骨分化機(jī)制以及C2C12成肌細(xì)胞為代表的種子細(xì)胞早日在體內(nèi)應(yīng)用提供理論與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

實(shí)驗(yàn)細(xì)胞采用C2C12細(xì)胞，購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。

1.2 主要試劑與儀器

DMEM高糖培養(yǎng)基購自Hyclone公司；Recombinant Human/Mouse/Rat BMP-2購自蘇州近岸蛋白質(zhì)公司；SUV39H1過表達(dá)慢病毒及GFP對(duì)照慢病毒購自吉滿生物科技公司；總RNA提取，反轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購自EZBioscience公司；Western blot裂解液、BCA蛋白定量試劑盒及茜素紅S試劑盒購自上海碧云天公司；BCIP/NBT堿性磷酸酶顯色試劑盒，Runx2、ALP、H3、SUV39H1、GAPDH一抗購自CST公司；H3K9me3一抗購自Abcam抗體公司；相關(guān)二抗購自CST公司；PCR引物由上海華大基因合成。具體引物序列見表1。

表1 Real-Time PCR 引物序列Table 1 Primer sequences for real-time PCR

1.3 成骨誘導(dǎo)液配置

C2C12細(xì)胞采用DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，其內(nèi)含有體積分?jǐn)?shù)為5 %的胎牛血清，1 %的青霉素和鏈霉素。隨后50 mL培養(yǎng)基內(nèi)加入5 μg重組骨形態(tài)發(fā)生蛋白2，確保最終成骨誘導(dǎo)液最終濃度為100 ng/mL。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1SUV39H1過表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)株的構(gòu)建與篩選：實(shí)驗(yàn)首日取對(duì)數(shù)生長期的C2C12細(xì)胞均勻接種于24孔板內(nèi)，采用常規(guī)培養(yǎng)方法培養(yǎng)。第二日取出-80 ℃凍存的慢病毒懸液，待病毒液冰浴融化后按照感染復(fù)數(shù)為50(MOI=50)加入SUV39H1過表達(dá)慢病毒及帶有GFP的對(duì)照慢病毒。感染病毒24 h后，加入2.5 μg/mL的嘌呤霉素進(jìn)行抗性篩選。連續(xù)進(jìn)行6 d的抗性篩選，隨后倒置熒光顯微鏡下觀察感染效率。

1.4.2SUV39H1過表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)株的鑒定：將抗性篩選6 d后的SUV39H1過表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)株和GFP陰性對(duì)照組分別進(jìn)行qRT-PCR實(shí)驗(yàn)和Western blot實(shí)驗(yàn)在基因和蛋白表達(dá)層面進(jìn)行驗(yàn)證。

1.4.3成骨分化誘導(dǎo)：將胰酶消化好的對(duì)數(shù)生長期的C2C12過表達(dá)細(xì)胞和帶有GFP的對(duì)照細(xì)胞，用新鮮培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為2.5×104個(gè)/mL，吸取2 mL細(xì)胞懸液接種于6孔板中，十字交叉搖勻法確保均勻接種，常規(guī)培養(yǎng)24 h。隨后棄掉培養(yǎng)液加入含有BMP2(100 ng/mL)成骨誘導(dǎo)液繼續(xù)培養(yǎng)。連續(xù)培養(yǎng)7 d后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作。

1.4.4形態(tài)學(xué)觀察：倒置熒光顯微鏡下每日觀察SUV39H1過表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)株的生長及誘導(dǎo)情況。

1.4.5堿性磷酸酶染色：C2C12細(xì)胞成骨誘導(dǎo)7 d后，棄掉6孔板中的培養(yǎng)基，用PBS沖洗兩遍，隨后每孔加入1 mL 4 %多聚甲醛固定液固定15 min，棄掉固定液，蒸餾水沖洗兩遍后，按照堿性磷酸酶試劑說明書6孔板每孔加入1 mL染液，避光染色30 min。棄染液蒸餾水洗滌兩遍后終止染色，隨后進(jìn)行拍照。

1.4.6茜素紅染色：C2C12細(xì)胞成骨誘導(dǎo)12 d后，棄掉6孔板中的培養(yǎng)基，用PBS沖洗兩遍，隨后每孔加入1 mL 4 %多聚甲醛固定液固定15 min，棄掉固定液，蒸餾水沖洗兩遍后,按照茜素紅試劑說明書6孔板每孔加入1 mL染液，避光染色30 min。棄染液蒸餾水洗滌兩遍后終止染色，隨后進(jìn)行拍照。

1.4.7qRT-PCR檢測成骨相關(guān)基因的表達(dá)情況：C2C12細(xì)胞成骨誘導(dǎo)7 d后，棄掉培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS洗滌兩遍后，根據(jù)EZBioscience 總RNA提取試劑盒說明書提取RNA，測定RNA濃度并監(jiān)測提取RNA的質(zhì)量是否符合進(jìn)行下一步反轉(zhuǎn)錄的要求。將符合要求的RNA按照1 μg/20 μL 的體系采用EZBioscience反轉(zhuǎn)錄試劑盒將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為模板，GAPDH為內(nèi)參，按照EZBioscience實(shí)時(shí)熒光定量檢測試劑盒說明書進(jìn)行擴(kuò)增。采用2-△△ct法計(jì)算SUV39H1過表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)株Runx2、ALP、OPN、OCN、MYOD的mRNA相對(duì)表達(dá)量水平。表1為擴(kuò)增所需引物，PCR反應(yīng)條件為：第1步，95 ℃ 5 min；第2步，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。

1.4.8免疫熒光檢測RUNX2蛋白表達(dá)情況：將C2C12細(xì)胞過表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)株和GFP對(duì)照組按照2 000個(gè)細(xì)胞/孔的密度均勻接種于24孔板內(nèi)，待細(xì)胞貼壁后加入成骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo)培養(yǎng)。培養(yǎng)5 d后，用4 %的多聚甲醛進(jìn)行固定20 min，棄固定液，PBS搖床洗3遍，每次5 min。隨后加入0.3 %的Triton X100通透液透膜，PBS搖床洗3遍，每次5 min。封閉液室溫封閉1 h，隨后加入Runx2一抗4 ℃孵育過夜，孵抗兔二抗1 h，倒置熒光顯微鏡下拍照觀察。

1.4.9蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測成骨相關(guān)蛋白表達(dá)：C2C12細(xì)胞成骨誘導(dǎo)7 d后，棄掉培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS洗滌兩遍后，根據(jù)總蛋白提取試劑盒說明書和核蛋白提取試劑盒說明書，6孔板中加入蛋白裂解液提取總蛋白和核蛋白。隨后用BCA蛋白濃度檢測試劑盒測定蛋白濃度，按照20 μg/20 μL的上樣體系進(jìn)行蛋白配置并熱變性，隨后加入分離膠濃度為12 %的SDS-PAGE中，80～100V電泳。濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至0.22 μm的PVDF膜上，采用快速封閉液室溫封閉15 min，隨后加入抗Runx2、ALP、H3K9me3、H3、GAPDH的一抗(Runx2、ALP、H3K9me3和GAPDH按照1∶1 000比例稀釋；H3按照1∶2 000稀釋)，4 ℃反應(yīng)過夜，隨后用TBST洗膜5 min1次，連續(xù)6次，加入偶聯(lián)HRP的山羊抗兔二抗(按照1∶1 000比例稀釋)室溫孵育1 h，隨后TBST繼續(xù)洗膜6次每次5 min。隨后用ECL顯影液曝光拍照。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)及轉(zhuǎn)染效率觀察

倒置相差顯微鏡下，SUV39H1轉(zhuǎn)染的C2C12細(xì)胞和帶有GFP的對(duì)照組細(xì)胞在形態(tài)上沒有發(fā)現(xiàn)明顯差異，細(xì)胞均表現(xiàn)為呈梭型。在綠色激發(fā)光下，SUV39H1過表達(dá)組和GFP對(duì)照組均呈現(xiàn)綠色。這說明C2C12細(xì)胞慢病毒轉(zhuǎn)染效率較高，見圖1。

圖1 C2C12細(xì)胞SUV39H1轉(zhuǎn)染后細(xì)胞形態(tài)及轉(zhuǎn)染效率觀察Fig.1 Observation of cell morphology and transfection efficiency of C2C12 cells after SUV39H1 transfection

2.2 C2C12細(xì)胞SUV39H1過表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)株鑒定情況

為了驗(yàn)證C2C12細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)株的表達(dá)情況，我們首先進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)SUV39H1過表達(dá)組較對(duì)照組可以明顯提高SUV39H1的mRNA相對(duì)表達(dá)水平(P<0.05)。蛋白質(zhì)免疫印跡結(jié)果同樣顯示SUV39H1過表達(dá)組與對(duì)照組比較可以明顯提高SUV39H1的蛋白表達(dá)水平(P<0.05)。這說明SUV39H1過表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)株構(gòu)建成功，見圖2。

注：與SUV39H1-NC相比，**P<0.01，****P<0.0001。圖2 SUV39H1過表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)株qRT-PCR和Western blot鑒定結(jié)果Fig.2 Identification of SUV39H1 over-expression strains by qRT-PCR and Western blotting

2.3 堿性磷酸酶染色

SUV39H1過表達(dá)組細(xì)胞和對(duì)照組細(xì)胞，在BMP2(100 ng/mL)成骨誘導(dǎo)液中誘導(dǎo)7 d，ALP染色顯示，SUV39H1過表達(dá)組染色較對(duì)照組明顯減弱，見圖3。

圖3 SUV39H1過表達(dá)對(duì)BMP2誘導(dǎo)的C2C12細(xì)胞堿性磷酸酶表達(dá)的影響Fig.3 Effect of SUV39H1 over-expression on BMP2-induced alkaline phosphatase expression in C2C12 cells

2.4 茜素紅染色

SUV39H1過表達(dá)組細(xì)胞和對(duì)照組細(xì)胞，在BMP2(100 ng/mL)成骨誘導(dǎo)液中誘導(dǎo)12 d，茜素紅染色染色顯示SUV39H1過表達(dá)組鈣化結(jié)節(jié)形成量較對(duì)照組少，見圖4。

圖4 SUV39H1過表達(dá)對(duì)BMP2誘導(dǎo)的C2C12細(xì)胞鈣鹽沉積的影響Fig.4 Effect of SUV39H1 over-expression on BMP2-induced calcium salt deposition in C2C12 cells

2.5 qRT-PCR檢測成骨及成肌相關(guān)基因的表達(dá)情況

qRT-PCR結(jié)果顯示SUV39H1過表達(dá)組Runx2、OCN基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量均較對(duì)照組降低(P<0.05)，其中ALP、OPN、MYOD基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組顯著降低(P<0.01)，見表2。

表2 qRT-PCR法檢測成骨及成肌相關(guān)基因mRNA表達(dá)結(jié)果

2.6 免疫熒光檢測RUNX2蛋白表達(dá)情況

兩組細(xì)胞成骨誘導(dǎo)7 d后進(jìn)行免疫熒光檢測。檢測結(jié)果顯示SUV39H1過表達(dá)組Runx2蛋白表達(dá)熒光強(qiáng)度低于對(duì)照組(P<0.05)，見圖5。

注：與SUV39H1-NC相比，**P<0.01。圖5 兩組細(xì)胞Runx2免疫熒光及熒光強(qiáng)度分析Fig.5 Runx2 immunofluorescence and fluorescence intensity analysis of two groups of cells

2.7 蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測成骨相關(guān)蛋白表達(dá)情況

蛋白免疫印跡結(jié)果顯示，SUV39H1過表達(dá)以后成骨分化相關(guān)蛋白R(shí)unx2和ALP相對(duì)于過表達(dá)對(duì)照組表達(dá)明顯減弱，而H3K9me3表達(dá)增強(qiáng)。以上結(jié)果顯示隨著組蛋白H3的三甲基化水平增高會(huì)抑制相關(guān)成骨蛋白的表達(dá)，見圖6。

注：與 BLANK相比，*P<0.05，**P<0.01；與SUV39H1-NC相比，#P<0.05。圖6 蛋白免疫印跡法檢測成骨相關(guān)蛋白表達(dá)情況Fig.6 Protein immunoblotting for osteogenesis-related protein expressions

3 討論

既往對(duì)于骨缺損、骨不連的研究多關(guān)注自體骨移植和生物材料的應(yīng)用[8-9]，但是受制于供骨供應(yīng)不足，移植物易于感染，生物材料應(yīng)用的高失敗率等缺點(diǎn)，骨缺損和骨不連的臨床治療一直未能取得較大進(jìn)展[10]。因此尋找合適的骨組織工程干細(xì)胞種子促進(jìn)內(nèi)源性修復(fù)是一種有前途的替代方案。肌干細(xì)胞作為間充質(zhì)干細(xì)胞的一員，其成骨分化功能和治療潛質(zhì)的研究進(jìn)展讓我們看到了新的治療方向[11]。最新的研究[12-13]顯示肌源性干細(xì)胞不僅可以分化成軟骨和骨，直接參與骨折愈合，并且在骨膜損傷嚴(yán)重的情況下可以發(fā)揮更大作用。這可能是由于骨折產(chǎn)生的信號(hào)通過起旁分泌因子作用進(jìn)而促進(jìn)肌源性干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化[14]。肌肉不僅可以促進(jìn)骨折端血管重建、提供骨生長因子來源、甚至本身可作為干細(xì)胞的來源潛在地影響骨折愈合[15]。相反通過A型肉毒毒素引起股四頭肌短期萎縮則可以導(dǎo)致大鼠股骨骨折愈合不良情況的出現(xiàn)[16]。鑒于肌肉在骨折愈合中發(fā)揮著重要作用，我們可以形容肌肉是骨折愈合中的第二層骨膜。因此，促進(jìn)肌源性干細(xì)胞的成骨分化是治療骨折愈合不良的潛在方向。

SUV39H1作為組蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶，能夠三甲基化修飾組蛋白H3第9位的賴氨酸殘基(H3K9me3)，使目的基因的啟動(dòng)子處于緊密折疊的狀態(tài)，從而不利于目的基因與轉(zhuǎn)錄因子、RNA聚合酶接觸，引起被修飾基因的轉(zhuǎn)錄沉默，常與異染色質(zhì)形成有關(guān)[6,17]。組蛋白甲基化酶SUV39H1在成肌分化及癌癥領(lǐng)域的作用研究已經(jīng)相當(dāng)深入。組蛋白H3甲基轉(zhuǎn)移酶SUV39H1可以通過降低C2C12細(xì)胞MEF2C的表達(dá)抑制肌源性終末分化[18]。SUV39H1 在 MLL-AF9 誘導(dǎo)的 AML 進(jìn)展中起腫瘤抑制作用[19]。SUV39H1 的抑制劑F5446 可以抑制人類結(jié)腸癌細(xì)胞的生長[20]。但是其在成骨誘導(dǎo)中的作用特別是肌干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)中的作用還有待探索。

本研究中我們首先在C2C12細(xì)胞中構(gòu)建SUV39H1過表達(dá)的穩(wěn)轉(zhuǎn)株，使其能夠持續(xù)過表達(dá)SUV39H1。因此可以避免質(zhì)粒瞬轉(zhuǎn)引起的假陽性結(jié)果。隨后用BMP2對(duì)C2C12過表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)株進(jìn)行成骨誘導(dǎo)。其形態(tài)有梭型逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)閳A形，并呈鵝卵石樣生長。說明成骨誘導(dǎo)成功。在隨后的Western blot、qRT-PCR、免疫熒光、ALP和茜素紅染色中我們發(fā)現(xiàn)SUV39H1高表達(dá)會(huì)降低Runx2、ALP等相關(guān)成骨蛋白的表達(dá)。這提示SUV39H1對(duì)BMP2誘導(dǎo)的C2C12細(xì)胞的成骨分化有一定的抑制作用。

綜上所述，本研究表明SUV39H1過表達(dá)可以抑制BMP2誘導(dǎo)的C2C12細(xì)胞相關(guān)成骨蛋白的表達(dá)，這為肌干細(xì)胞成骨分化表觀遺傳學(xué)的研究提供了相關(guān)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和理論支持。但是組蛋白甲基化酶SUV39H1具體通過調(diào)控哪些反式作用因子引起成骨表觀遺傳學(xué)改變的分子機(jī)制，以及如何應(yīng)用SUV39H1促進(jìn)肌干細(xì)胞向成骨分化的臨床應(yīng)用是我們亟待回答的問題也是我們后面研究的重點(diǎn)。