劉雷 毛文 鄭一舟 祁福 李紅 張明煥

武漢市第三醫(yī)院，湖北 武漢 430074

骨組織具有極大的修復(fù)和再生能力，由創(chuàng)傷、手術(shù)切除、感染和先天性骨病等造成的大塊骨缺損的修復(fù)和功能重建一直是骨科領(lǐng)域的難題和研究熱點(diǎn)[1-2]。針對(duì)大塊骨缺損的治療，自體骨移植一直被認(rèn)為是其修復(fù)方法，但該方法存在供骨來源有限且操作復(fù)雜等缺點(diǎn)[3]。隨著組織工程學(xué)的發(fā)展，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)在大塊骨缺損的骨骼修復(fù)中具有重要作用[4]。BMSCs是一種多潛能的干細(xì)胞，具有干細(xì)胞特性，可分化為軟骨細(xì)胞、肌細(xì)胞、成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞等[5]。BMSCs所參與的成骨過程是骨形成的關(guān)鍵步驟，從骨祖細(xì)胞到成骨前細(xì)胞，最終分化為成熟的成骨細(xì)胞[6]。骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)信號(hào)通路是體外調(diào)控成骨分化和體內(nèi)骨形成的重要途徑之一[7-8]。脂聯(lián)素(adiponectin, ApN)是脂肪組織分泌的一種脂肪因子，研究[9-11]表明，ApN可通過多種途徑促進(jìn)骨形成。本實(shí)驗(yàn)旨在研究ApN對(duì)BMSCs成骨分化的作用及其機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 主要材料

人BMSCs和hMSC無血清培養(yǎng)液購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；L-抗壞血酸、β-甘油磷酸鈉和地塞米松購(gòu)自Sigma公司；NheI、KpnI、AgeI和EcoRI購(gòu)自NEB公司；T4 DNA連接酶購(gòu)自TaKaRa公司；DNA回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自天根公司；TOP10感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自索萊寶公司；Opti-MEM購(gòu)自Gibgo公司；Lipofectamine 2000購(gòu)自凱瑞基公司；茜素紅法鈣質(zhì)染色試劑盒購(gòu)自上海歌凡公司；堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)染色液購(gòu)自Servicebio公司；Trizol購(gòu)自Ambion公司；SYBR FAST qPCR Master Mix購(gòu)自KAPA Biosystems公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自Solarbio公司；PVDF轉(zhuǎn)移膜和化學(xué)發(fā)光試劑購(gòu)自Millipore公司；兔抗ApN抗體購(gòu)自Bioswamp公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將BMSCs接種于hMSC無血清培養(yǎng)液，置于37 ℃、5 % CO2的環(huán)境培養(yǎng)。待細(xì)胞長(zhǎng)至80 %～90 %融合時(shí)，將無血清培養(yǎng)液更換為成骨誘導(dǎo)分化所用的完全培養(yǎng)基(L-抗壞血酸50 μg/mL、β-甘油磷酸鈉10 mmol/L、地塞米松10-8mol/L)，誘導(dǎo)培養(yǎng)14 d。

1.3 過表達(dá)及干擾質(zhì)粒構(gòu)建

設(shè)計(jì)并合成ApN基因過表達(dá)引物(3對(duì)shRNA)，PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖電泳后切膠回收，和載體PCDNA3.1-EGFP(pLKO.1-EGFP)分別用NheI和KpnI(AgeI和EcoRI)雙酶切，回收酶切產(chǎn)物，加入T4連接酶及連接反應(yīng)緩沖液，16 ℃連接過夜，連接產(chǎn)物經(jīng)TOP10感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，挑選陽性克隆菌落接種于含抗生素的LB培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)12 h，PCR驗(yàn)證菌落，陽性克隆測(cè)序。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

轉(zhuǎn)染前24 h，在6孔板接種5×105個(gè)細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞融合度為90 %進(jìn)行轉(zhuǎn)染。用250 μL Opti-MEM稀釋4 μg質(zhì)粒DNA。用250 μL Opti-MEM稀釋10 μL Lipofectamine 2000，室溫靜置5 min?；靹騼煞N稀釋液，室溫靜置20 min。將500 μL復(fù)合物加到含有細(xì)胞和換有1.5 mL新鮮培養(yǎng)基的培養(yǎng)板中，輕搖培養(yǎng)板。將培養(yǎng)板置于37 ℃、5 % CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)48 h。

1.5 細(xì)胞分組與處理

將BMSCs分為5組：對(duì)照組、過表達(dá)組、過表達(dá)空載組、干擾組和干擾空載組。對(duì)照組不做任何處理。過表達(dá)組BMSCs轉(zhuǎn)染ApN過表達(dá)質(zhì)粒。過表達(dá)空載組BMSCs轉(zhuǎn)染過表達(dá)空載質(zhì)粒。干擾組BMSCs轉(zhuǎn)染ApN干擾質(zhì)粒。干擾空載組BMSCs轉(zhuǎn)染干擾空載質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染48 h。

1.6 茜素紅染色

PBS清洗細(xì)胞，4 %多聚甲醛固定30 min。吸去4 %多聚甲醛溶液，加入2 mL茜素紅染色液染色30 min，蒸餾水清洗，在倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.7 ALP染色

取6孔板培養(yǎng)各組細(xì)胞，PBS清洗。加入2 mL 4 %多聚甲醛固定15 min，PBS清洗。加入2 mL ALP染色液，避光染色15 min，PBS清洗，在倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.8 qRT-PCR檢測(cè)

取各組細(xì)胞約1×106個(gè)，加1 mL Trizol提取總RNA。反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，10 μL SYBR FAST qPCR Master Mix，0.5 μL上游引物，0.5 μL下游引物，1 μL cDNA模板，8 μL ddH2O。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性5 s，56 ℃退火10 s，72 ℃延伸25 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。GAPDH作為內(nèi)參，使用2-ΔΔCT法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.9 Western Blot檢測(cè)

收集各組細(xì)胞約1×106個(gè)，加200 μL裂解液，4 ℃，12 000g離心10 min，取上清，BCA法測(cè)定蛋白濃度。40 μg蛋白上樣，SDS-PAGE電泳，將分離的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。4 ℃環(huán)境中，5 %脫脂奶粉封閉12 h，分別加入兔抗ApN(稀釋比1∶1 000)兔抗GAPDH(稀釋比1∶1 000)，室溫孵育1 h。蒸餾水清洗膜，加入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG，室溫孵育1 h。蒸餾水清洗膜后加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑，在暗的環(huán)境中曝光顯影，讀取蛋白條帶灰度值，統(tǒng)計(jì)分析灰度值。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

注：A：qRT-PCR檢測(cè)ApN mRNA表達(dá)量；B：Western Blot檢測(cè)ApN蛋白表達(dá)量；與對(duì)照組比較，*P<0.05。圖1 轉(zhuǎn)染效率鑒定Fig.1 Identification of transfection efficiency

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染效率鑒定

qRT-PCR和Western Blot檢測(cè)ApN過表達(dá)質(zhì)粒及干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果見圖1，與對(duì)照組相比，過表達(dá)組BMSCs中ApN mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，干擾組BMSCs中ApN mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，這一結(jié)果表明ApN過表達(dá)質(zhì)粒及干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功。本研究選擇干擾效果最好的shRNA-1進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 ApN促進(jìn)BMSCs鈣化沉積

茜素紅染色觀察各組細(xì)胞鈣化沉積。結(jié)果見圖2，與對(duì)照組相比，過表達(dá)組BMSCs中鈣化沉積增多，干擾組BMSCs中鈣化沉積減少。表明過表達(dá)ApN可促進(jìn)BMSCs鈣化沉積。

圖2 茜素紅染色(100×)Fig.2 Alizarin red staining (100×)

2.3 ApN促進(jìn)BMSCs成骨分化

ALP染色觀察各組細(xì)胞成骨分化能力。結(jié)果見圖3，與對(duì)照組相比，過表達(dá)組BMSCs陽性表達(dá)較多，干擾組BMSCs陽性表達(dá)較少。表明過表達(dá)ApN可促進(jìn)BMSCs成骨分化。

圖3 ALP染色(100×)Fig.3 ALP staining (100×)

2.4 ApN上調(diào)受體AdipoR1和AdipoR2表達(dá)

qRT-PCR檢測(cè)ApN受體AdipoR1和AdipoR2 mRNA表達(dá)量。結(jié)果見圖4，與對(duì)照組相比，過表達(dá)組BMSCs中AdipoR1和AdipoR2 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，干擾組BMSCs中AdipoR1和AdipoR2 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。表明過表達(dá)ApN可上調(diào)BMSCs中AdipoR1受體和AdipoR2受體表達(dá)。

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05。圖4 qRT-PCR檢測(cè)AdipoR1和AdipoR2 mRNA表達(dá)量Fig.4 The mRNA expression levels of AdipoR1 and AdipoR2 were detected using qRT-PCR

2.5 ApN上調(diào)BMP信號(hào)通路及成骨相關(guān)基因表達(dá)

qRT-PCR檢測(cè)BMP信號(hào)通路及成骨相關(guān)基因mRNA表達(dá)量。結(jié)果見表2，與對(duì)照組相比，過表達(dá)組BMSCs中BMP2、RUNX2、Smad1和Smad5 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，干擾組BMSCs中BMP2、RUNX2、Smad1和Smad5 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。表明過表達(dá)ApN可在基因轉(zhuǎn)錄水平上上調(diào)成骨相關(guān)基因表達(dá)以激活BMP信號(hào)通路。

表2 BMP信號(hào)通路及成骨相關(guān)基因表達(dá)情況

3 討論

脂肪組織被認(rèn)為是一種簡(jiǎn)單的脂質(zhì)儲(chǔ)存器官，后被發(fā)現(xiàn)為重要的內(nèi)分泌器官，能分泌許多細(xì)胞因子，例如ApN、瘦素和抵抗素等[12]。ApN是脂肪組織中含量最豐富的脂肪因子，具有抗炎和增加胰島素敏感性等生物學(xué)功能[13]。Yamauchi等[14]最初鑒定了兩種ApN受體，AdipoR1以及AdipoR2，AdipoR1主要在肌肉中表達(dá)，AdipoR2主要在肝臟中表達(dá)。Berner等[15]在人成骨細(xì)胞和鼠成骨細(xì)胞系MC3T3-E1中均檢測(cè)到ApN及其受體AdipoR1和AdipoR2的表達(dá)。Wang等[16]的研究通過免疫組化方法檢測(cè)了AdipoR1和AdipoR2在BMSCs中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示AdipoR1在細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜中均有表達(dá)，而AdipoR2盡在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜中表達(dá)，表明ApN與BMSCs存在著密切聯(lián)系。Yang等[17]在ApN缺陷型Adipoqtm1Chan小鼠中研究了ApN對(duì)骨代謝的影響，結(jié)果表明與野生型小鼠相比，ApN缺陷型小鼠骨量減少，破骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞生成增加，成骨細(xì)胞生成減少。這證明了ApN確實(shí)存在調(diào)節(jié)骨細(xì)胞和骨量的作用，然而具體的作用機(jī)制還未有報(bào)道。

BMSCs是一類具有多向分化能力的原始骨髓細(xì)胞，可修復(fù)受損骨組織，維持骨組織代謝平衡[1]。研究[18]表明，BMP信號(hào)通路在BMSCs分化中發(fā)揮重要作用。BMP2是成骨過程中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，BMP2通過與靶細(xì)胞上的I型和II型絲氨酸/蘇氨酸激酶受體結(jié)合，進(jìn)而磷酸化下游的Smad1/5/9，磷酸化的Smads可與Smad4結(jié)合形成復(fù)合物，易位進(jìn)細(xì)胞核內(nèi)，調(diào)節(jié)RUNX2和Osx等靶基因[19]。然而RUNX2是成骨分化所必需的轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)節(jié)成骨特異性標(biāo)志物ALP、Col I和OCN等的表達(dá)[20]。Qiu等[21]在研究微管微絲交聯(lián)因子1(microtubule actin cross-linking factor 1, Macf1)在骨形成和成骨分化中的功能和機(jī)制時(shí)，發(fā)現(xiàn)敲低Macf1抑制Bmp2/Smad/RUNX2信號(hào)通路，下調(diào)ALP、Col I和OCN表達(dá)，抑制骨形成和成骨分化。因此BMP2及BMP通路作用ALP在骨形成和骨分化中發(fā)揮著重要作用。

ALP是成骨分化的早期標(biāo)志物[22]，在本研究中，我們首先用茜素紅染色和ALP染色評(píng)估了ApN對(duì)BMSCs成骨分化的影響。研究結(jié)果顯示，過表達(dá)ApN增強(qiáng)了BMSCs中鈣化沉積，ALP陽性表達(dá)也增多；而干擾ApN表達(dá)則顯示出相反的結(jié)果，這表明ApN可促進(jìn)BMSCs的成骨分化。為探討B(tài)MP通路是否也參與ApN介導(dǎo)的BMSCs成骨分化，我們也檢測(cè)了BMP信號(hào)通路及成骨相關(guān)基因的表達(dá)。研究結(jié)果顯示，過表達(dá)ApN上調(diào)BMSCs中BMP2、RUNX2、Smad1和Smad5 mRNA表達(dá)；干擾ApN表達(dá)下調(diào)BMP2、RUNX2、Smad1和Smad5 mRNA表達(dá)。這表明ApN可能是通過激活BMP信號(hào)通路發(fā)揮促進(jìn)BMSCs成骨分化的作用。有研究[23]發(fā)現(xiàn)，枸杞多糖在缺氧條件下增強(qiáng)了BMSCs的成骨細(xì)胞分化，并認(rèn)為其作用機(jī)制為增強(qiáng)了BMSCs中Runx2和ALP的表達(dá)。Yuan等[24]證實(shí)了新橙皮苷促進(jìn)小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖和成骨分化，增強(qiáng)堿性磷酸酶活性，上調(diào)成骨細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)與新橙皮苷作用BMP2-Wnt/β-catenin通路的作用機(jī)制相關(guān)。本研究?jī)H在細(xì)胞水平初步探討了ApN對(duì)BMSCs成骨分化的作用和機(jī)制，然而ApN對(duì)BMP信號(hào)通路的調(diào)控具體的關(guān)鍵靶點(diǎn)是什么尚不清楚，仍需進(jìn)一步研究。

綜上所述，ApN可通過BMP信號(hào)通路促進(jìn)BMSCs成骨分化。這為BMSCs用于治療骨損傷提供了一定的理論基礎(chǔ)。