畢菲菲 ， 郝振凱 ， 孫 霈 ， 于詠蘭 ， 劉賢勇 ， 索 勛

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 ， 北京 海淀100193)

艾美耳球蟲(chóng)是一類(lèi)寄生于禽類(lèi)和哺乳細(xì)胞內(nèi)的頂復(fù)門(mén)原蟲(chóng)，是導(dǎo)致畜禽球蟲(chóng)病的病原[1]。球蟲(chóng)病對(duì)養(yǎng)殖業(yè)危害巨大，每年對(duì)養(yǎng)殖業(yè)造成巨額的經(jīng)濟(jì)損失[2]。目前，防控該病主要依賴(lài)抗球蟲(chóng)藥物和疫苗免疫[3]。我國(guó)每年用于防治雞球蟲(chóng)病的藥物費(fèi)用高達(dá)20億～30億人民幣[4]。目前由于抗球蟲(chóng)藥的長(zhǎng)期使用及不規(guī)范使用，使球蟲(chóng)產(chǎn)生了耐藥性，但是耐藥性產(chǎn)生的具體機(jī)制尚不清楚。地克珠利是一種廣譜抗球蟲(chóng)藥，屬于三嗪類(lèi)，對(duì)雞、火雞、兔、羊和牛的不同艾美耳球蟲(chóng)蟲(chóng)種有很好的療效[5]。研究表明，每1 kg飼料中添加1 mg的地克珠利對(duì)感染雞的大部分艾美耳球蟲(chóng)都有效[6]。對(duì)于地克珠利耐藥機(jī)制的研究，有學(xué)者比較了耐藥株與敏感株在同工酶上的差異，發(fā)現(xiàn)耐藥株有特異性酶條帶[7]； 而利用隨機(jī)引物擴(kuò)增(Random amplified polymorphic DNA,RAPD)顯示了不同耐藥分離株特定基因的多樣性[8]。mRNA 差異顯示技術(shù)、SDS-PAGE等也被用于球蟲(chóng)耐藥株與敏感株在基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平的差異研究[9-12]。Shirley 等于2000年采用遺傳學(xué)方法繪制的柔嫩艾美耳球蟲(chóng)的遺傳連鎖圖，推測(cè)氟腺呤(Arprinocid)耐藥性相關(guān)的連鎖群可能位于第 1 號(hào)染色體上[13]。然而，至今還未找到艾美耳球蟲(chóng)地克珠利耐藥性的靶基因，亦無(wú)法解析艾美耳球蟲(chóng)耐藥性產(chǎn)生的分子機(jī)制。

本研究將結(jié)合艾美耳球蟲(chóng)耐藥性表型特征、高通量測(cè)序和生物信息學(xué)分析，試圖鑒定球蟲(chóng)針對(duì)地克珠利的耐藥性基因并解析產(chǎn)生耐藥性的分子機(jī)制，為建立球蟲(chóng)耐藥性田間快速分子診斷方法提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)蟲(chóng)株 本研究從山東省、云南省、上海市和河南省的養(yǎng)雞場(chǎng)收集新鮮糞便樣品，在實(shí)驗(yàn)室分離培養(yǎng)出柔嫩艾美耳球蟲(chóng)后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 本實(shí)驗(yàn)室用于球蟲(chóng)傳代的AA肉雞，購(gòu)自北京愛(ài)拔益加家禽育種有限公司。雞只飼養(yǎng)于無(wú)球蟲(chóng)環(huán)境中，保障充足的水和飼料供給。提供的飼料和水均經(jīng)過(guò)嚴(yán)格高溫處理(80 ℃處理2 h以上)，防止球蟲(chóng)污染。本研究涉及的所有動(dòng)物的飼養(yǎng)和試驗(yàn)均嚴(yán)格按照中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)的相關(guān)規(guī)章制度進(jìn)行。用于傳代或收集裂殖子的雞只均為AA肉雞。

1.3 主要試劑和器材 飽和食鹽水:將蒸餾水煮沸后加入食鹽不斷攪拌直至飽和，冷卻后倒入封閉容器中保存?zhèn)溆茫?.5%重鉻酸鉀溶液:稱(chēng)取2.5 g重鉻酸鉀粉末，將其加入到1 L蒸餾水中，完全溶解后倒入封閉容器中保存?zhèn)溆?；PBS溶液:將商品化的PBS粉末加到1 L蒸餾水中，攪拌直至完全溶解，倒入封閉容器中保存?zhèn)溆?；次氯酸鈉溶液:有效氯濃度>10%；過(guò)濾篩:80目、200目；錐形瓶:250 mL、500 mL；載玻片；以上試劑和器材均購(gòu)自北京吉普騰生物技術(shù)有限公司。地克珠利：濃度為0.5%，購(gòu)自上海獸醫(yī)研究所。巴斯德吸管，購(gòu)自上海晶安生物科技有限公司。

1.4 主要儀器設(shè)備 大容量低速離心機(jī)(Anke LXJ-IIB型)和小容量離心機(jī)(Anke LXJ-40B型)，均購(gòu)自上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng)；麥克馬斯特計(jì)數(shù)板，購(gòu)自上海獸醫(yī)研究所；不銹鋼禽用隔離器(IPQ-3型)，購(gòu)自蘇州市蘇杭實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)備廠(chǎng)；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(DGG-9070A型)，購(gòu)自上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.5 試驗(yàn)方法

1.5.1 田間分離蟲(chóng)株的采集及樣品中球蟲(chóng)卵囊的觀察 選擇育雛雞舍采集糞樣，按照隨機(jī)取樣原則進(jìn)行，若雞場(chǎng)規(guī)模較小，則在每個(gè)雞舍隨機(jī)取樣；若雞場(chǎng)規(guī)模較大，則隨機(jī)選擇雞舍進(jìn)行采樣。采集的糞便樣品注意分類(lèi)保存到自封袋或封閉容器中，加入2.5%的重鉻酸鉀溶液后運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行后續(xù)處理。

將糞便樣品攪拌均勻后，用天平稱(chēng)取2 g至100 mL燒杯中。用量筒量取30 mL飽和食鹽水，倒入盛有糞便樣品的燒杯中并攪拌均勻。靜置5～10 min后，用巴斯德吸管吸取上層液體并注入麥克馬斯特計(jì)數(shù)板中，然后放到顯微鏡下靜置3～5 min。在10倍物鏡下觀察和計(jì)數(shù)球蟲(chóng)卵囊。

1.5.2 田間分離蟲(chóng)株的分離和收集 對(duì)鏡檢下有球蟲(chóng)的樣品，收集其中的卵囊。以混合卵囊接種2周齡左右AA肉雞。感染后7 d收集盲腸，將腸道剪碎后，以2.5%胰酶42 ℃消化30 min，紗布過(guò)濾腸道組織后，3 600 r/min離心6 min。將沉淀中的卵囊用飽和食鹽水漂浮法進(jìn)行收集和孢子化。以多卵囊的方式從中分離出柔嫩艾美耳球蟲(chóng)，即將卵囊稀釋成約1 μL的濃度，加1 μL稀釋好的卵囊液于載玻片上，在顯微鏡下觀察確認(rèn)每滴液體中的卵囊是柔嫩艾美耳球蟲(chóng)后，小心收集10個(gè)卵囊，并接種于2只1周齡左右的AA肉雞，收集后代卵囊，并對(duì)后代卵囊進(jìn)行傳代擴(kuò)增。

1.5.3 田間分離株的耐藥性測(cè)試

1.5.3.1 試驗(yàn)分組及感染 試驗(yàn)時(shí)所用雞只為13日齡AA肉雞，蟲(chóng)株為分離獲得的田間蟲(chóng)株，分組時(shí)每個(gè)蟲(chóng)株均設(shè)立感染給藥組和感染不給藥組，每組5只雞，同時(shí)設(shè)立不感染不給藥組(10只雞)。取保存在重鉻酸鉀溶液中的孢子化卵囊，用PBS清洗除去重鉻酸鉀，各感染給藥組和感染不給藥組同一天接種不同分離蟲(chóng)株的孢子化卵囊5×104個(gè)/只。試驗(yàn)劑量采用地克珠利臨床推薦的劑量 1 mg/L，飲水服用，每1 L水中加入 200 μL 0.5%地克珠利溶液。感染給藥組從感染前1天飼喂含地克珠利藥物的飲用水直到試驗(yàn)結(jié)束。分別稱(chēng)量感染前、感染后第7天的體重。試驗(yàn)過(guò)程中觀察雞只的狀態(tài)，如有無(wú)便血等，如雞只死亡，對(duì)其進(jìn)行剖檢，觀察腸道病變情況，判斷雞只是否死于球蟲(chóng)感染。感染后第7天將所有雞只剖殺，對(duì)腸道進(jìn)行病變計(jì)分，然后將每只雞腸道分別收集到 50 mL 離心管中，加入重鉻酸鉀溶液，進(jìn)行卵囊勻漿，計(jì)算每只雞腸道中球蟲(chóng)卵囊的數(shù)量。

1.5.3.2 耐藥性評(píng)價(jià)指標(biāo) 本研究選取的耐藥性評(píng)價(jià)指標(biāo)為相對(duì)卵囊產(chǎn)量(Relative oocyst production,ROP)、最適抗球蟲(chóng)活性百分率(Percent of optimum anticoccidial activity,POAA)、病變記分減少率(Reduction of lesion scores,RLS)和抗球蟲(chóng)指數(shù)(Anticoccidia indexes,ACI)[14]。

相對(duì)卵囊產(chǎn)量(ROP)/%=(感染給藥組的平均卵囊產(chǎn)量/感染不給藥組的平均卵囊產(chǎn)量)×100%。ROP<15%，耐藥性為陰性；ROP≥15%，耐藥性為陽(yáng)性。

最適抗球蟲(chóng)活性百分率(POAA)/%=(感染給藥組GSR-感染不給藥組GSR)/(不感染不給藥組GSR-感染不給藥組GSR)×100%，其中增重和存活率(Growth and survival ratio,GSR)=籠末重/籠初重。POAA>50%，耐藥性為陰性；POAA≤50%，耐藥性為陽(yáng)性。

病變記分減少率(RLS)/%=(感染不給藥組的平均病變記分-感染給藥組的平均病變記分)/感染不給藥組的平均病變記分×100%。RLS≥50%，耐藥性為陰性；RLS<50%，耐藥性為陽(yáng)性。

抗球蟲(chóng)指數(shù)(ACI)=(存活率+相對(duì)增重率)-(病變值+卵囊值)，其中存活率/%=(存活雞只數(shù)/開(kāi)始雞只數(shù))×100%；相對(duì)增重率/%=(感染不給藥組雞只的平均增重/不感染不給藥組雞只的平均增重)×100%；病變值=每組的平均盲腸病變記分×10。ROP為0～1%，卵囊值為0；ROP為26%～50%，卵囊值為10；ROP為51%～75%，卵囊值為20；ROP為76%～100%，卵囊值為40。ACI>160，耐藥性為陰性;ACI≤160，耐藥性為陽(yáng)性。

對(duì)雞球蟲(chóng)耐藥性進(jìn)行評(píng)價(jià)時(shí)，結(jié)合上面提到的4項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行綜合判定：4項(xiàng)指標(biāo)均為耐藥性陰性時(shí)，判定為對(duì)藥物敏感；1項(xiàng)指標(biāo)為陽(yáng)性時(shí)，判定為輕度耐藥；2項(xiàng)指標(biāo)為陽(yáng)性時(shí)，判定為中度耐藥；3項(xiàng)或4項(xiàng)指標(biāo)為陽(yáng)性時(shí)，判定為完全耐藥。

1.5.4 田間分離株第2代裂殖子基因組DNA的提取 取新鮮柔嫩艾美耳球蟲(chóng)分離株分別接種1月齡左右的AA肉雞，每只肉雞接種2×105個(gè)卵囊，每株接種3只雞。接種后第120 小時(shí)，剖殺雞只，取盲腸，輕輕移除盲腸內(nèi)容物并清洗，將盲腸剪碎后，向其中加入42 ℃溫?zé)岬南?，置于恒溫?cái)嚢杵魃希?2 ℃消化30 min。取消化后懸液，用4層紗布過(guò)濾。濾液轉(zhuǎn)入50 mL離心管中，3 600 r/min 離心6 min。離心后，小心棄除一半的上層消化液，用1 mL加樣槍?zhuān)⌒奈∮诎咨恋砩系男鯛罱M織和消化液，將下層的白色沉淀轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管中，加入1 mL PBS，混勻，3 000 r/min 離心6 min。此時(shí)沉淀分為3層，最下層為白色，即柔嫩艾美耳球蟲(chóng)第2代裂殖子，用PBS重懸，將其轉(zhuǎn)入新的1.5 mL EP管中，并用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。每個(gè)樣品取約5×108個(gè)第2代裂殖子，加入1 mL PBS，混勻，3 600 r/min離心5 min，棄上清?；蚪MDNA提取使用Blood & Cell Culture DNA Midi Kit，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。DENOVIX 超微量分光光度計(jì)測(cè)量每個(gè)樣品的基因組DNA的濃度和純度。

1.5.5 高通量全基因組重測(cè)序及生物信息學(xué)分析 田間分離柔嫩艾美耳球蟲(chóng)蟲(chóng)株基因組DNA經(jīng)分光光度計(jì)測(cè)量合格后，送至安諾優(yōu)達(dá)基因科技(北京)有限公司進(jìn)行 Illumina小片段文庫(kù)構(gòu)建及全基因組重測(cè)序。單個(gè)樣品測(cè)序數(shù)據(jù)量大于5 Gb(大于100×平均基因組覆蓋度)。

1.5.6 柔嫩艾美耳球蟲(chóng)耐藥性相關(guān)基因的分析 將田間分離株全基因組重測(cè)序得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾，再以Fastqc軟件進(jìn)行質(zhì)檢，符合Q30 > 80%后即認(rèn)為Clean data，可用于后續(xù)分析。首先構(gòu)建柔嫩艾美耳球蟲(chóng)基因組的Index，再用BWA軟件分別將Clean reads比對(duì)到新版參考基因組(豪頓株，ETH)上，生成SAM文件，然后用SAMtools將SAM文件進(jìn)行排序并轉(zhuǎn)換成BAM文件，隨后借助GATK v4.011軟件中的MarkDuplicates工具將由建庫(kù)過(guò)程中聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase chain reaction,PCR)產(chǎn)生的復(fù)制情況進(jìn)行標(biāo)記。因本次分析需要將耐藥株和敏感株視為2個(gè)由不同數(shù)目個(gè)體組成的微生物群體，而分析2個(gè)群體之間的差異。在最后Call SNP時(shí)需用不同的參數(shù)進(jìn)行。Freebayes v1.0[15]具體參數(shù)：-F 0.01 -C 3 --pooled-continuous --min-mapping-quality 30 --min-base-quality 20 --min-coverage 10。將生成的VCF文件以VCFtools[16]提取SNP，并用Python腳本進(jìn)行質(zhì)量過(guò)濾，過(guò)濾標(biāo)準(zhǔn)：QUAL<60.0,DP<10。

ΔSNP-index計(jì)算公式：?jiǎn)吸c(diǎn)SNP-index=突變基因型的覆蓋度/總覆蓋度，ΔSNP-index=SNP-index(耐藥)-SNP-index(敏感)。本試驗(yàn)利用Python編寫(xiě)腳本程序，計(jì)算耐藥株與敏感株基因組之間每50 kb窗口的ΔSNP-index，并以20 kb作為滑窗步長(zhǎng)。最后以R語(yǔ)言qqman語(yǔ)言包進(jìn)行可視化作圖。

2 結(jié)果

2.1 田間分離柔嫩艾美耳球蟲(chóng)蟲(chóng)株的分離 本試驗(yàn)共獲得4株田間柔嫩艾美耳球蟲(chóng)蟲(chóng)株，分別來(lái)自山東、云南、上海和河南，依次命名為Et-SD、Et-YN、Et-SH和Et-HN。

2.2 田間分離的柔嫩艾美耳球蟲(chóng)蟲(chóng)株的耐藥性測(cè)試 本研究對(duì)4株田間分離蟲(chóng)株進(jìn)行了耐藥性相關(guān)試驗(yàn)，結(jié)果如表1所示，通過(guò)4項(xiàng)指標(biāo)的評(píng)價(jià)，本研究分離到的4株田間蟲(chóng)株中，河南蟲(chóng)株4項(xiàng)指標(biāo)耐藥表型為陽(yáng)性，表明河南地方株對(duì)地克珠利是完全耐藥的，而山東株、云南株、上海株的4項(xiàng)指標(biāo)耐藥表型為陰性，說(shuō)明這3株地方株對(duì)地克珠利具有敏感性。

表1 不同分離蟲(chóng)株對(duì)地克珠利的耐藥性Table 1 Resistance of different Eimeria tenella strains when treating with diclazuril

2.3 田間分離蟲(chóng)株第2代裂殖子基因組DNA的提取 本試驗(yàn)獲得4株分離蟲(chóng)株第2代裂殖子的高質(zhì)量DNA(表2)，并送樣至公司進(jìn)行全基因組重測(cè)序，另一部分存儲(chǔ)于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

表2 不同分離蟲(chóng)株第2代裂殖子DNA的提取結(jié)果Table 2 The quality of total DNA extracted from the 2nd generation merozoites of different isolates

2.4 柔嫩艾美耳球蟲(chóng)全基因組重測(cè)序及ΔSNP-index分析 本研究從田間分離到的3株敏感株和1株耐藥株的第2代裂殖子DNA送樣至公司進(jìn)行全基因組重測(cè)序后，測(cè)序結(jié)果與柔嫩艾美耳球蟲(chóng)參考基因組(豪頓株,ETH)進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果如表3所示，田間分離株與ETH株全基因組比對(duì)結(jié)果均大于90%，每個(gè)樣品與參考蟲(chóng)株比較，提取出的SNP個(gè)數(shù)在40 000個(gè)左右。對(duì)于耐藥和敏感種群之間的高質(zhì)量SNP(n=111 694)，通過(guò)計(jì)算核苷酸多樣性 Theta Pi (θπ) 沿基因組具有20 kb 窗口來(lái)估計(jì)遺傳多樣性。在第4、10、12、13、14號(hào)染色體上可以觀察到高水平的核苷酸多態(tài)性，相比之下，第1、2、3、7、8、9號(hào)染色體的多態(tài)性比較低(圖1)。將3株敏感株和1株耐藥株全基因組重測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行群體遺傳學(xué)分析，以50 kb的滑窗統(tǒng)計(jì)其ΔSNP-index(耐藥/敏感)并進(jìn)行分析(圖2、圖3)，結(jié)果顯示，經(jīng)ΔSNP-index分析有1個(gè)窗口的ΔSNP-index值等于1，具體查看內(nèi)部情況后，可見(jiàn)這些區(qū)域測(cè)序覆蓋度較低，區(qū)域內(nèi)僅含單個(gè)SNP位點(diǎn)造成的假陽(yáng)性位點(diǎn)。取ΔSNP-index值大于0.9的基因組區(qū)間，且核苷酸多態(tài)性降低的第1號(hào)和第6號(hào)染色體區(qū)域，在第1號(hào)染色體上的83 000～83 500 bp、第6號(hào)染色體的280 000～285 000 bp顯示出選擇信號(hào)，將這2個(gè)候選區(qū)域根據(jù)基因組注釋信息對(duì)這些區(qū)域內(nèi)所包含的基因進(jìn)行分析，可見(jiàn)這些區(qū)域中主要為串聯(lián)的表面抗原(Surface antigen,SAG)基因，耐藥株在其基因第36位點(diǎn)的堿基由C突變?yōu)锳，氨基酸在第12位點(diǎn)由天冬氨酸變?yōu)楣劝彼酖AC-GAA(D12E)(圖4)。

表3 敏感株與耐藥株全基因組比對(duì)的結(jié)果Table 3 Results of genome comparison between sensitive and resistant strains

圖1 不同染色體上多態(tài)性(θπ)的分布Fig.1 Distribution of the genetic diversity (θπ) on each chromosome

圖2 不同染色體上ΔSNP-index的分布Fig.2 Distribution of the ΔSNP-index on each chromosome

3 討論

據(jù)國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道，目前雞球蟲(chóng)的地克珠利耐藥性已經(jīng)非常普遍[17]，其對(duì)耐藥性產(chǎn)生的分子機(jī)制研究是非常必要的，同時(shí)也可以為新藥的研發(fā)提供靶位點(diǎn)，并為田間快速診斷地克珠利耐藥性提供分子標(biāo)記。李莎通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR (Quantitative real-time PCR,qPCR)發(fā)現(xiàn)添加地克珠利藥物的蟲(chóng)株的乳酸脫氫酶的 mRNA 水平顯著下降[18]；Wang等采用熒光定量 PCR 和蛋白質(zhì)印跡等技術(shù)研究地克珠利對(duì)柔嫩艾美耳球蟲(chóng)第2代裂殖子甘油醛-3-磷酸脫氫酶 mRNA 和蛋白表達(dá)量的影響，發(fā)現(xiàn)其 mRNA 表達(dá)水平顯著提高[19]；Shen等發(fā)現(xiàn)，地克珠利治療組熱休克蛋白90 mRNA的表達(dá)水平比對(duì)照組下降了29.7%[20]，推測(cè)地克珠利可能通過(guò)作用于乳酸脫氫酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶和熱休克蛋白90發(fā)揮抗球蟲(chóng)作用；Zhou等發(fā)現(xiàn)用地克珠利處理后，烯醇化酶的mRNA和蛋白表達(dá)水平分別降低了36.30%和40.36%[21]。遺憾的是，這些研究限于方法的不足，未能直接對(duì)基因突變是否為造成球蟲(chóng)的地克珠利耐藥性產(chǎn)生的原因進(jìn)行驗(yàn)證。

圖3 第1號(hào)和第6號(hào)染色體上ΔSNP-index的分布Fig.3 Distribution of the ΔSNP-index on 1 and 6 chromosome

圖4 敏感株和耐藥株在SAG基因上的突變位置信息Fig.4 Information on the mutation positions of sensitive and resistant strains in the SAG gene

隨著測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展，全基因測(cè)序技術(shù)為尋找耐藥蟲(chóng)株與敏感蟲(chóng)株間差異表達(dá)的基因提供了極大的方便。通過(guò)全基因組測(cè)序可以找到大量差異的基因。本研究共對(duì)3株敏感株和1株耐藥株進(jìn)行了全基因組重測(cè)序，通過(guò)比較等位基因頻率，首次發(fā)現(xiàn)這些區(qū)域中主要為串聯(lián)的SAG基因。Xie等也通過(guò)轉(zhuǎn)錄組比較發(fā)現(xiàn)，SAG基因在地克珠利耐藥蟲(chóng)株中顯著高表達(dá)[22]，與本研究結(jié)果相一致。因此，我們猜測(cè)通過(guò)本研究計(jì)算找到的敏感株和耐藥株在SAG基因上存在的非同義位點(diǎn)突變很可能與柔嫩艾美耳球蟲(chóng)的地克珠利耐藥性相關(guān)，后續(xù)還需通過(guò)基因編輯的方法對(duì)此基因進(jìn)行功能驗(yàn)證。