沈亞菊 ， 馮高樂 ， 邵 高 ， 朱 贊 ， 張志方 ， 夏天中 ， 林瑞平

(1.平湖市畜牧獸醫(yī)站 ， 浙江 嘉興 314200 ； 2.平湖市動物衛(wèi)生監(jiān)督所 ， 浙江 嘉興 314200)

重組禽流感病毒(H5+H7)三價滅活苗(H5N1 Re-11株+Re-12株，H7N9 H7-Re3株)是最新針對當(dāng)前高致病性禽流感流行毒株的疫苗。該苗屬于油包水型乳劑疫苗，其主要原材料為白油佐劑。傳統(tǒng)的白油佐劑疫苗黏稠度偏大、不易注射，有時還出現(xiàn)副反應(yīng)，如機體過敏、注射部位紅腫化膿、肌肉油乳狀殘留、油囊壁增生等現(xiàn)象。已有研究表明，疫苗回溫可以降低白油佐劑疫苗的黏稠度，有利于疫苗的注射和吸收，增強免疫效果。但溫度過高將對疫苗毒株活性產(chǎn)生較大的影響，甚至失去免疫效能。本試驗對重組禽流感病毒(H5+H7)三價滅活苗在不同溫度下的臨床免疫使用效果進行評價，探明適宜免疫接種溫度對受免動物抗體效價、副反應(yīng)的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗疫苗 重組禽流感病毒(H5+H7)三價滅活苗(H5N1 Re-11株+Re-12株，H7N9 H7-Re3株)由哈藥集團生物疫苗有限公司生產(chǎn)(批號為202041)，生產(chǎn)日期為20200906。

1.2 診斷試劑 禽流感病毒H7亞型血凝抑制試驗抗原(H7-Re3株)、禽流感病毒H5亞型血凝抑制試驗抗原(H5N1 Re-11株和Re-12株)和陽性血清，均由哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)有限公司生產(chǎn)(批號分別為2021001、2019009和2019007)，有效期均為2年。

1.3 試驗用雞 160羽健康黃羽肉雞，購自浙江省平湖市新埭鎮(zhèn)濮龍其肉雞養(yǎng)殖場。

1.4 試驗方法

1.4.1 試驗分組 將160羽27日齡的黃羽肉雞隨機分成A、B、C、D共4個組，每組40羽，分別注射不同回溫溫度的禽流感病毒(H5+H7)三價滅活苗。A組回溫溫度6～7 ℃，B組回溫溫度16～17 ℃，C組回溫溫度22～23 ℃，D組回溫溫度29～31 ℃。

1.4.2 免疫劑量 27日齡進行首免，每組接種40羽，免疫劑量0.5 mL/羽，雞右側(cè)胸部肌內(nèi)注射；57日齡進行二免,每組接種15羽，免疫劑量0.5 mL/羽，雞右側(cè)胸部肌內(nèi)注射。

1.4.3 不良反應(yīng)觀察 首次疫苗接種后對各組接種雞臨床癥狀、成活率、局部或全身不良反應(yīng)情況連續(xù)觀察7 d，并分別于首免后14 d和28 d每組隨機各取3～5羽剖檢，觀察接種部位肌肉病變情況。

1.4.4 免疫效價檢測 首次免疫前先測定基礎(chǔ)抗體，于41日齡(首免后14 d)、55日齡(首免后28 d)、69日齡(首免后42 d)、71日齡(二免后14 d)、85日齡(二免后28 d)和99日齡(二免后42 d)分別每組采集15份血樣，離心制備血清檢測免疫抗體。依據(jù)《高致病性禽流感診斷技術(shù)》(GB/T 18936—2020)，采用血凝(HA)和血凝抑制(HI)試驗，對H5和H7亞型免疫抗體進行檢測和結(jié)果判定。HI抗體滴度≥4log2為免疫抗體合格，群體陽性率≥70%為合格。

1.5 統(tǒng)計分析 采用SPSS 25.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，試驗結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用Shapiro-Wilk結(jié)果選擇非參數(shù)檢驗Kruskal-Wallis1-One way ANOVA(K samples)和多重比較All pairwise法進行差異顯著性檢驗，P<0.05表示差異顯著,P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 不良反應(yīng)觀察 結(jié)果見表1，首免后1 h內(nèi)，接種雞群怕冷聚堆羽數(shù)D組少于A組、B組和C組；接種第2天,C組1羽雞精神不振；接種第3天,A組和C組各有1羽雞精神不振；接種第4天,A組1羽雞精神不振、C組1羽雞死亡；接種第5天,A組有1羽雞死亡。

表1 疫苗首免接種觀察結(jié)果Table 1 Observation results of first immunization (羽)

首免后28 d時剖檢結(jié)果見圖1，A組、B組疫苗注射部位肌肉周圍仍有肉眼可見數(shù)量不等的黃白色顆粒或膠胨狀黃色未吸收物(圖1白色箭頭所示)，各組無肉眼可見病變，該顆粒物內(nèi)含未完全吸收的疫苗液體油囊；C組、D組疫苗注射部位肌肉基本無殘留。

圖1 各組首次免疫接種后28 d時剖檢結(jié)果Fig.1 Autopsy results at 28 d after the first immunization in each groupA:A組； B:B組； C:C組； D:D組

2.2 首次免疫效力檢驗 結(jié)果見表2，27日齡黃羽肉雞首免前H5Re11的HI抗體平均滴度為0.68log2，低于保護水平，H5Re12和H7Re3的HI抗體處于陰性水平；首免后14 d時，A組、B組、C組和D組H5Re11、Re12和H7Re3的HI抗體均達到4log2，之后持續(xù)上升，于首免后28 d時達到峰值，隨后下降。首免后28 d時A組和B組H5Re11、Re12和H7Re3的HI抗體平均滴度高于D組，且差異極顯著(P<0.01)；首免后14 d和42 d時，A組、B組、C組和D組之間差異均不顯著(P>0.05)。

表2 首免后不同時段免疫抗體效價檢測結(jié)果Table 2 Antibody titer test results at different time points after the first immunization

2.3 二次免疫效力檢驗 結(jié)果見表3，二免后14 d時，A組H7Re3的HI抗體平均滴度高于C組，且差異極顯著(P<0.01)；二免后28 d時，A組H7Re3的HI抗體平均滴度高于D組，且差異顯著(P<0.05)；二免后42 d時，A組、B組、C組和D組之間差異均不顯著(P>0.05)。

表3 二免后不同時段免疫抗體效價檢測結(jié)果Table 3 Antibody titer test results at different time points after the second immunization

2.4 免疫抗體消長規(guī)律 結(jié)果見圖2～4，4個組27日齡時首免，間隔30 d后二免，每隔14 d采血檢測，各組H5Re11、Re12和H7Re3的免疫抗體消長規(guī)律均是先快速上升達到峰值隨后緩慢下降，二免后呈現(xiàn)“V”型快速下降后上升,28 d時回到巔峰，以后緩慢下降。

圖2 二次免疫Re11株抗體效價變化結(jié)果Fig.2 Results of antibody titer changes of Re11 strain after secondary immunization

圖3 二次免疫Re12株抗體效價變化結(jié)果Fig.3 Results of antibody titer changes of Re12 strain after secondary immunization

圖4 二次免疫H7株抗體效價變化結(jié)果Fig.4 Results of antibody titer changes of H7 strain after secondary immunization

3 討論

3.1 不良反應(yīng)觀察 A組、B組和C組在首免后7 d內(nèi)出現(xiàn)較低水平的不良反應(yīng)及注射部位肌肉組織局部變化，29～31 ℃疫苗組免疫后的不良反應(yīng)以及局部變化情況輕于其他溫度疫苗組，且疫苗溫度越高，注射部位肌肉組織疫苗殘留越少。分析原因：一是雞群個體差異;二是疫苗本身的因素,本試驗使用的重組禽流感病毒(H5+H7)三價滅活苗屬于油包水型乳劑疫苗，采用美國索諾邦進口白油佐劑，此白油佐劑具有黏度低、精煉及純化程度高、化學(xué)穩(wěn)定性佳等特點，油包水疫苗具有吸收緩慢、免疫刺激持續(xù)和免疫保護期長等特點；三是環(huán)境和飼養(yǎng)管理的因素，疫苗注射操作不當(dāng)、飼養(yǎng)環(huán)境差、生物安全措施和管理不到位。首免接種后第4天，C組死亡1羽,接種第5天，A組死亡1羽。

注射部位疫苗殘留越少說明受免機體對疫苗吸收分解越好。不同溫度的重組禽流感病毒(H5+H7)三價滅活苗首免14 d后HI抗體均能達到免疫保護效價之上，不受疫苗吸收量差異的影響，可能與免疫劑量有關(guān)。重組禽流感病毒(H5+H7)三價滅活苗疫苗說明書上推薦用量為2～5周齡雞0.3 mL/羽，屠宰前28 d內(nèi)禁止使用。本試驗采納了養(yǎng)殖戶實踐生產(chǎn)中免疫程序和免疫劑量，27日齡雞用量0.5 mL/羽，是推薦劑量的1.67倍。

首免后28 d時，A組和B組注射部位肌肉組織中仍有少量未吸收黃白色顆粒或膠胨狀黃色未吸收物，C組和D組注射部位基本無疫苗殘留。張云山[1]研究認為，若長期食用過量的油佐劑殘留可能引起健康風(fēng)險，建議推薦劑量內(nèi)回溫免疫后至少28 d后才能屠宰上市，否則影響雞肉品質(zhì)。

3.2 免疫效果 目前推廣使用的禽流感疫苗通常為油佐劑滅活苗[2]。油乳劑疫苗的黏度直接影響疫苗的使用和免疫效果。在一定溫度范圍內(nèi)，油苗黏度隨溫度的升高而下降[3]。黏度較低的疫苗免疫后抗體產(chǎn)生時間、維持水平優(yōu)于黏度較高的疫苗[4]。本試驗中不同溫度的重組禽流感病毒(H5+H7)三價滅活苗在抗體產(chǎn)生時間、免疫抗體消長規(guī)律上表現(xiàn)是一致的。首免后A組和B組的HI抗體平均滴度峰值高于D組，差異極顯著(P<0.01)。本試驗結(jié)果表明疫苗溫度升高不但沒有提高免疫效果，反而降低了免疫抗體峰值均值，分析原因可能與6～31 ℃時禽流感油乳劑疫苗黏度隨溫度升高而降低的幅度很小有關(guān)，而溫度升高對禽流感疫苗中抗原蛋白產(chǎn)生不利影響。二免后14、28 d和42 d不同溫度疫苗組之間H5Re11、H5Re12的HI抗體平均滴度差異不顯著(P>0.05)，二免后42 d不同溫度疫苗組之間H7Re3的HI抗體平均滴度差異不顯著(P>0.05)。二免后14 d僅A組與C組有顯著差異(P<0.05)，二免后28 d僅A組和D組有顯著差異(P<0.05)。這種表現(xiàn)可能是肉雞對不同溫度疫苗吸收分解的差異性、二免前不同溫度組間基礎(chǔ)抗體水平高低、溫度升高對疫苗中抗原的不利影響等多種因素綜合疊加的結(jié)果。由于本試驗二免后42 d及以前的抗體水平，溫度對疫苗免疫后42 d以后的抗體維持水平、維持時間的影響有待進一步探索。

重組禽流感病毒(H5+H7)三價滅活苗在6～31 ℃時能保證免疫效果，28 d免疫抗體可達到峰值水平，29～31 ℃時疫苗吸收效果較好。這一結(jié)果與趙東旭等[5]研究該疫苗對黃羽肉雞免疫效果抗體監(jiān)測峰值水平產(chǎn)生時間相符。

在確保免疫質(zhì)量的前提下，可根據(jù)不同養(yǎng)殖實際，在6～31 ℃對重組禽流感病毒(H5+H7)三價滅活苗進行回溫后免疫接種，可降低免疫應(yīng)急副反應(yīng)，加速疫苗吸收。肉雞27日齡時禽流感的母源抗體處于陰性水平，存在暴露風(fēng)險，建議養(yǎng)殖戶首免時間應(yīng)提早。飼養(yǎng)周期在55日齡的快速型肉雞，可進行一次免疫；飼養(yǎng)周期在80日齡或以上的，需要進行二次免疫。