姚 慶,王 丹,王小雙,吳英杰,冉麗媛

（1.大連醫(yī)科大學(xué)重大疾病基因工程模式動物研究所，遼寧 大連 116044；2.大連醫(yī)科大學(xué) 科技部基因工程模式動物國際聯(lián)合研究中心，遼寧 大連 116044）

隨著社會經(jīng)濟發(fā)展和生活水平提高，糖尿病、肥胖和脂肪肝等與糖脂代謝紊亂相關(guān)的疾病患病率逐年升高，2018年中國糖尿病患病率約12.4%，其中成人糖尿病前期比例占35.2%［1-3］。研究［4-6］顯示：性激素（如男性睪酮和女性雌二醇等）與機體糖脂代謝密切相關(guān)。卵巢具有分泌性激素，維持激素穩(wěn)態(tài)的重要功能，女性進入更年期后，卵巢功能逐漸退化，性激素產(chǎn)生減少，對體內(nèi)糖脂代謝穩(wěn)定造成影響，增加了絕經(jīng)后女性產(chǎn)生胰島素抵抗和罹患代謝綜合征的風(fēng)險［7-9］。此外，患有糖尿病等基礎(chǔ)疾病或僅出現(xiàn)胰島素抵抗等亞健康的女性群體，在進入絕經(jīng)期后，雌激素水平的紊亂和缺乏可能成為威脅女性健康的重要因素［8-9］。因此，在多種病理生理條件下探討雌激素缺乏對機體糖脂代謝的影響，對于闡明雌激素相關(guān)代謝綜合征發(fā)生發(fā)展的機制及篩選藥物干預(yù)靶點具有重要意義。

骨骼肌特異性胰島素樣生長因子1受體功能缺失 （loss of skeletal muscle-specific insulin-like growth factor-1 receptor function，MKR）小鼠是在骨骼肌中過表達人源胰島素樣生長因子1受體突變體而構(gòu)建的2型糖尿病動物模型［10］。KIM等［11］發(fā)現(xiàn)：純合雄性MKR小鼠自出生起就產(chǎn)生嚴重的胰島素抵抗，8周齡時血液中葡萄糖水平達到糖尿病標(biāo)準(zhǔn)，同時表現(xiàn)高胰島素血癥、高血糖癥和高脂血癥；而雌性MKR小鼠在性成熟后，空腹血糖水平較低，僅表現(xiàn)出胰島素抵抗和高胰島素血癥。

既往研究［12-13］常采用卵巢切除方法探究雌激素對機體代謝功能的影響，但其通過高糖高脂飲食誘導(dǎo)小鼠肥胖和胰島素抵抗并結(jié)合卵巢切除的方法，無法排除外源糖脂水平對結(jié)果的影響。雌性MKR小鼠是非肥胖人源化胰島素抵抗小鼠模型，排除肥胖自身產(chǎn)生的影響，本研究通過對其進行卵巢切除術(shù)干預(yù)，探究高內(nèi)源胰島素水平下卵巢切除對機體糖脂代謝穩(wěn)態(tài)的影響，為女性患者因雌激素缺失而導(dǎo)致代謝綜合征的臨床診斷及預(yù)防提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑和儀器MKR小鼠（FVB/N）由美國西奈山醫(yī)學(xué)院Derek LeRoith教授饋贈，野生型（WT）FVB/N小鼠購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，6周齡SPF級MKR和WT FVB/N雌性小鼠各20只，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2012-0001，實驗動物使用許可證號：SYXK（遼）2013-0006。小鼠飼養(yǎng)于大連醫(yī)科大學(xué)SPF動物實驗中心屏障內(nèi)IVC系統(tǒng)，溫度22.5℃，12 h明暗交替，相對濕度50%～60%，自由進食和飲水。所有動物實驗流程均在大連醫(yī)科大學(xué)實驗動物倫理委員會指導(dǎo)下進行（倫理審批號IACUC：AEE17065），實驗遵循3R原則。胰島素（江蘇萬邦生化醫(yī)藥股份有限公司），葡萄糖（美國Sigma公司），血糖試紙（瑞士Roche公司），HE染色試劑盒和糖原染色試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)公司），油紅O染色試劑盒（上海歌凡生物科技公司），RNAiso Plus試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實時熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）試 劑 盒（日 本TaKaRa公司），RT-qPCR引物（上海生工生物工程公司），激素敏感脂肪酶（hormone senitive lipase，HSL）和GAPDH抗體（中國Abbkine公司）。血糖儀（瑞士Roche公司），離心機（德國Eppendorf公司），高壓滅菌器（日本TOMY公司），超純水儀（美國Millipore公司），RT-qPCR儀（美國ABI公司），凝膠成像儀（美國Bio-Rad公司）。

1.2 實驗分組和小鼠卵巢切除模型建立6周齡雌性MKR小鼠20只隨機分為MKR假手術(shù)組（MKR組）和MKR卵巢切除組（MKR OVX組），每組10只；6周齡雌性WT FVB/N小鼠20只隨機分為WT假手術(shù)組（WT組）和WT卵巢切除組（WT OVX組），每組10只。恢復(fù)飼養(yǎng)2周后檢測各組小鼠體質(zhì)量、空腹血糖和隨機血糖等指標(biāo)。

WT OVX組 和MKR OVX組 小 鼠 采 用35 mg·kg－1戊巴比妥鈉麻醉，置于解剖墊上，酒精消毒暴露皮膚，于背部脊柱左側(cè)緣用眼科剪側(cè)切一個小的切口，輕柔撥開組織，結(jié)扎卵巢動脈，摘取卵巢后將其他組織回納，縫合切口。WT組和MKR組小鼠在麻醉打開切口后不做任何處理，縫合切口，恢復(fù)飼養(yǎng)。

1.3 葡萄糖耐量試驗（glucose tolerance test，GTT）檢測各組小鼠葡萄糖耐受能力術(shù)后6和12周，小鼠禁食不禁水，空腹12 h后檢測各組小鼠體質(zhì)量及空腹血糖水平，根據(jù)小鼠體質(zhì)量給予20%葡 萄 糖 溶 液（2 g·kg－1）腹腔注射，并開始計時。于注射后30、60、90和120 min分別檢測各組小鼠血糖水平，根據(jù)不同測量時間的血糖變化繪制曲線并計算曲線下面積（area under curve，AUC），檢測各組小鼠葡萄糖耐受力。GTT實驗完成后恢復(fù)小鼠飲食。

1.4 胰島素耐量試驗（insulin tolerance test，ITT）檢測各組小鼠胰島素敏感性術(shù)后6和12周，小鼠禁食不禁水，空腹4～6 h后檢測各組小鼠體質(zhì)量及空腹血糖水平，0.75 U·kg－1胰島素溶液腹腔注射，并開始計時。于注射胰島素后15、30、45和60 min檢測各組小鼠血糖水平，根據(jù)不同測量時間的血糖變化繪制曲線并計算AUC，檢測各組小鼠胰島素敏感性。ITT實驗完成后恢復(fù)小鼠飲食。

1.5 計算各組小鼠肝臟系數(shù)和脂肪系數(shù)稱取小鼠體質(zhì)量、解剖后小鼠肝臟和脂肪濕質(zhì)量，計算各組小鼠肝臟系數(shù)和脂肪系數(shù)。肝臟系數(shù)=肝臟質(zhì)量/體質(zhì)量×100%，脂肪系數(shù)=脂肪質(zhì)量/體質(zhì)量×100%。

1.6 病理學(xué)染色觀察各組小鼠肝臟和性腺脂肪組織病理形態(tài)表現(xiàn)組織固定于10%甲醛溶液，48 h后取出部分固定組織，修剪后置于組織包埋盒中脫水、包埋。石蠟切片機切片，HE染色或糖原染色后，顯微鏡下觀察并拍照。取部分固定的肝臟組織，修剪后置于30%蔗糖中脫水24 h，置入冷凍包埋劑中，液氮緩凍。采用冰凍切片機于－16℃下切片，油紅O染色后顯微鏡下觀察并拍照。

1.7 RT-qPCR法檢測各組小鼠性腺脂肪組織中脂質(zhì)分解相關(guān)基因mRNA表達水平性腺脂肪組織剪碎后加入TRIzol試劑提取總RNA，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲取cDNA后將其作為模板進行RT-qPCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件依據(jù)試劑盒說明書。以GAPDH為內(nèi)參基因，采用2－△△Ct法計算脂質(zhì)分解相關(guān)基因mRNA表達水平。PCR引物序列：脂肪甘油三酯脂肪酶（adipose triacylglyceride lipase，Atgl），正 向 引 物5′-GCTGTGGAATGAGGACATAGGA-3′，反 向 引 物5′-GCATAGTGAGTGGCTGGTGAA-3′；HSL正 向 引 物5′-TGTGTCAGTGCCTATTCAG-3′，反 向 引 物5′-GAACAGCGAAGTGTCTCT-3′；GAPDH，正 向 引 物5′-GGGCTGGCATTGCTCTCAATG-3′，反 向 引 物5′-CATGTAGGCCATGAGGTCCAC-3′。

1.8 Western blotting法檢測各組小鼠性腺脂肪組織中HSL蛋白表達水平取性腺脂肪組織剪碎加入蛋白裂解液裂解，勻漿后離心提取總蛋白，BCA試劑盒檢測蛋白濃度，調(diào)整上樣量使各組濃度一致，SDS-PAGE電泳后濕轉(zhuǎn)，將蛋白全部轉(zhuǎn)移至NC膜上。5%脫脂奶粉封閉后加入蛋白一抗（GAPDH或HSL）4℃孵育過夜，TBST漂洗后室溫孵育二抗2 h，TBST漂洗后ECL試劑顯色并拍照。采用Image J軟件分析目的蛋白HSL和內(nèi)參GAPDH蛋白條帶灰度值，計算目的蛋白表達水平。目的蛋白表達水平=目的蛋白條帶灰度值/GAPDH蛋白條帶灰度值。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析采用Graphpad prism8.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。各組小鼠的體質(zhì)量、血糖水平、肝臟質(zhì)量、肝臟系數(shù)和和脂肪系數(shù)，性腺脂肪組織中Atgl、HSL mRNA及HSL蛋白表達水平均符合正態(tài)分布，以xˉ±s表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠體質(zhì)量和血糖水平術(shù)后小鼠體質(zhì)量檢測結(jié)果顯示：與WT組比較，WT OVX組小鼠體質(zhì)量增加，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），MKR組小鼠體質(zhì)量明顯降低（P＜0.05）；與MKR組比較，MKR OVX組小鼠體 質(zhì) 量 明 顯 增加（P＜0.05），但 與WT和WT OVX組比較，MKR OVX組小鼠體質(zhì)量明顯降低（P＜0.05）。術(shù)后空腹血糖監(jiān)測結(jié)果顯示：OVX術(shù)后6周，各組小鼠空腹血糖無明顯變化；術(shù)后12周，WT OVX組和MKR OVX組小鼠空腹血糖水平逐漸升高，與MKR組比較，MKR OVX組小鼠空腹血糖水平明顯升高（P＜0.05）。術(shù)后隨機血糖監(jiān)測結(jié)果顯示：與WT和WT OVX組比較，MKR OVX組小鼠隨機血糖水平升高（P＜0.05）。見圖1。

圖1 各組小鼠的體質(zhì)量（A）、空腹血糖水平（B）和隨機血糖水平（C）Fig.1 Body weights(A),levels of fasting blood glucose(B)and levels of random blood glucose(C)of mice in various groups

2.2 各組小鼠葡萄糖耐受力和胰島素敏感性與WT組比較，WT OVX組小鼠葡萄糖耐受力和胰島素敏感性降低（P＜0.05）；與WT組比較，MKR組小鼠本身存在胰島素抵抗，其葡萄糖耐受力和胰島素敏感性均明顯降低（P＜0.05）。與MKR比較，MKR OVX組葡萄糖耐受力和胰島素敏感性降低（P＜0.05），并隨術(shù)后飼養(yǎng)時間延長不斷惡化，術(shù)后12周出現(xiàn)嚴重的葡萄糖不耐受和胰島素抵抗。見圖2和3。

圖2 各組小鼠葡萄糖耐受力指標(biāo)Fig.2 Indicators of glucose tolerance of mice in various groups

圖3 各組小鼠胰島素敏感性指標(biāo)Fig.3 Indicators of insulin sensitivity of mice in various groups

2.3 各組小鼠肝臟質(zhì)量、肝臟系數(shù)和肝組織病理形態(tài)表現(xiàn)各組小鼠肝臟濕質(zhì)量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與WT組 和WT OVX組 比 較，MKR和MKR OVX組小鼠肝系數(shù)明顯升高（P＜0.05），見表1。HE染色結(jié)果顯示：與WT組小鼠比較，WT OVX組小鼠肝組織中肝細胞排列松散，部分區(qū)域出現(xiàn)輕度脂肪變性；MKR組小鼠肝臟有輕度脂質(zhì)沉積；MKR OVX組小鼠肝組織中肝脂肪變程度較高，有明顯的脂滴空泡。油紅O染色與HE染色結(jié)果一致，與WT組比較，WT OVX和MKR OVX組小鼠肝組織中有更多的脂質(zhì)成分著色。糖原染色結(jié)果顯示：與WT組比較，WT OVX組小鼠肝糖原減少，MKR組小鼠肝糖原無明顯變化，MKR OVX組小鼠肝糖原進一步減少。見圖4。

圖4 各組小鼠肝組織病理形態(tài)表現(xiàn)（×200）Fig.4 Pathomorphology of liver tissue of mice in various groups（×200）

2.4 各組小鼠脂肪系數(shù)和性腺脂肪組織病理形態(tài)表現(xiàn)與WT組比較，WT OVX組小鼠棕色脂肪、皮下脂肪和腎周脂肪系數(shù)升高但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），性腺脂肪和腸系膜脂肪系數(shù)明顯升高（P＜0.05）。與MKR組比較，MKR OVX組小鼠棕色脂肪和腸系膜脂肪系數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），皮下脂肪、性腺脂肪和腎周脂肪系數(shù)明顯升高（P＜0.05）。見表1。

表1 各組小鼠肝臟質(zhì)量、肝臟系數(shù)和脂肪系數(shù)Tab.1 Liver weight,liver index and fat index of mice in various groups （n=10,x±s,η/%）

選擇WT OVX組和MKR OVX組病理形態(tài)表現(xiàn)均有明顯改變的性腺脂肪觀察其形態(tài)表現(xiàn)。HE染色結(jié)果顯示：與WT組比較，MKR組小鼠脂肪細胞明顯縮??；WT OVX組和MKR OVX組小鼠脂肪細胞均增大，但與WT和WT OVX組比較，MKR OVX組小鼠脂肪細胞仍明顯縮小。見圖5。

圖5 各組小鼠性腺脂肪組織病理形態(tài)表現(xiàn)（HE,×200）Fig.5 Pathomorphology of gonadal adipose tissue of mice in various groups（HE,×200）

2.5 各組小鼠性腺脂肪組織中Atgl和HSL mRNA表達水平RT-qPCR檢測結(jié)果顯示：與WT組比較，WT OVX組小鼠性腺脂肪組織中Atgl mRNA表達水平明顯降低（P＜0.05），MKR組小鼠性腺脂肪組織中HSL mRNA表達水平明顯升高（P＜0.05）；與MKR組比較，MKR OVX組小鼠性腺脂肪組織中Atgl和HSL mRNA表達水平明顯降低（P＜0.05）。見圖6。

圖6 各組小鼠性腺脂肪組織中Atgl和HSL mRNA表達水平Fig.6 Expression levels of Atgl and HSL mRNA in gonadal adipose tissue of mice in various groups

2.6 各組小鼠性腺脂肪組織中HSL蛋白表達水平Western blotting檢測結(jié)果顯示：與WT組比較，WT OVX組小鼠性腺脂肪組織中HSL蛋白表達 水平明顯降低（P＜0.05），MKR組小鼠性腺脂肪組織中HSL蛋白表達水平明顯升高（P＜0.05）；與MKR組比較，MKR OVX組小鼠性腺脂肪組織中HSL蛋白表達水平降低（P＜0.05）。見圖7。

圖7 各組小鼠性腺脂肪組織中HSL蛋白表達電泳圖（A）和直條圖（B）Fig.7 Electrophoregram(A)and histogram(B)of expression of HSL protein in gonadal adipose tissue of mice in various groups

3 討 論

雌激素作為重要的內(nèi)分泌激素廣泛作用于全身靶器官，不僅調(diào)控性腺發(fā)育和生殖系統(tǒng)功能，同時還在機體糖脂代謝穩(wěn)態(tài)調(diào)控中發(fā)揮重要作用［14-15］。胰島素是調(diào)節(jié)機體代謝過程的重要激素之一，是唯一可以促進細胞對葡萄糖的攝取和利用，并通過促進糖原合成抑制糖異生而降低血糖的激素；同時胰島素還可以促進脂質(zhì)合成，抑制脂肪分解。外周器官（如肝臟、脂肪和肌肉組織等）對胰島素響應(yīng)減弱則導(dǎo)致胰島素抵抗發(fā)生，是促使2型糖尿病、肥胖和非酒精性脂肪肝等疾病發(fā)生的重要危險因素［16］。而雌激素信號通路和胰島素信號通路在絕經(jīng)后女性糖脂代謝紊亂調(diào)控及相關(guān)疾病發(fā)生發(fā)展過程中的關(guān)聯(lián)影響尚未完全闡明。

雌激素治療可逆轉(zhuǎn)高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠產(chǎn)生胰島素抵抗和葡萄糖耐受不良［17］。MKR雌性小鼠自身存在胰島素抵抗和高胰島素血癥，是研究雌激素和內(nèi)源胰島素水平調(diào)控機體糖脂代謝穩(wěn)態(tài)的理想模型［13］。本研究結(jié)果顯示：MKR小鼠卵巢切除后，空腹血糖和隨機血糖水平均明顯升高，胰島素敏感性降低，而卵巢切除對WT小鼠血糖水平影響較小，其胰島素敏感性略有降低，提示在胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下，雌激素缺失更易導(dǎo)致糖尿病的發(fā)生。

肝臟和脂肪組織在機體胰島素敏感性和糖脂代謝穩(wěn)態(tài)調(diào)控中發(fā)揮重要作用。研究［18］顯示：絕經(jīng)后女性更易患脂肪肝。雌激素抑制劑他莫西芬可誘導(dǎo)小鼠肝脂肪變性，而臨床上使用他莫西芬的主要副作用之一為患者產(chǎn)生非酒精性脂肪肝［19］。此外，長期服用雌二醇可降低ob/ob小鼠肝臟脂質(zhì)合成并改善胰島素敏感性［20］。本研究結(jié)果顯示：卵巢切除后，小鼠肝臟脂質(zhì)沉積增加，MKR OVX組小鼠肝臟中出現(xiàn)大量的脂滴空泡，肝糖原水平降低，表明雌激素缺失會加重高胰島素血癥小鼠的肝脂肪變性和肝糖轉(zhuǎn)運。

脂肪組織是人體重要的代謝器官，不僅是機體的能量倉庫，而且作為循環(huán)中多種激素（如生長激素和胰島素等）及代謝物（如葡萄糖等）的靶器官，在機體糖脂代謝穩(wěn)態(tài)調(diào)控中發(fā)揮重要作用［21］。雌激素受體α在脂肪組織中表達并控制雌激素活性，當(dāng)雌激素或雌激素受體α缺失時，會導(dǎo)致脂質(zhì)水平升高、肥胖和胰島素抵抗［22］。卵巢切除或女性絕經(jīng)造成雌激素水平降低，均可導(dǎo)致體質(zhì)量增加和脂肪積聚［23-24］，與本研究結(jié)果一致。研究［25-26］顯示：絕經(jīng)期女性脂肪組織分布發(fā)生改變，主要表現(xiàn)為腹部脂肪積聚。本研究結(jié)果證實：卵巢切除可通過下調(diào)脂質(zhì)分解相關(guān)基因mRNA和蛋白表達水平導(dǎo)致小鼠性腺脂肪、腎周脂肪和腸系膜脂肪等腹部內(nèi)臟脂肪明顯增加。既往研究常采用高糖高脂飲食誘導(dǎo)小鼠胰島素抵抗并結(jié)合卵巢切除研究雌激素對糖脂代謝的影響，而MKR雌鼠是非肥胖人源化胰島素抵抗小鼠模型，利用MKR小鼠進行雌激素調(diào)控脂代謝的相關(guān)研究，排除肥胖本身對脂肪產(chǎn)生的影響，使結(jié)果更具參考性。

綜上所述，本研究利用胰島素抵抗和高胰島素血癥的MKR小鼠模型，進一步探究內(nèi)源性胰島素及雌激素在機體糖脂代謝過程中的相互影響，為女性患者因雌激素缺失而可能產(chǎn)生代謝綜合征的臨床診斷及預(yù)防提供依據(jù)。